私たちがここで開発した方法は、腸からのホルモンの分泌の分子メカニズムだけでなく、栄養素の吸収、および両者の間の結合を調べようと、私たちの仕事に非常に有用であることが判明しました。この高度な生理学的技術の主な利点は、腸がその時に放置されている一方で、通常はIn Vitroモデル内でのみ行われる詳細な研究を可能にすることです。まず、加熱された手術台の上にラットを置き、つまみつまみつまみへの応答の欠如を確認し、腹腔を露出させるために皮膚および腹膜切除を行う。
小腸を横に移動し、結腸の末端領域を露出させる。そして、結腸に供給血管系をリゲートします。徐々に結腸を抽出し、末端領域から始めて、小腸に向かって移動し、組織を等張生理食塩水で水分補給し、必要に応じて綿棒を使用して結合組織を除去する。
結腸のすべてを取り除いたら、小腸管腔の近位端に15センチメートルのプラスチックチューブを挿入し、縫合糸でチューブを固定します。その後、10ミリリットルのシリンジと注射器ポンプを使用して、毎分25ミリリットルの流量で室温同位塩水で小腸を慎重に洗い流します。組織がチャイムを空にしたら、上部腸間膜動脈がアクセス可能になるように組織を調整し、結合組織と脂肪組織を取り除いて動脈を露出させる。
細かい点鉗子を使用して、腸間膜動脈の下に2つの縫合線を配置し、門脈の下に2つの縫合線を配置します。ローリングポンプに取り付けられたプラスチック製の22ゲージカテーテルに灌流バッファーを充填し、外科用ハサミを使用して腸間膜動脈の小さな穴を切断し、すぐに切開部にカテーテルを挿入します。動脈に穴を開けてから2分以内にカテーテルを挿入し、そうでなければ腸が虚血性損傷を受ける可能性が高い。
カテーテルが縫合糸で固定されるとすぐに、ローリングポンプを開始して毎分7.5ミリリットルの流量で灌流を開始します。腸管と門脈の血管が青白くなったら、門脈に穴を開ける。金属カテーテルを挿入し、別の縫合糸で金属カテーテルを固定します。
静脈は薄い壁に付いてきたので、カテーテルを門脈に挿入する際には注意してください。しかし、ガードが浸透しているので、迅速な挿入は重要ではありません。1分間の灌流出力を収集した後、ボリュームを測定し、負荷記録プログラムで実験を実行をクリックして、灌流圧取得記録を開始します。
その後、湿らせたラボ組織で腸を覆い、乾燥を防いで、腸の遠位端が塞がれていないことを確認し、明るいハプロイドが出ることができます。酸素と二酸化炭素の分圧を測定するには、臓器に入る直前、約3分間の灌流の後、そして門脈に挿入されたカテーテルから、3方向の停止コックバルブを介して灌流バッファーを収集します。サンプルを氷の上に置き、自動血液ガス分析装置を使用して、採取後すぐにサンプルを測定します。
分数コレクターを使用して、最初のベースラインサンプルを取得します。ベースライン収集の10〜15分後、シリンジポンプを使用して、毎分35ミリリットルの流量で3ウェイストップコックを介して最初の動脈内試験覚醒剤を投与する。刺激の最初の5分間に毎分2.5ミリリットルの流量で送達された初期刺激ボア注射によって、光刺激を行い、続いてテスト溶液を毎分5ミリリットルの流量で投与する。
発光刺激期間が過ぎるとすぐに、イソトニック生理食塩水で内腔を毎分2.5ミリリットルの流量で5分間洗い流します。次に、次の試験物質が投与される前に、15〜30分間毎分5ミリリットルのベースラインサンプルを収集します。実験終了時に、5~10分間の調製物の応答性を試験するための適切で陽性の制御を投与し、陽性対照刺激期間の終了時にベースラインサンプルを10〜15分収集し、さらに10~15分追加する。
ここでは、良好な品質データの一例を示し、グルカゴン様ペプチド−1またはGLP-1を示し、1分間隔で採取した単離されたパーフューズドラット小腸からの分泌を示す。基礎条件下では、試験刺激と陽性制御の投与前後の両方で分泌が安定していたが、強固な分泌反応が明らかであった。これらのGLP-1分泌データは、単離されたパーフュードラット小腸から得られた、試験物質投与または陽性対照とは無関係であるように試験を通して上方に漂った基礎条件で測定された不安定な分泌物を有する質が悪い。
したがって、血管フルクトース刺激の終了時に観察されたGLP-1分泌の増加がフルクトース媒介応答であったかどうかを結論付けることは不可能である。カテーテルを適切に固定し、灌流緩衝液として灌流装置を徹底的に洗浄するために、この手順を試みている間、細菌の増殖のための優れた媒体を提供する。この手順に従って、腸管細胞培養のホルモン分泌細胞株に関するIn Vitro研究のような他の方法は、環状AMPまたは細胞内カルシウムの細胞内産生を直接調査するために行うことができる。
だから我々はすでに栄養素の吸収とホルモンの分泌のメカニズムの背後にあるプロセスの数の解明のために今この方法を使用しており、それは非常に有用であることが判明しました。分子部位のブロッカーやアクチベーターを使用することは非常に危険であり、ラボコート、手袋、安全メガネの使用などの予防措置は、この手順を実行している間は常にヒュームフードを取るべきであることを忘れないでください。
