El método que hemos desarrollado aquí ha resultado ser extremadamente útil en nuestro trabajo, tratando de averiguar los mecanismos moleculares de la secreción de hormonas del intestino, pero también la absorción de nutrientes, y el acoplamiento entre los dos. La principal ventaja de esta técnica altamente fisiológica es que el intestino se deja in situ, mientras que permite estudios detallados que generalmente sólo se realizan dentro de los modelos In Vitro. Primero coloque la rata en una mesa de operaciones calentada, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del final, y haga una escisión de la piel y el peritoneal para exponer la cavidad abdominal.
Mueva el intestino delgado hacia un lado para exponer la región terminal del colon. Y ligar la vasculatura de suministro al colon. Extraje gradualmente el colon, comenzando de la región terminal, y moviéndose hacia el intestino delgado, hidratando el tejido con solución salina isotónica, y usando hisopos de algodón para eliminar el tejido conectivo según sea necesario.
Cuando se haya eliminado todo el colon, inserte una pieza de 15 centímetros de tubo de plástico en el extremo proximal del pequeño lumen intestinal, y asegure el tubo con suturas. A continuación, utilice una jeringa de 10 mililitros y una bomba de jeringa para lavar cuidadosamente el intestino delgado con solución salina isotónica a temperatura ambiente a un caudal de 25 mililitros por minuto. Cuando el tejido haya sido vaciado de quimo, ajuste los tejidos de modo que la arteria mesentérica superior sea accesible y retire el tejido conectivo y el tejido graso para exponer la arteria.
Use fórceps de punto fino para colocar dos suturas debajo de la arteria mesentérica y dos suturas debajo de la vena porta. Llene un catéter de plástico de calibre 22 unido a una bomba rodante con tampón de perfusión y utilice un par de tijeras quirúrgicas para cortar un pequeño agujero en la arteria mesentérica, insertando inmediatamente el catéter en la incisión. Inserte el catéter dentro de los dos minutos de cortar un agujero en la arteria, de lo contrario el intestino probablemente sufrirá de daño isquémico.
Tan pronto como el catéter se haya asegurado con una sutura, inicie la bomba de rodadura para iniciar la perfusión a un caudal de 7,5 mililitros por minuto. Cuando los vasos sanguíneos en el intestino y la vena porta se vuelvan pálidos, corta un agujero en la vena porta. Inserte un catéter metálico y asegure el catéter metálico con otra sutura.
Tenga cuidado al insertar el catéter en la vena porta, ya que la vena está de paredes delgadas. Sin embargo, como la guardia se está perfundiendo, la inserción rápida no es crucial. Después de recoger la salida de perfusión durante un minuto, mida el volumen y haga clic en ejecutar experimento en el programa de grabación de presión para iniciar las grabaciones de adquisición de presión de perfusión.
Luego cubra el intestino con un tejido de laboratorio humedecido para evitar que se seque, y confirme que el extremo distal del intestino no está bloqueado, y puede salir un haploid luminoso. Para medir la presión parcial de oxígeno y dióxido de carbono, recoja el tampón de perfusión a través de una válvula de tope de tres vías inmediatamente antes de que entre en el órgano, después de aproximadamente tres minutos de perfusión, y desde el catéter insertado en la vena porta. Coloque las muestras sobre hielo y utilice un analizador automatizado de gases sanguíneos para medir las muestras poco después de la recolección.
Utilice un recopilador de fracciones para obtener las primeras muestras de línea base. Después de 10 a 15 minutos de la recolección basal, utilice una bomba de jeringa para administrar el primer estimulante de prueba intraarterial a través de un tope de tres vías a un caudal de 35 mililitros por minuto. Realizar estimulaciones luminales mediante una inyección inicial de boas de estimulación suministrada a un caudal de 2,5 mililitros por minuto durante los primeros cinco minutos de la estimulación, seguida de la administración de la solución de prueba a un caudal de 5 mililitros por minuto.
Tan pronto como termine un período de estimulación luminal, enjuague el lumen con solución salina isotónica a un caudal de 2,5 mililitros por minuto durante cinco minutos. A continuación, recoja muestras de línea base a 5 mililitros por minuto durante 15 a 30 minutos antes de administrar la siguiente sustancia de ensayo. Al final del experimento, administre un control positivo adecuado para comprobar la capacidad de respuesta de la preparación durante cinco a 10 minutos, recogiendo y adicionalmente de 10 a 15 minutos de muestras de línea base al final del período de estimulación de control positivo.
Aquí se muestra un ejemplo de datos de buena calidad, demostrando péptido-1 o GLP-1 similar a glucagón, secreción de un intestino delgado de rata perfundido aislado recogido en intervalos de un minuto. En condiciones basales, la secreción fue constante mientras que antes y después de la administración del estímulo de la prueba y el control positivo, una respuesta secretora robusta era evidente. Estos datos de secreción de GLP-1 obtenidos de un intestino delgado de rata perfundido aislado son de mala calidad con una secreción inestable medida en condiciones basales que se desvió hacia arriba a lo largo de las pruebas de una manera que parecía no estar relacionada con las administraciones de sustancias de ensayo o con el control positivo.
Por lo tanto, es imposible concluir si el aumento de la secreción de GLP-1 observada al final de la estimulación de la fructosa vascular fue una respuesta mediada por fructosa. Al intentar este procedimiento para cuidar los catéteres correctamente y para limpiar a fondo el equipo de perfusión como el tampón de perfusión proporciona un excelente medio para el crecimiento bacteriano. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como estudios in vitro sobre líneas celulares secretoras de hormonas de cultivos celulares intestinales primarios, para investigar directamente la producción intracelular de AMP cíclico o calcio intracelular.
Así que ya hemos utilizado el método ahora para la elucidación de una serie de procesos detrás de la absorción de nutrientes y el mecanismo de secreción de las hormonas y ha resultado ser extremadamente útil. No olvide que trabajar con bloqueadores o activadores de sitios moleculares puede ser extremadamente peligroso y precauciones como el uso de una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad, siempre se debe tomar una campana de humo mientras se realiza este procedimiento.
