この方法は、神経細胞移動のメカニズムなど、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、長期的に個々の細胞移動および集合的な細胞の移動を検出できることです。アルカリ性のリシス法により200ミリリットルの細菌培養液を単離した後、2つのプラスミドを混合し、各々の最終濃度がマイクロリットル当たり4マイクログラムとなる。
肥沃な鶏卵を摂氏38度で相対湿度70%で水平にインキュベートします。2日半後、18ゲージの針で20ミリリットルの注射器を使用して、卵の尖った側から5ミリリットルのアルブミンを排除します。穴をテープで密封します。
次に、湾曲したはさみを使用して卵殻の上部を切断し、直径2センチメートルの穴を開けます。実体顕微鏡下で、胚の発達段階を確認する。この大きな穴をテープで密封してください。
E5.5まで摂氏38度、相対湿度70%でインキュベーションを続けます。エレクトロポレーションの前に、0.5マイクロリットルの速緑色で着色された上記プラスミドDNAの10マイクロリットルを調製する。また、ペニシリン1ミリリットルあたり100単位を含むオートクレーブPBSの10ミリリットル、ストレプトマイシンのミリリットル当たり100マイクログラムを調製する。
マイクロピペットプロセッサーを使用して、ガラスキャピラリーチューブから作られたマイクロピペットを準備します。マイクロピペットの遠位先端を、注入するDNAの量に適した孔サイズにカットします。はさみを使用して密閉された上部シェルを切り、直径2.5センチメートルの穴を開け直し、卵をステレオ顕微鏡の下に刺しておいてください。
卵に調製したPBS溶液の数滴を入金します。2つの細かい鉗子を使用して、胚を覆うアラントインス膜を剥がし、出血を起こさないように注意する。次に、胚の頭部から羊膜を取り除きます。
マイクロスパチュラで頭を回している間、吸引管に接続されたマイクロピペットを使用して、着色されたDNAの0.1と1マイクロリットルの間を左視テクタムの心室腔に注入する。一対の鉗子タイプの電極を、光学テクタムのターゲット領域の周りに置きます。パルス発生器を使用して、1ミリ秒のプレパルスを5ミリ秒間隔で1ミリ秒、その後のパルスは5ミリ秒で5ボルトの6ボルトの場合は10ミリ秒間隔で充電します。
結局のところ、テープで穴を密封し、摂氏38度と相対湿度70%でインキュベートを続けます。PBSで満たされたプラスチック皿に電極を浸し、歯間ブラシを使用してアルブミンを取り除きます。初期シェル切断から各卵のエレクトロポレーションまでのプロセスを繰り返します。
フラットマウント培養の前日には、10センチメートルの細胞培養皿に蒸留水にオートクレーブを加えることで、コード化された細胞培養インサートの準備を始めました。いくつかの細胞培養を水に浮かべる。1ミリリットルラミニンあたり8マイクログラム、1ミリリットルポリーLあたり80マイクログラムを含む溶液では、挿入物をカバーすることを確認する。
細胞培養二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートする。E7.0で培養した日に、ラミニンおよびポリl-リジン溶液を挿入から取り除いた。次に、1.1ミリリットルの培養培地を充填したガラス底皿に挿入物を移す。
37°Cで細胞培養二酸化炭素インキュベーターに皿を移します。40%酸素と5%の二酸化炭素のガス流と38°Cの温度と反転共焦点顕微鏡上の湿気の部屋単位を設定します。Insertで組織サンプルの準備を始めるには、鉗子を使用して胚の頭部を氷冷HBSSを含む6センチメートルの細胞培養皿につまみます。
2つの微細な鉗子を使用して、電気ポレートされた光学テクタムを分離します。そして、プラスチックドロッパーを使用して、黒いシリコンをベースにした凹ガラス皿に移し、氷冷HBSSで満たします。蛍光立体顕微鏡での標識の位置を確認します。
マイクロ外科用ナイフを用いて、テクタム内の組織の方向を指摘しながら、ラベルを取り囲むテクタル組織を切り取る。この後、プラスチックドロッパーを使用して、ラベル付き組織を挿入に移し、ピン側が挿入部に取り付けられます。所望の方向にテクタル組織を置き、余分なHBSSを取り除きます。
同じインサートを対象とした他の組織サンプルについても、組織調製プロセスを繰り返します。次に、逆焦点顕微鏡の前形のチャンバーに皿を置きます。反転共焦点顕微鏡を使用して、蛍光標識を確認し、顕微鏡分野に焦点を当てます。
レーザー共焦点ユニットを起動します。コンフォーカルスキャンをサンプリングして、フィールド内のx軸とy軸に沿って組織の方向と位置を調整します。次に、スキャンサイズを選択します。
z 軸に沿った共焦点スキャンの間隔と合計範囲を決定します。100マイクロメートルの範囲のための5または10マイクロメートルの間隔を取る。共焦点イメージングの時間間隔と総イメージング時間を選択します。
コンフォーカル実行プログラムのパラメータを設定した後、イメージングを開始します。イメージングが完了したら、異なるC軸の共焦点画像を組み合わせて、Zスタック画像を生成し、各時点で最終的な焦点調整を行います。次に、さまざまなタイムポイントでZスタック画像を追加して、タイムラプスムービーを構築します。
本研究では、Ovoのエレクトロポレーション、平台細胞培養、およびタイムラプス共焦点イメージングを介して表面層で細胞移動が検出される。なお、接線移動細胞と視体の表面層の核は、記録の発症後0時間、9時間、18時間、27時間が経過した。28時間50分間隔で10分間隔のタイムラプスムービーは、遊動細胞とその核の質量移動を示す。
マージされたムービーは、移動する細胞の質量移動を明確に示しています。細胞移動の方向性は、標識された中心から全方向への分散セルに焦点を合わせ、調べることができます。核の動きの明確なイメージは、粒子追跡プラグインを使用して核移動の自動追跡を可能にする。
接線移動の軌跡の時間変化を視覚化し、分散移動が全方向性であることを証明することができる。より高い倍率画像は5分間隔で撮影することができます。先行プロセス、トレーリングプロセス、および核の逐次形態変化を伴う個々の細胞挙動を調査する。
この手順に従って、照明操作のラベル付けを実行できます。Aksumガイダンスのメカニズムのような追加の質問に答えるために。
