目の形態形成に関する我々の理解は、以前の固定組織研究から来ている。しかし、これらの研究は細胞および組織のダイナミクスを欠いていた。タイムラプスイメージングを使用して、可視化と分析のためにこのプロセス全体をキャプチャすることができます。
生画像化を容易にするゼブラフィッシュ胚の光学的明瞭化における外部開発を利用し、ほとんどの研究キャンパスで容易に入手可能なレーザー走査共焦点顕微鏡を用いる。この方法を新しく作成する研究者は、使用できるデータセットを取得する前に、試行錯誤を期待する必要があります。多くのステップ, 特に注射や埋め込み, 成功のためにうまくいく必要がありますので、忍耐を持っています.
ゼブラフィッシュが繁殖し始めると、卵が受精することを確実にするために15〜20分待っている間に、P10ピペットとP10マイクロリットルの先端を使用して、引っ張られたガラス毛細管マイクロ注入針を2.5〜5マイクロリットルのRNA希釈でバックロードします。卵の準備ができたら、移送ピペットと解剖顕微鏡を使用して卵を慎重に射出型にロードし、鉗子を使用して胚を転がして必要に応じて単一の細胞が見えるようにします。次に、1細胞段階ですべての胚を注入し、卵黄ではなく細胞を標的にして、現像胚の均一な標識を確保する。
受精後約11時間で、42°Cの熱ブロックにE3培地中の1.6%低融解アガロースの1〜5ミリリットルのアリコートを置き、蛍光顕微鏡を使用して、蛍光の全体的な明るさを持つ胚をスクリーニングします。胚を適切にステージングするためにスマイトを数えます。受精後11時間で、3つのスマイトが観察されるべきである。
理想的なサンプルは、強力なEGFPとmCherry信号を有し、正しい発達段階にある。取り付ける前に、寒天コーティングされた皿に胚を入れ、鉗子を使用して各胚から絨毛を取り除きます。すべての胚が脱裸になったら、ガラスローラーピペットを使用して1つの胚を吸引する。
胚がガラスパスツールピペットの先端に座り、胚を熱ブロックからアガロースのチューブに落とすように、できるだけ多くのE3を排出します。胚がピペットの先端に残っていることを注意して、胚が胚と一緒に少量のアガロースを吸引する前に、胚を数秒間アガロースに沈ませます。胚とアガロースをガラス底皿のアガロース液滴に排出し、アガロース液滴が硬化する前に、迅速に、しかし慎重に鉗子を使用して胚の後側を下に向けます。
同じ方法で10〜12個の胚を取り付けた後、単一のアガロースディスク内のすべての液滴を包む皿の底を完全に覆うのに十分なアガロースを加える。アガロースが硬化すると、アガロース上の層E3がサンプルを水分補給し続ける。レーザー走査共焦点顕微鏡をタイムラプスイメージングの適切なパラメータに設定した後、ガラス底皿の下側に水の屈折率に一致する浸漬媒体を自由にコーティングし、気泡を避けるように気を付け、40X水目的に少量の浸漬媒体を適用します。
ステージインサートでガラス底皿を固定し、胚を一晩湿らせたままにするためにE3培地を追加します。モデリングクレイを使用して、プラスチック製の蓋を皿の上に密封し、皿と接触する目的を上げます。顕微鏡ソフトウェアの位置見出しの下で、クリックして追加をクリックして、タイムラプスされる最初のサンプルのXYZ情報を保存し、強い蛍光と最適な取り付けでサンプルを選択します。
[検索] タブで、次のサンプルを検索し、[位置] をクリックしてサンプルを選択します ( を参照) します。すべてのサンプルを選択したら、最初の位置をハイライト表示して[移動]をクリックします。連続的にスキャンしながら、フレーム内の視小胞を並べ、視小胞と脳に対して前および遠位領域に十分なスペースを残します。
最初と最後のZスライスを割り当てるには、最初にセットを選択し、細かいフォーカスノブでZ方向を移動しながら最後に設定し、光学カップの成長に対応するために約63の総スライス数を維持します。成長のための部屋を可能にするために、視小胞の腹側に余分な部屋を含める。最初と最後の Z スライスを設定したら、C をクリックして Z スタックの中心に移動し、両方のレーザーのレーザーパワーとゲインを調整します。
レーザーのパワーとゲインが設定されたら、スキャンを停止し、[更新]をクリックして位置情報を更新します。次の位置に移動するには、2 桁の位置をクリックします。最初と最後の Z スライスの両方を定義したら、時系列の見出しを開き、サイクル数を 300 に、時間間隔を 2.5 分に設定します。
設定を確認してすべてが確定したことを確認したら、[開始] をクリックしてタイムラプスを開始し、最初の一回のイメージングが正しくキャプチャされていることを確認してから、タイムラプスを一晩実行できるようにします。単一細胞への直接注入は、均一な標識および強い蛍光のために必要である。アガロースに浸漬すると、胚は皿全体に均等に配置されるべきです。
胚が正しくステージングされ、十分に蛍光性があり、十分に取り付けられている場合、それらはタイムラプス中にイメージングフレームに残り、臓器全体を画像化することができます。水平または対角線のような、後軸に沿って向いていないサンプルは、タイムラプスが進むにつれてイメージングフレームから成長し、それ以上の分析には使用できません。過剰に回転した胚は、より後回しになります。
回転が少ない胚は、最も前部組織のみを観察することを可能にする。さらに、フレームの向きに関して取り付けられたサンプルは、タイムラプスを成功に導く可能性が高くなります。腹側に対するこのバイアスは、最適なタイムラプスをもたらす腹側方向の組織成長のための余分なスペースを提供する。
これらの基準が満たされない場合、タイムラプスは組織の3Dボリューム全体をキャプチャしなくなり、それ以上の分析に使用できなくなります。これらの情報が豊富なデータセットは、細胞速度と軌道の定量化による4D細胞追跡、細胞および組織の体積測定、3Dおよび4Dビジュアライゼーションなど、さまざまな方法で分析できます。
