Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синтеза пептидов, такие как синтез богатых дисульфидом пептидов и определение их соответствующего дисульфидного моста. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет селективного синтеза различных дисульфидных связующихся пептидных изомеров и их последующей химической и структурной характеристики. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что каждый дисульфид богатых пептид ведет себя по-разному.
Синтез и анализ, возможно, придется частично оптимизировать для отдельных пептида или белка. Перенесите реагенты, перечисленные в текстовом протоколе, на соответствующие сосуды и поместите их в соответствующие ракетки твердого фазового пептидного синтезатора. Затем добавьте 100 миллиграммов сухой смолы в реакционной колонке и положите их в ракетку синтезатора.
Начните синтез пептида твердой фазы, как описано в текстовом протоколе. После завершения синтеза лиофилизировал смолу на ночь. Теперь вылепить пептид из смолы и выполнять глубокую защиту боковых цепей.
Для этого смешайте высушенную смолу в 12 миллилитровой трубке и охладите ее до нуля градусов по Цельсию на льду. Сначала добавьте 150 микролитров смеси мусорщика, затем добавьте один миллилитр 95%трифтороацетической кислоты на 100 миллиграммов смолы. Оставьте смесь нежно встряхивая в течение трех часов при комнатной температуре.
Теперь, фильтровать смесь через стеклянный фрит. Соберите фильтрат в трубках, индивидуально наполненных ледяным дитил эфиром на один миллилитр смеси расщепления на 8-10 миллилитров дителилового эфира. Пептид осаждается как белое твердое тело.
После полоскания и центрифугирования труб, как описано в текстовом протоколе, заморозить-высушить пептиды. Для очистки линейного прекурсора с полуперпаративной хроматографией добавьте около 70 миллиграммов сырого пептида в 15 миллилитровую трубку. Затем растворите сырой пептид в 0.1%TFA и один-к-одному Ацетонитрил в воду.
Отделяйте пептидную смесь, используя градиент от нуля до 50% Eluent B в течение 120 минут со скоростью потока 10 миллилитров в минуту. Соберите фракции в отдельных трубках по мере их появляются и подготовьв выбранные фракции для анализа масс-спектрометрии и HPLC, как описано в текстовом протоколе. Заморозить-высушить фракции и объединить одноранговые фракции.
Начните селективное образование дисульфидных связей, выполняя первое окисление. Для этого растворите 15 миллиграммов лиофилизированных линейных пептидов в 105 миллилитров изопропаноловой водяной смеси. Оставьте смесь перемешивания на воздухе в основных условиях в течение 12 до 48 часов.
Процедура окисления пошаговая очень критична. Контроль реакции принимаются во всех трех шагах окисления для обеспечения индивидуального образования диульфида. Третье окисление является наиболее важным, поскольку дисульфидный скремблирование может произойти, когда оптимальное время реакции превышено.
Теперь выполните второе окисление. Растворите 15 миллиграммов лиофилизированных пептидов в 105 миллилитров изопропаноловой воды, одной молярной смеси соляной кислоты. Добавьте в раствор 158 микролитров раствора молярного йода в метаноле 0,1.
Перемешайте реакцию при комнатной температуре до завершения окисления. Затем остановите реакцию, добавив в воду 79 микролитров одной молярной аскорбиновой кислоты. Наконец выполнить третье окисление.
Растворите 15 миллиграммов лиофилизированных пептидов в 5,5 миллилитров TFA, содержащих смесь мусорщика. Осадок пептида в трубки, содержащие холодный диэтил эфир на один миллилитр реакционной раствора на восемь-десять миллилитров диэтил эфира. Для выполнения пептидной очистки на 15 миллиграммов лиофилизированный сырой продукт в 15 миллилитров трубки.
Растворите сырой продукт в объеме цикла образца HPLC, используя смесь 0,1%TFA и один к одному Ацетонитрил в воду. После вихря до полного растворения, центрифуга раствор от одной минуты в 3400 раз G.Draw до 3,6 миллилитров смесь в 5 миллилитров шприц и вводить образец без каких-либо пузырьков воздуха в цикл инъекции. Начните инъекцию в систему HPLC.
Очистить пептидную смесь с помощью градиента от нуля до 50% Eluent B в течение 120 минут со скоростью потока 10 миллилитров в минуту. Соберите фракции в отдельных трубках, как они появляются. После завершения выполнения подготовьтесь к выбранным фракциям для анализа MS и HPLC, как описано в тексте.
Заморозить все фракции и хранить их при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для выполнения аналитических HPLC, передача образцов пептидных фракций или контроля реакции в флакон HPLC и растворить его в смеси 0,1%TFA в один к одному Ацетонитрил в воду. Поместите флакон HPLC в автоотборчик аналитической обратной фазы HPLC, установленный для впрыска 250 микролитров каждого образца.
Используйте систему градиентного элюциона 0,1%TFA в воде как Eluent A в 0.1%TFA в Acetonitrile как Eluent B.Analyze пептид, используя градиент от 10%до 40%Eluent B в течение 30 минут со скоростью потока 1,0 миллилитра в минуту. Для проведения анализа аминокислот перенесите 100 микрограммов чистого пептида в 1,5 миллилитровую микро центрифугу и растворите порошок в 200 микролитров шести молярных HCL. После переноса раствора в стеклянную ампулу, закройте ампулу, нагревая шею пламенем горелки бунсена.
Затем поместите стеклянную трубку, держащую ампулу в отопительном блоке в течение 24 часов при 110 градусах цельсия для гидролиза. Через 24 часа откройте ампулу и перенесите раствор в двухми миллилитровую микро-центрифугу. Центрифуга раствора в течение шести часов при шестидесяти градусах Цельсия и 210 раз G в вращательном вакуумном концентраторе.
Затем растворите гидролизованный продукт в 192 микролитерах пробованного буфера разбавления и перенесите раствор в микро центробежный фильтр. После центрифугирования образца в течение одной минуты при 2300 раз G, передача 100 микролитров фильтрата в аминокислотный анализ образца трубки. Поместите трубку в анализатор аминокислот и начните анализ.
В течение этого прошлого протокола сокращения, крайне важно принять несколько реакций контроля для того, чтобы получить в два или четыре раза каппа мидо метилированных видов, которые необходимы для последующего анализа дисульфида с помощью масс-спектрометрии. Сначала растворите 600 микрограммов чистого пептида в 1,2 миллилитров 0,05 молярного буфера цитрата, содержащего TCEP. Инкубировать смесь при комнатной температуре, принимая несколько 100 образцов контроля реакции микролитров в диапазоне от нуля до 30 минут.
Смешайте образцы в 1,5 миллилитр микро-центрифуг трубки с 300 микролитров алкиляционного буфера, чтобы остановить реакцию и выполнить карбонил метилирования свободных групп тиола. Остановите реакцию через пять минут, добавив 100 микролитров 10% TFA и воды и хранить образцы на сухом льду. Теперь выполните HPLC по образцам, описанным в текстовом протоколе.
Перенесите небольшое количество каждой собранной фракции в 1,5-миллилитровую микро-центрифугу для анализа окислимых форм MS/MS. Растворите оставшийся пептид в 0.1%TFA в воде и добавьте соответствующий объем в течение 100 миллимолярского раствора TCEP, чтобы получить окончательную концентрацию TCEP 10 миллимоляра. На этом этапе селективное алкиляция цистеин может быть проверена с помощью пептидного секвенирования.
С двумя пептидами в середине, определение дисульфидного моста картина возможна. NmR анализ различных изомеров проводится, чтобы выявить отдельные пептидные структуры. Показаны 20 структур с самыми низкими энергиями, а также дисульфидная связь различных изомеров.
Примечательно, что для однозначной идентификации дисульфидной связи требуется сочетание обратной фазы фрагментации HPLC MS/MS и анализа ЯМР. Сравнение среднего значения квадратного отклонения корня разъясняет, что жесткий пептид в основном приводит к лучшей разрешенной структуре ЯМР. Это видео должно дать вам пример, как избирательно синтезировать пептиды с желаемой дисульфидной схемой связи.
Он также показывает возможность проверить правильное соединение дисульфида с помощью тендерной масс-спектрометрии и получить трехмерную структуру с помощью спектроскопии ЯМР. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области пептидного синтеза, чтобы исследовать важность дисульфидных связей моделей для трехмерной структуры и, следовательно, активность таких пептидных изомеров. После этой процедуры, другие методы, такие как деятельность ASAS могут быть выполнены для того, чтобы получить представление о структуре деятельности отношений различных пептидных изомеров на конкретной биологической цели.
Хотя этот метод может дать представление о синтезе и анализе конотоксинов, он также может быть применен к другим пептидам и белкам дисульфидного моста, таким как фензены, богатые дисульфидными токсинами животных и другими множественными цистеинами, содержащими молекулы.
