ノボ ノルディスク基礎基本的な代謝研究センターは、ノボ ノルディスク財団から制限のない寄付によって部分的に資金を供給したコペンハーゲン大学で独立したセンターです。

1 制限酵素処理
<ol><li>病原位置 14258 人間のミトコンドリア dna を切る制限の酵素と全人間 DNA を扱うことによってミトコンドリア Dna をリニア化します。 注: マウス DNA を以下のように同一の条件の下で制限酵素 BglII を使用します。</li>
	<li>それぞれのサンプルがミトコンドリア Dna メチル化は、評価に 1 つ 0.2 mL 反応管を準備、(蛍光分析による定量化) 次ミックス: 3 μ g ゲノム DNA を追加の 15 μ L バッファー 3、3 μ L 病原とを 150 μ L の水</li>
	<li>37 ° C で 4 時間サーマルサイクラーにチューブを配置します。</li>
</ol>2. 重亜硫酸塩の変換
<ol><li>病原治療 DNA 亜硫酸水素ナトリウム29を他の場所で説明されているように変換します。</li>
	<li>各変換反応 20 μ L の容量で 200-500 ng 病原治療 DNA を使用します。DNA の回復は 50-70% であります。</li>
	<li>10 μ L の溶出バッファーの重亜硫酸塩の変換された DNA を溶出します。</li>
	<li>蛍光分析による単一座礁させた DNA を定量化します。</li>
	<li>省略可能: プロトコルの残りを進む前に-20 ° C で DNA を重亜硫酸塩の変換を格納します。長期保存用保存-80 ° C で DNA を重亜硫酸塩の変換</li>
</ol>3. 重亜硫酸塩の配列のプライマーの設計
<ol><li>オンライン ツール Methprimer30と BiSearch31,32を使用して重亜硫酸塩の配列のプライマーを設計します。 注: Methprimer と BiSearch を許可するゲノム配列のプライマー結合塩基配列を検索する、シトシン、チミン、後重亜硫酸塩の処置と同様に変換されます。</li>
	<li>最適な増幅用プライマーの CpG のジヌクレオチドを回避し、100-300 bp 間増幅サイズをデザインします。</li>
	<li>設計されたプライマーを関数 BiSearch のプライマー検索を使用してミトコンドリア DNA を特定を確認します。既に設計されていた重亜硫酸塩の変換プライマーを挿入、重亜硫酸塩ボックスをチェックして、参照ゲノムと PCR パラメーターを含めます。 注: 可能な PCR の製品の一覧が表示されます。</li>
	<li>上の 1-5 のプライマー シーケンスをコピーし、オリゴヌクレオチド合成用注文フォームに貼り付けます。 注: 人間のリスト、表 1に実験室で検証されているマウス mtDNA のプライマー シーケンスが表示されます。</li>
	<li>重亜硫酸塩を使用してテスト プライマー PCR 次 agarose のゲルの電気泳動のステップ 4 で説明したように変換。テストおよび個別にすべてのプライマー対を最適化し、正しい私アンプリコン サイズ agarose のゲルに表示されることを確認します。 注: 多重プライマーが必要な場合追加 1 つに複数のプライマー PCR の反作用が単一し、PCR の製品 agarose のゲルの電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動法、類似の製品を区別するなどより resolutive 法に可視化サイズ。</li>
</ol>4. 重亜硫酸塩 PCR およびゲルの抽出の変換
<ol><li>興味の地域を増幅するには、ホット スタート Taq ポリメラーゼを用いた PCR を実行します。ミックス 100 ng 変換 DNA、500 μ M と反感覚プライマー、1 μ L dNTP ミックス (各 dNTP の 10 μ M)、およびポリメラーゼ 7.5 U/総量が 50 μ L の反応で簡単に言えば、以下の条件で PCR を実行: 95 ° C で 5 分間 (60 秒 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 サイクル10 分 72 ° c.別々 にどちらかのプライマーを使用または多重化します。</li>
	<li>省略可能: プライマーを多重化、200 ng を使用変換 DNA および次のサイクリング条件: 5 分 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 サイクル10 分 72 ° c. 注: 温度はプライマーの溶ける温度に応じて異なる場合があります。</li>
	<li>100 ボルトで 2% アガロースゲル電気泳動のゲルに主題の PCR の製品。</li>
	<li>穏やかな紫外線の下でメスと PCR の製品を抽出し、マイクロ チューブに追加。Pcr は DNA の損傷を避けるために過剰な紫外線には公開されません。30 以上の露光時間を避ける s。</li>
	<li>3を前述のようにゲルの浄化を使用して PCR の製品を浄化します。</li>
	<li>4.5 の手順から精製した DNA の定量化法を使用して。ステップ 5 または-20 ° C でストアのサンプルに進みます</li>
</ol>5. ライブラリの準備をシーケンス処理重亜硫酸塩
<ol><li>重亜硫酸塩の変換された PCR の製品のライブラリの準備を実行します。 オプション: この段階で PCR の製品を多重化します。</li>
	<li>最後修復まで 100 を使用してを実行 PCR の製品の ng。0.2 mL チューブで 55.5 μ L PCR の製品に 3 μ L 終わり準備酵素と 6.5 μ L 終わり修復反応バッファー (10 倍) を追加します。孵化後 65 ° C で 30 分に 20 の ° C で 30 分間熱 cycler でチューブを置き、</li>
	<li>15 μ L ブラント/TA リガーゼ ミックス、2.5 μ L と終わり修理 DNA を混合することによりシーケンス アダプターを縛るアダプターと 1 μ L 結紮エンハンサー。使用して場合 < 入力として 100 ng の PCR の製品を希釈アダプター 10 倍。</li>
	<li>サーマルサイクラーにミックス (ステップ 5.3) を置き、20 ° C で 15 分間加温熱 cycler を一時停止し、ユーザー 3 μ l 添加チューブに酵素。ミックスし、サーマルサイクラーに戻って、チューブを置き、37 ° C で 15 分間加温</li>
	<li>サイズは、PCR の製品のサイズによって DNA にビーズの比を変化させた固体可逆的相固定 (スプリング) ビーズを使用してアダプター結紮 DNA を選択します。</li>
	<li>ステップ 5.4 と 55 μ L 再停止 SPRI ビーズからアダプター結紮 DNA に 13.5 μ L H2O を追加します。マグネット スタンドに 5 分と場所の管の室温で孵化させなさい。ソリューションが明確な上清を新しいチューブに転送し、ビーズを含むチューブを破棄します。 メモ: 上清に含まれるアダプター結紮 DNA と大きい不要なフラグメントは破棄されたビーズにバインドされます。</li>
	<li>ステップ 5.6 から上澄みを 25 μ L 再停止 SPRI ビーズを追加、ミックス、室温で 5 分間インキュベートします。マグネット スタンドにチューブを置き、解決策が明確なときに上澄みを廃棄します。 注: 破棄された上澄みの不要な DNA はアダプター結紮 DNA がビーズにバインドされているに対しに含まれています。</li>
	<li>チューブは、マグネット スタンドには、ビーズを洗浄する (新鮮な) 200 μ L 80% エタノールを追加します。孵化 30 s と削除および破棄上清。2 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。</li>
	<li>空気乾燥ビーズ チューブ中 5 分オープンふた付きのマグネット スタンドです。</li>
	<li>磁石からチューブを削除、23 μ L の溶出バッファーで DNA を溶出してミックスします。2 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>マグネット スタンドにチューブを置き、明確なソリューションでは、2 μ L 前 PCR 増幅 (ステップ 5.14) のための 96 ウェル PCR プレートに転送します。</li>
	<li>残り約 21 μ L を新しい 0.2 mL チューブ pcr (ステップ 5.17) に転送します。 注: するビーズは、次のステップの酵素反応を抑制することが、すべてのビーズを転送しないようにしてください。</li>
	<li>5.14 のステップまたは-20 ° C でストアのサンプルに進みます</li>
	<li>アダプター結紮 DNA を増幅するために必要なサイクルの数を推定する RT qPCR による事前 PCR 増幅を実行します。反応あたり 96 ウェル PCR で次プレート含む 2 μ L の DNA (ステップ 5.11) 追加: 0.4 μ L インデックス プライマー、0.4 μ L 普遍的な PCR プライマー、7.2 μ L H2O、10 μ L RT qPCR マスター ミックス。</li>
	<li>リアルタイム PCR マシンでプレートを置き、プレートを次の条件に対象: 30 98 ° c s (10 秒 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 サイクル5 分 65 ° C</li>
	<li>1 つの Ct 値の中古増幅 Rt-qpcr PCR の反作用のリニア フェーズの終了に対応する Ct 値を差し引くことによって各サンプルに必要な増幅サイクル数を推定します。</li>
	<li>混合することによってステップ 5.12 からアダプター結紮 DNA を増幅する: 21 μ L の DNA、25 μ L の PCR マスター ミックス、1 μ L インデックス プライマー、1 μ L の普遍的な PCR のプライマー、2 μ L H2o.熱 cycler で各サンプルを次の条件に対象: 30 98 ° c s (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C)<img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg">サイクルの [ステップ 5.16 から計算される Ct];5 分 65 ° C 注: はのみを可能にする多重サンプルあたり 1 つのインデックスのプライマーを使用してください。インデックスは、PCR の間に挿入されます。</li>
	<li>増幅された DNA SPRI ビーズを浄化し、22 μ L の溶出バッファーで溶出します。</li>
	<li>ゲル電気泳動法または代替法によるライブラリの品質を制御します。正しいライブラリ ピーク サイズ (PCR の製品のサイズおよびアダプター) を探します。</li>
	<li>塗抹標本によるライブラリ製品の平均塩基対サイズを予測: 高度なグローバル設定で塗抹標本分析の下で「テーブル」をダブルクリックします。100-1000 bp から地域を定義し、 [ok]をクリックします。地域の表で、[定義された領域が表示され、ライブラリの平均サイズ (bp) が計算されます。</li>
	<li>蛍光分析によるライブラリを定量化します。ステップ 6 または-20 ° C にてストア ライブラリに進みます</li>
</ol>6. 次世代シーケンシング
<ol><li>数式を使用してライブラリの nM 濃度を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>同じ nM 濃度など 2 nM にライブラリを希釈 (4 を選択する nM、2 nM、1 nM、または 0.5 nM ライブラリ濃度に応じて)。2 nM ライブラリのプールを達成するためにすべてのライブラリをプールします。</li>
	<li>変性し、シーケンス楽器ガイドに従ってライブラリを希釈します。一言で言えば: 2 nM プールを 0.2 N 水酸化ナトリウムを追加することによって変性し、5 分 Dilute 22 の最終希釈する変性のプールの室温で孵化させなさい。変性し、12:05 の最終希釈する市販コントロール ライブラリを希釈します。新しいチューブ 20 %12: 05 コントロール ライブラリと 22 プールを混ぜます。 注: 重亜硫酸塩の変換は、非常に低い複雑さを紹介します。20% コントロール ライブラリ スパイクより良い品質になります。</li>
	<li>ディープ シーケンス器具を使用して 150 bp ペアエンド シーケンスを実行します。</li>
</ol>7. 解析 - 見積もりのメチル化レベル
<ol><li>(ここで、sample1_R1.fastq.gz と sample1_R2.fastq.gz と呼ばれる) .fastq ファイルを生成、関心の全体のゲノムのビスマルクのインデックスを生成する (ここではbismarkIndexと呼ばれるフォルダー) しているのゲノム配列を fasta で利用可能に形式 (ここでいるという名前のフォルダー)。</li>
	<li>アダプターおよびプライマーによって導入された先入観を削除する読み取り前処理: Trim_galore33] ツールを使用します。前方および逆引きの両方の読み取りの 5' 末端からヌクレオチドの 2 つを削除します。 trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o--trim1 - ペア/sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz。</li>
	<li>ビスマルク34を使用して全体のゲノムにあらかじめ処理された読み取りを配置します。 ビスマルク - 蟻 - bam o/./bismarkIndex/-1./sample1_R1_val_1.fq.gz-2./sample1_R2_val_2.fq.gz。 注: 別アライナを使用する場合は、一意に配置することはできません読み取りが破棄されることを確認します。</li>
	<li>抽出読み取り M、ここでSamtools35を使用して染色体へのマッピング samtools ソート l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools インデックス sample1_sorted.bam samtools -u sample1_sorted.bam いるを表示 |samtools ソート-n-o BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>メチル化情報を抽出します。 bismark_methylation_extractor -p-CX ― cytosine_report ― ― 包括的な genome_folder./いる./sample1_chrM.bam</li>
	<li>さらなる分析のため、.bedGraph や、.cov CX_report.txt ファイルを使用します。Sample1_chrM.CX_report.txt ファイルを使用して、可視化とテストします。</li>
	<li>複数の領域を尋問し、プライマーのバイアスは、マッピング中に生成された M バイアス プロットで表示ことがある場合、前処理の段階でさらにクリッピングを実行します。詳細についてはビスマルクのマニュアルを参照してください。</li>
</ol>8. 解析 - 違いのテスト
<ol><li>CX_report.txt ファイルがすべて C M 染色体上の 7 列、染色体 (ここでいる)、位置、ストランド、メチル化された読み取りの数、非メチル化読み取り、C コンテキストおよび周囲のシーケンスの数含まれていることを確認します。</li>
	<li>CX_report は、そのままの状態でいるをカバーして、サブセットは増幅される領域をチェックしてください。</li>
	<li>個々 の c さんのフィッシャーの正確なテストまたは地域全体の符号テストなどのサンプル間の差は非パラメトリック テストを使用します。 注: 定量化頻繁に近くなります 0% メチル化、正規性の仮定が適切な理由であります。</li>
	<li>同様に、可視化、分位数を視覚化または二項割合の信頼区間を計算します。</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BiSearch+web+server.">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

著者は宣言する競合金融興味を持ってないです。

ここでは、ミトコンドリア Dna のメチル化を尋問するとりわけ設計されている重亜硫酸塩シーケンス プロトコルを提供します。重亜硫酸塩の配列使用プロトコルの DNA との違いは NUMT シーケンスから偽陽性発生して事前の制限の酵素の消化手順とバイオ情報解析の活用にあります。
ミトコンドリア Dna メチル化を調査するとき、重亜硫酸塩の配列のアーティファクトを除?...

ミトコンドリアのゲノムは約 16.5 キロ ベース (kb) の円形、二本鎖構造長い、重いと光の鎖を構成します。ミトコンドリアゲノムは母性継承、各セル内の複数のコピーに存在し、呼吸鎖複合体1の基本的なコンポーネントをエンコードします。同様に核ゲノムとは異なり、細菌のゲノムに、ミトコンドリアのゲノムは組織された多数の二次および第三構造などコイルとスーパーの構造2、アクセス困難なシーケンス処理中に表示することができます。実験3。
核内 DNA のメチル化、遺伝子発現の調節に特に多数のプロセスの役割を果たしている広範囲に研究エピジェネティックなマークです。哺乳類のゲノムの DNA のメチル化は deoxycytidines、主に CG ジヌクレオチド (CpG) のピリミジン環の 5 の位置に主に発生します。シトシンのメチル化は、DNA 塩基4体細胞と合計の ~ 1% のゲノムのすべての CpG の 70% で発見されます。DNA メチル化はまた公認会計士、CpT、クリック単価などの非 CpG のコンテキストに記載されているし、胚性幹細胞5,6,7ですべてのメチル化シトシンの 25% までの値と、核の DNA にさまざまな量で存在します。
核ゲノムのシトシンのメチル化は、広く、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の存在はまだ論争を呼びます。最初研究調査ミトコンドリア Dna メチル化は、核の DNA8と比較して低いレベルで培養細胞でミトコンドリア Dna のメチル化が検出されたで行われました。人間とマウスの細胞でミトコンドリア Dna のメチル化は低レベル (2-5%) も検出されました。メチル化 DNA 免疫沈降 (MeDIP) を定量的 PCR によって続いたなど 5 メチルシトシン キャプチャに頼るの試金を使用して、ミトコンドリア Dna メチル化様々 なマウスと人間にも認められた、細胞ライン9,10, 11,12。5-メチルシトシン ELISA の試金の質量に対する抗体を用いて、DNA のメチル化の実質的なレベルが検出された精製ミトコンドリア分画13,14,15,16します。 ただし、前述の調査の試金のほとんどは DNA メチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供するために設計されていない技術を使用します。
非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA コンテキスト17を変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用する「重亜硫酸塩の配列」という手法により定量的および resolutive の DNA メチル化解析が可能します。.重亜硫酸塩の配列を使用して、研究の方角は、さまざまなレベルにおけるシトシンのメチル化の有無を検出しました。人間18,19,20,21,22,23マウス24で検出された 16S 領域や、12 D ループ領域のメチル化 mtDNA組織・細胞研究にわたって合計シトシンの 1 ~ 20% の魅力的な変動でただし、します。
これらの数多くの研究と比較して私たちのグループからを含むのみいくつかの研究がミトコンドリア Dna メチル化3,25,26,27の存在を論じられるまたはの生物学的妥当性を疑問視ミトコンドリア Dna (2%) 以下のレベル28の非常に低レベル。最近、ミトコンドリア全重亜硫酸塩の配列3の潜在的な重亜硫酸塩の配列項目の観測を報告しました。我々 はそれによりメチル化レベルを過大評価してミトコンドリア DNA の二次構造は重亜硫酸塩の配列で、偽陽性につながる証拠を提供しました。MtDNA の重亜硫酸塩の変換のアーティファクトを防ぐためにプロトコルを示します。このプロトコルは、ミトコンドリア Dna の二次構造を混乱させると次の重亜硫酸塩の配列プロトコルの重亜硫酸塩へのフル アクセスを許可する DNA の簡単な酵素の消化力を使用します。さらに、重亜硫酸塩の配列の解析に伴うバイオ情報パイプラインを提供します。

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA methylation-lightning kit</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td><td>Qiagen</td><td># 203603&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA chip</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit high sensitivity dsDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR detection system</td><td>Biorad&amp;nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq instrument</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

DNA のメチル化の定量は、重亜硫酸塩の配列は、非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA のコンテキストでを変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用を使用して達成することができます。重亜硫酸塩の配列をすることができます (PCR を使用して) を対象とした全ゲノム上で実行やシトシンのメチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供します。特に二次構造の核およびミトコンドリア DNA の異なる性質を考えると、ミトコンドリア Dna のシトシンのメチル化を調査するための重亜硫酸塩の配列方法の adaptions が行われなければなりません。MtDNA の二次および第三構造は確かに不完全な変性の単一座礁させた DNA を重亜硫酸塩のアクセスの悪さのため偽陽性につながる成果物を配列する重亜硫酸塩につながることができます。ここでは、シトシンの正確な定量化にミトコンドリア Dna のメチル化レベルを許可する DNA の酵素消化による病原バイオ情報解析パイプラインと相まってプロトコルについて述べる。加えて、我々 は mtDNA に固有重亜硫酸塩の配列のプライマーの設計のガイドラインを提供、望ましくない核ミトコンドリア セグメントをターゲットを避けるために (NUMTs) は、核ゲノムに挿入されました。

ミトコンドリア Dna のメチル化を調査する場合に、このプロトコルの 2 つのステップが重要です。1) 二次構造と 2) ミトコンドリア DNA 特異プライマーの設計の開口部。
制限酵素病原 (図 1) ヒトのゲノム DNA を消化によってミトコンドリア DNA の構造は塩基位置 14,258 カットされ、二次構造が表示されま...

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

ここでは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の定量の正確さを許可するプロトコルを提案する.このプロトコルではミトコンドリア Dna の二次構造によって引き起こされるミトコンドリア Dna のメチル化レベルの過大評価を避けるために使用することができますバイオ情報解析パイプラインと相まって病原が付いている DNA の酵素消化をについて説明します。

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K ビュー.  University of Copenhagen. ここでは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の定量の正確さを許可するプロトコルを提案する.このプロトコルではミトコンドリア Dna の二次構造によって引き起こされるミトコンドリア Dna のメチル化レベルの過大評価を避けるために使用することができますバイオ情報解析パイプラインと相まって病原が付いている DNA の酵素消化をについて説...

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Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

メチル化DNA免疫沈降

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

生物学

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

神経科学

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

生化学

mtDNAの合成と分布のハイスループット定量

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

著者スポットライト:ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量化  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms has increased in recent years due to the recently developed ability to produce models by mtDNA mutagenesis and a new appreciation of the association between mitochondrial genetic aberrations and common age-related diseases such as cancer, diabetes, and dementia. Pyrosequencing is a sequencing-by-synthesis technique that is widely employed across the mitochondrial field for routine genotyping experiments. Its relative affordability when compared to massive parallel sequencing methods and ease of implementation make it an invaluable technique in the field of mitochondrial genetics, allowing for the rapid quantification of heteroplasmy with increased flexibility. Despite the practicality of this method, its implementation as a means of mtDNA genotyping requires the observation of certain guidelines, specifically to avoid certain biases of biological or technical origin. This protocol outlines the necessary steps and precautions in designing and implementing pyrosequencing assays for use in the context of heteroplasmy measurement.

Pyrosequencing assays enable the robust and rapid genotyping of mitochondrial DNA single nucleotide polymorphisms in heteroplasmic cells or tissues.

パイロシークエンシングによるミトコンドリアゲノムの一塩基多型のジェノタイピング

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

要約

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メチル化DNA免疫沈降

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DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

パイロシークエンシングによるミトコンドリアゲノムの一塩基多型のジェノタイピング