Name: using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00.000+00:00
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この作品は、ドイツ研究振興協会 (INST 39/969-1) し ERC 助成契約 n. 681891 を通じて欧州研究評議会によって資金を供給します。

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著者は利益相反を宣言しません。

複雑なタンパク質系のこれらの測定値の分析の手順を追って説明 3色 smFRET データを取得する実験を紹介します。このアプローチでは、直接複数の相互作用部位や構造変化との相関を評価するユニークな可能性を提供しています。
タンパク質の適切なマルチカラー分子データを得るために低ノイズ レベルで再現可能な測定を行うことが重要です。これは、フロー商工会議所9効率的かつ信頼性の高い表面不活性化プロトコルを使用して実現できます。表面に固定化された分子の十分な密度は分子記録映画あたりの収量を高めるために使わなければなりません。これは、光の単一分子からの蛍光が記録されたイメージのピクセルの約 5-10% に当たるべきことを意味します。同時にオーバー ロードしないようにする、隣接する分子の重複になりますので。ラベルの付いた種がソリューションで無料 (AMP-PNP * 提示における)、濃度が低く、短い波長をもつレーザーから直接励起による測定に干渉されていないかどうかを確認 (すなわち、通常、マイクロモル以下も濃度)。また、これらの化合物の濃度はインタ フェースへの非特異的結合によるものよりも低くないことを確認します。さらに、最適な励起電源は、信号対雑音比と、蛍光物質の変質のトレードオフを表します。
提案するプロトコルの酸素消去システムは採用されていません。使用されている Atto テック染料が重要な実験 (励起サイクルあたり照明 70 ミリ秒) の時間スケールで点滅表示されず、グルコース酸化酵素、カタラーゼ、トロロックス33 成るスカベン ジャー システムによって写真漂白剤率の低下認められなかった ,34。また、酸素スカベン ジャーの不在は、酸素清掃システムは通常最大35マイクロモル濃度のタンパク質成分を含んでいる非特異的タンパク質相互作用によるアーティファクトを回避できます。
もう一つの重要なステップは、トレースが選択されます。単一分子蛍光の強度の合計のための領域のサイズが可能ですが、点広がり関数の設定のより静かでより大きいのような小さなに選ばれました。フラットで高原を検出チャンネルが似たような明白なガンマのトレースが期待できます共同強度要因、トレース分析のこの段階で修正されていないので注意してください。(セクション 3) における蛍光強度の痕跡を明確に定義された条件を満たす分子のみが含まれます。PFのトレースに貧しい信号対雑音比を持つ分子は、さらに分析から除外され、条件を使用する選択をクリアとしてデータの評価には影響を与えません。
データ品質に応じて代替的なアプローチは、最適な状態の割り当てを提供します。無料多次元アンサンブル HMM に基づいているか蛍光強度トレース27かPFトレース対応する放出確率を (例えばガウスを最適化することによって基になる状態の割り当てに適用できません。Pdf ファイル) 同じに、キネティック モデルを最適化します。両方のアプローチにはそれぞれ長所と短所があります。PFのトレースは、蛍光強度レベルの異なる分子から分子間不利なスパイクを含めることができます。提示プロトコルにより人工の遷移、スパイクが発生した場合、 PFのヒストグラムに合わせて 3 D ガウスから放出確率の推定とその後の遷移確率を最適化するだけでこの問題は解決します。アンサンブル HMM を実行します。
提示されたアプローチは、従来の単一分子計測に必要な低濃度と互換性があるために比較的高い親和性と結合する標識の相互作用パートナーの必要性によって制限されます。これはローカル濃度 (相互作用パートナー36のテザリング、小胞37,38のカプセル化) または (例えば、ゼロモード興奮して音量を下げる方法を増やす戦略によって克服される可能性があります。導波路39)。また、慎重に選択する必要があるラベルの位置、制御実験は、fluorophores の重篤な副作用を排除すべき。Hsp90 の場合、これは通常40酵素活性を証明する atpase 活性アッセイによってチェックされます。場合は、結晶または NMR 構造からの構造情報が考慮されなければなりません。最寄りの位置は相互作用のインターフェイスから、表面に露出したループで、タンパク質表面ポケットの中に埋没してしまわない。これは染料の大量アクセスを保証します。
フレームワークは、任意の数の色のマルチカラー smFRET 実験に適しています。ここでは、3 色の測定に着目し、これらは既に他の単一分子の実験、すなわち、2 つのプロセス間の相互関係を直接観察する可能性から個別属性を表示する機能を提供 (のバインディングなど相互作用パートナーと構造変化)。この情報は、標準の 2 色 smFRET 実験ではアクセスできないが任意の分子機械の機能を理解するための基本的な関心は。
提示実験と解析3自体は、非常に柔軟な状態間の時間スケールの広い範囲でダイナミクスを表示可能性があります蛋白質システムを特徴付けることができます。これは、ホリデー接合など4(大抵 2) 明確に定義された状態間の遷移を示す DNA または RNA のモデル システムに焦点を当てて、以前に発行されたマルチカラー smFRET 実験を対照的です。タンパク質における信号対雑音比が低いとフォトブリーチングによる smFRET 実験で一時的な帯域幅が限られたため、遷移確率の完全なセットを抽出は難しい。ここでは、我々 を示す - と合理的な制約 - 慎重に適用されている場合測定蛋白質システムで障害克服できる多次元状態割り当てとアンサンブルの隠されたマルコフ解析9を使用してマルチ カラー smFRET と。

多くの蛋白質は、動的錯体の構造変化と幅広い時間スケール1,2,3の一時的な連合を介した他の分子とその機能を発揮します。外部のエネルギー源 (例えばATP) これらの動的相互作用することができます機能サイクルの方向性につながる、最終的に生活のための前提条件のセルに非平衡定常状態を維持する結合。
これらの分子機械を完全に理解するためには、静的な記述の構造研究に導かれては十分ではありません。さらに、基になる運動モデルの知識を持って運動速度定数を決定するために不可欠です。いくつかの既存の方法許可バイナリ相互関心、表面プラズモン共鳴など、(例えば、ジャンプまたはストップト フロー分光読み出しと緩和法の 2 つの分子のダイナミクスを研究する研究者テクニック) と核磁気共鳴。ただし、適用性は、(例えば、 1 つのバインドとバインドされていない状態) の単純な 2 状態系平均一括実験に固有のために制限されてほとんどの場合です。以上の国または中間体が関与している場合、彼らは唯一速度定数の複雑な混合物をもたらします。単一分子光ピンセットや磁気ピンセットや 2 色 smFRET、つまり1 ドナー表面固定化したサンプルを 1 つの受容体 fluorophore など方法は、立体配座の変化すべての速度定数を回復できます。しかしときに、1 つ以上の結合部位に影響を与える相互作用は、これらの方法が限られている残る、2 つ (またはそれ以上) の可能な相関相互作用についてのみ、一連の実験から結論は間接を通じてアクセスできます。
マルチカラー smFRET4,5,6,7,8,9は、リアルタイムで直接、下のこれらのコンポーネント間の相互作用を研究する機会を提供しています近く生理的条件10。これにより、たとえば、リガンドまたは別タンパク質8,9,11のコンホメーション依存的結合を調査する 1 つ。ここで示した全体的なアプローチは、測定チャンバーの表面にタンパク質を付けると時間をかけて (の詳細についてを参照してください9プリズム型観察上の蛍光強度を追跡するための特定の位置で興味のタンパク質のラベルには,12) します。 異なる染料の空間的近接性することができますそれらの間のエネルギー移動から決定されます。(文献13) 蛋白質蛋白質から異なる場合があります戦略をラベリングと smFRET 測定におけるアーティファクトを避けるためのガイドライン14が存在します。
ドナー色素は、マルチカラー smFRET 実験で異なるアクセプター色素にエネルギーを移す可能性があります、ので、すべての染料の相対位置は 1 つの染料だけで15,16の興奮からアクセスできません。しかし、交互にレーザー励起 (アレックス17、および18の見直し) との組み合わせでこのメソッドは、1 秒未満でサブナノ メートル分解すべての時空間的情報を提供します。
原則として、構造情報は色素間の距離を使用して実現できます高解像度はアレックスとマルチカラー smFRET 実験ではすべての蛍光強度の組み合わせから計算されます。しかし、ここで状態の識別、分離、マルチカラー smFRET が不可欠である、運動のモデルの抽出に着目します。三角形分割による構造決定「のみ」が必要な場合、高い信号対雑音比の単純な 2 色 smFRET 実験セットは実行12,19にできます。
部分的な蛍光を用いて (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) 2 つの同時7間のエネルギー移動のためのプロキシとして。PFは、2 色実験の FRET 効率に類似した蛍光強度から計算されます。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
ここで、<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg">カラー exと励起後放出チャネルemの強度は、 cが最も長い波長を持つ受容体です。検出チャンネルは、試料室が蛍光ライトのスペクトル範囲が異なるレコードの同じ位置を表しています。励起と放射の同じ識別子はこのプロトコルで使用される (すなわち、 「青」、「緑」と"red")。
実験的欠点のため測定された蛍光強度はエネルギー転送のみならず、fluorophore およびセットアップ プロパティにも依存します。2 フルオロ間真のエネルギー伝達効率を得るために修正する測定強度があります。次の手順は、参照9に基づいています。明らかな漏れ (lk、すなわち、別の染料のため指定されたチャネルの蛍光体からの光子検出) の明白なガンマ補正係数 (ag、すなわち色素の蛍光量子収率とチャネルの検出効率) 表示するイベントを漂白アクセプター分子トレースから取得されます。
すべての可能な受容体チャネルにドナー色素の漏出、アクセプター色素漂白しますが、ドナーはまだ蛍光記録された蛍光トレース内のすべてのデータ ポイントから計算されます (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">)。
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
漏れヒストグラムの中央値は明らかな漏洩ファクターとして使用されます。漏れの訂正後、明白なガンマ係数はトレースの同じセットによって決定されます。それはアクセプター色素の漂白時にドナーのチャネルで蛍光の変化による受容体チャネルの蛍光の変化を割ることによって計算されます。
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
場所c再び、最長波長を持つ受容体の検出チャンネルです。結果の分布の中央値は、明らかな補正係数として使用されます。
各チャンネルで修正された強度は、によって得られます。
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
PFによると計算されます。
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
別の集団は、 PFs 多次元空間で分離できます。位置と各状態の幅は、継ぎ手の多次元ガウス関数とデータによって決まります。すべてPFトレースに基づく 1 つのグローバルな HMM の後続の最適化は、観測された挙動の定量的な説明を提供します。率の小さな変更は検出です。
Hmm は、騒々しい時間トレースの収集から状態モデルを推定する方法を提供します。システムは、任意の時点と実際の観測 (すなわち、排出量) で隠された状態はこの隠し状態20の確率関数、離散のセットのいずれかにすると見なされます。観察 smFRET データの場合、放出確率bは私の状態は私あたりは連続ガウス確率密度関数でモデル化できます。定期的に間隔をあけられた離散時間ポイントでから 1 つ別の状態への遷移、時不変であり現在の状態にだけ依存する遷移確率によると発生します。遷移行列Aでは、これらの遷移確率ijをすべて非表示のステート間を含まれています。初期状態分布<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg">状態固有の確率を与える<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg">時間トレースの最初の時間の点。最大尤度アプローチを使用して、これらのパラメーターは最高前後バウム ウェルチ アルゴリズム20,21とデータを記述するために最適化できます。最尤推定 (MLE) が得られます。最後に、最も可能性の高い観察の軌道を生成状態シーケンスはビタビ アルゴリズムで推測できます。HMM、単なる「平滑化」のデータが必要とせずデータ セットから抽出運動の状態モデルのドウェル時間を嵌合するための smFRET データ24,25,26の他の HMM 解析と対照をなして使わないヒストグラム27。HMM 解析は、Igor Pro を使用してスクリプトを内部で行われます。コードの実装は、参照21に基づいています。我々 は次のセクション 5 および 6 はこのプロトコル (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) のために当社ホームページのソフトウェア キットと模範的なデータを提供します。完全なソフトウェアは、リクエストを承ります。
時間でPFを使用してデータ ポイント <-1 またはPF > 任意の検出チャンネルで 2 がすべての州 (10-200) の発生が少ない確率を割り当てられます。これは、これらのデータ ポイントで人工の遷移を防ぎます。
放出確率のパラメーターは、手順 5.7 ガウス関数による 3 D PFヒストグラムのフィットから取得されます。これらのパラメーターは、HMM の最適化中に固定されます。
提示されたアプローチで初期状態分布ベクトルと遷移行列が、トレースの全体のアンサンブルを記述するグローバルに使用されます。参照27に従って、データ セットからのすべてのN分子に基づいて更新されます。
初期状態の配布の開始パラメーターはPFヒストグラム (ステップ 5.3) の投影から決定され、遷移確率に設定されて 0.05 確率を除いて同じ状態に滞在するそのような物選ばれました。特定の状態のままにする確率を団結を正規化します。
プロファイル尤は、すべて移行率21,22不確実性の意味のある見積もりとなるための信頼区間 (Ci) を与えるためです。特定のレートの CI の境界を計算するための関心の遷移確率は尤以外の値に固定されています。これにより、テスト モデル λ'。尤度の尤度比 (LR) 検定<img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg">によると特定のデータ セット0が実行されます。
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
バインド パラメーターはLR 3.841、 2xの 95% の変位値を超えたときに 95% の信頼-1 自由度22,23配布。
Hsp90 を使用してメソッドの力を発揮します。この豊富なタンパク質は、細菌と真核生物で発見され、細胞ストレス応答28の一部です。がん治療29で有望な薬剤標的であります。Hsp90 は各サブユニットの30の N 末端ドメインの 1 つのヌクレオチド結合ポケットのホモです。それは、少なくとも 2 つのグローバル異なるコンフォメーション、閉鎖の 1 つと 1 つ N ターミナル オープン、V 字構造19,31,32間の遷移を受けることができます。二量体の性質は直接 Hsp90 2 つのヌクレオチド結合部位間の相互作用の問題を発生させます。
以下では、データ集録および酵母 Hsp90 とヌクレオチドの 3色 smFRET 実験の解析の手順プロトコルを提供します。蛍光に分類されたアンプ PNP のコンホメーション依存的結合 (AMP-PNP *、非加水分解性 ATP アナログ) が分析します。記述されていたプロシージャのアプリケーション研究ヌクレオチド結合のと同時に Hsp90 のコンフォメーション変化が許認可により Hsp90 の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を明らかにします。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vibration-damped optical table&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Newport, Irvine, CA, USA</td><td>RS2000</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 473nm LX 75mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1185052</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 532nm LS 50mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1261779</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 594nm LS 60mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1233470</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 637nm LX 140mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1196625</td><td></td></tr><tr><td>laser control unit</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1234465</td><td>Scientific Remote</td></tr><tr><td>aspheric telescope lenses</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td></tr><tr><td>CF ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 473/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 532/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 594/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex4</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>FL635-10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>DM ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZQ594RDC</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>DM ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>570DCXR</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>DM ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZQ491RDC</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>AOTFnC-Vis</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;lambda;/4 plate</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td></td><td>high-NA objective</td></tr><tr><td>piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td><td>piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td></tr><tr><td>piezo stepper</td><td>Newport, Irvine, CA, USA</td><td>PZA12</td><td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td></tr><tr><td>achromatic aspheric lenses</td><td>Qioptiq Photonics GmbH &amp;amp; Co. KG, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>G322-304-000</td><td>d=50mm, f=200mm</td></tr><tr><td>adjustable optical slit</td><td>Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td><td>27.160.1212</td><td>max. aperture 12 x 12 mm</td></tr><tr><td>DM det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>T 600 LPXR</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>H 560 LPXR superflat</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>HC BS R635</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>BP det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>525/40 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>586/20 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>631/36 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det4</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>700/75 ET Bandpass</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>optical shutters detection</td><td>Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td><td>Uniblitz VS25S2T0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>digital I/O card, PCIe-6535</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syringe pump</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>PHD22/2000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flow chamber&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>quartz slides</td><td>G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Spectrosil2000, h=3mm</td></tr><tr><td>TEGADERM film</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>1626W</td><td>10 x 12cm</td></tr><tr><td>spray adhesive</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>Photo Mount 050777</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td>Immersol G</td><td></td></tr><tr><td>immersion oil</td><td>OLYMPUS EUROPA SE &amp;amp; CO. KG, Hamburg, Germany</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>prism</td><td>Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td><td></td><td>Suprasil1</td></tr><tr><td>aluminium prism holder</td><td></td><td></td><td>custom built</td></tr><tr><td>hollow setscrews</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>with custom drilling</td></tr><tr><td>Tygon S3 E-3603 tubing</td><td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>2-4450</td><td>ACF00001</td></tr><tr><td>PTFE tubing</td><td>Bohlender GmbH, Gr&amp;uuml;nsfeld, Germany</td><td>S1810-08</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sample&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td><td></td><td></td><td>UniProt ID P02829</td></tr><tr><td>Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td><td>ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP*</td><td>Jena Bioscience, Jena, Germany</td><td></td><td>&amp;gamma;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td></tr><tr><td>Fluospheres</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>F8764</td><td>amine-modified, 0.2 &amp;mu;m, yellow-green fluorescent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td>version 4.30</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td></tr><tr><td>MDS control software</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td>version 2.03a</td></tr><tr><td>Coherent Connection</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>version 3</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td><td></td><td>version 6.37</td></tr></tbody></table>

using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions

単一分子蛍光共鳴エネルギー移動 (smFRET) 生体分子のダイナミクスを調べるため広く使用されている生物物理学的技術となっています。自分のタスクを満たすために機能サイクルの相互作用パートナーと共に行動する細胞蛋白質の多くの分子機械を持っています。延長にマルチカラー 2 色 smFRET はそれに 1 つ以上の相互作用や構造変化を同時に調査することが可能。これだけではなく smFRET 実験新しいディメンションを追加しますが、イベントのシーケンスを直接研究して固定化サンプルと全反射蛍光相関相互作用を検出するユニークな可能性を提供しています顕微鏡 (TIRFM)。したがって、マルチカラーの smFRET は以前達成不可能の詳細で定量的な方法で生体分子複合体を研究するための多目的なツールです。
ここでは、蛋白質のマルチカラー smFRET 実験の特別な課題を克服する方法を示します。データを取得するため、運動情報を抽出するための詳細なプロトコルを提案します。これは、トレース選択基準、国家の分離、および 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデル (HMM) を用いたノイズの多いデータから状態軌道の回復が含まれています。他の方法と比較して、運動情報はドエル時間ヒストグラムから、直接 HMM からを回復しません。最尤フレームワーク キネティック モデルを批判的に評価して料金の意味のある不確実性を提供することが出来ます。
熱ショックタンパク質 90 (Hsp90) に本手法を適用しておりますはヌクレオチド結合および蛋白質のコンフォメーション変化が世界を解きほぐすことができます。これにより、Hsp90 二量体の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を直接観察できます。

マルチカラー smFRET 測定は、2 つ以上の異なる相互作用部位との相関の直接検出を許可します。これは蛋白質の複合体などの多成分システムを検討するユニークな技術をレンダリングします。具体例として 3 色 smFRET 実験がここでは、プレゼンテーションに着目します。
図 1にメソッドの一般的なワークフローを示します。最初の部分には、プリズム式全反射顕微鏡にマルチカラーの smFRET データの記録が装備されています。付着戦略とセットアップの回路図は、図 2 aに描かれています。セットアップの詳細な説明、9を参照を参照してください。提示されたメソッドの 2 番目の部分は、データの分析に焦点を当てください。図 2 bには、模範的な蛍光強度トレースが表示されます。適当な時間をトレース表示: (i) (ii) フラットの強度の高原、Hsp90 に接続されている両方の fluorophores の明確な漂白ステップ (iii) 反相関動作対応するチャンネルのアンプ PNP の (iv) 少なくとも 1 つのバインディング イベント * (図 3)。選択条件を満たす以上 400 の分子は、信頼性の高い統計を生成するために選ばれました。研究システム 5 つの州は機能的に異なる (図 2) をされている 4 つの州での蛍光強度で区別できます。
蛍光強度からトレース部分の蛍光 (PF、FRET 効率多色 smFRET 実験のための拡張) することができます (図 4 a) を計算します。PFの染料の近さに関連しています。3色 smFRET 実験では、データは、3 D 空間 (図 5 b) をまたがっています。3 D ヒストグラムの投影 (図 4 bC) の国家の分離に有用であると証明しました。成功した実験で応用実験条件下で理論的に予想されるすべての状態は、2 D プロジェクションでのPFで区別。
州の相対的な人口は、ピーク (図 5) を囲む図面の無料手ポリゴンによって、投影から決定されます。このアプローチは、正確で信頼性の高い9をことが判明しました。HMM の放出確率がSが区別できる状態 (5 枚提示された場合の数は、3 D のガウス関数の和と 3 D のPFヒストグラムを適合させて得られる図 5)。正しく収束するこのフィット感、位置と、ガウス分布の幅は自由に一定に保たれる、のみ、相対的な人口pは私の各状態私があります。
1 アンサンブル HMM は、ガウス フィット (図 6) から得られたパラメーターに固定放出確率と完全なデータ セットを最適化されています。各移行は、抽出された遷移確率, 95 %ci の不確実性の測定を得るために (図 7) を決定します。
さらに、平均時間を AMP-PNP ラベル記者ヌクレオチド * Hsp90 にバインドされたまま異なる実験条件 (図 8 a) の下で得ることができます。これは、さらに結果の複雑さを軽減するのに役立ちます。そう、AMP-PNP を表す状態 * 連結および非連結の立体構造がそれぞれ状態軌道に折りたたまれています。これから平均滞留時間アンプ PNP * 解離することができます (図 8 b) を算出します。
有無やその他の存在にみられる反応を比較すると、Hsp90 のコンフォメーション変化とヌクレオチド状態の相関に関するラベルのないアンプ PNP、ユニークな情報を得ることができます。これは Hsp90 の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を直接研究することが可能になります。その上、基質濃度 (例えば、丘プロット) の関数としてバインド サイト職業を測定の滴定実験の必要性を回避できます。Hsp90 などの非常に動的な蛋白質のシステム、このアプローチは料金11の小さな変化に敏感またです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56896/56896fig1.jpg"> 図 1: データ集録および解析の一般的なワークフローです。マルチカラー smFRET 全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) のデータを取得します。後にトレース選択と部分の蛍光 (PF) の計算、3 D のPFヒストグラムとその投影がコンパイルされます。2 D プロジェクションを使用すると、すべての識別可能な州の人口を決定できます。これらは、 PFのヒストグラムに合わせて 3 D ガウスの制約として使用されます。その後の 3 D のアンサンブルのための放出確率としてガウス確率密度関数隠れマルコフ モデル (HMM)。これはシステムの運動の説明を生成します。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56896/56896fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56896/56896fig2.jpg"> 図 2: データ集録のスキーム。Hsp90 ダイマーの研究体制の (A) 絵文字 (黄色の楕円は、ドメイン構造を表す) Atto488 (ブルー)、Atto550 (緑) のラベルと AMP-PNP 記者ヌクレオチド表面に付着した * ソリューションで付いたAtto647N (赤)。データは、レーザ励起 (アレックス) を交互にプリズム式全反射顕微鏡に記録されます。青と緑の励起後 (B) 模範的な蛍光強度 (フロリダ州 int.) 跡。Hsp90 の区別の構造状態の (C) 絵文字 (S0S1S2S3,4S) との機能的状態 (O、C、O *、C *) この作業で使用する彼らのそれぞれの識別子。赤、緑、青の蛍光体の位置が示されます。2 つの集団が同じの機能状態を表す、すなわちアンプ PNP と Hsp90 を開く * (S2と S3) をバインドします。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56896/56896fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56896/56896fig3.jpg"> 図 3: 選択条件。(A) A 分子がさらなる分析のために選択します。(B、 C)分子は、さらなる分析のために選択されていません。(B) フラットの高原と Atto550 がない暗い状態で約 30 (矢印によって示されます) 緑の励起後 s。(C) (矢印によって示されます) 緑の励起後の手順を複数の漂白します。階の int 型: 蛍光強度、青: Atto488、グリーン: Atto550、赤 Atto647N、ex: 励起。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56896/56896fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56896/56896fig4.jpg"> 図 4: PFトレースと代表的なヒストグラムの計算。(A) 代表的な蛍光強度 (フロリダ州 int.) トレースと対応する部分的な蛍光 (PF) トレース。(B) 2 つの追加、ラベルのヌクレオチドの不在で測定 3 D PFヒストグラムの投影。(C) 追加の 250 μ M の存在下で実験のため同じ予測 AMP-PNP。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56896/56896fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56896/56896fig5.jpg"> 図 5: 人口選択プロセス。(A) 2 つの 2D プロジェクションに区別可能な個体の位置。(B)図 2のピクトグラムのコピー。(C) 代表的な 3 D 散布図PFデータの。データ ポイントの色は、可視化のみです。B と同じ色のコードを使用します。(D) 相対的な集団による、2次元ヒストグラムのピークの周囲にフリーハンド ポリゴンを描画することによって行われます。図 3に示した 2 つの投影法の組み合わせを使用して、すべての 5 つの集団を区別できます。A. 描かれた内のPFデータのヒストグラムに合わせて 3 D ガウスの (E) 結果は、5 つの異なる集団を表す、半値幅で等値面です。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56896/56896fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56896/56896fig6.jpg"> 図 6: アンサンブル 3 D HMM 最適化のフローチャート。1 つのモデルは、データ セットからのすべての分子に最適です。開始値は、状態数が事前に定義された) (入力モデルによって与えられます。与えられたデータ (3 D PFトレース) モデルの尤度前後 (FB) アルゴリズムで評価しています。バウム ・ ウェルチ (BW) アルゴリズム パラメーターのローカルの最尤推定 (MLE) が得られます。グローバルの MLE は、繰り返し見つけることが。ビタビ アルゴリズムは、モデルを与えられて最も可能性の高い状態の軌道を計算します。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56896/56896fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56896/56896fig7.jpg"> 図 7: CI と有意義な不確かさの推定します。(A) 1 つの模範的な速度定数 CI の決定。最尤推定 (MLE) モデルと比較してテスト モデルの尤度比 (LR) は、速度定数の MLE 一帯で計算されます。LR 3.841 (水平方向の暗い灰色の線) を超えたとき、バインドされている 95% の信頼は達されます。(B) 抽出率定数追加ヌクレオチド (赤) と (青) のアンプ PNP とその 95% 信頼区間。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56896/56896fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56896/56896fig8.jpg"> 図 8: 平均滞在時間 AMP-PNP 記者ヌクレオチドの * 追加塩基の存在下で Hsp90 をバインドを延長します。ラベルの付いたアンプ PNP の観測の解離の (A) ピクトグラム * Hsp90 のすべての構造を平均 Hsp90 ダイマーから。Hsp90 のドメイン構造は黄色の楕円形で描かれ、構造の柔軟性は、オープンとクローズのダイマーを重ねることによって示されます。(B) 平均滞在時間アンプ PNP の * 追加ヌクレオチド (赤) の不在とアンプ PNP (ブルー) ラベルなし 250 μ M の存在で、Hsp90 にバインドされています。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56896/56896fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

ここでは、3色 smFRET データと 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデルとその解析を取得するためのプロトコルを提案する.このアプローチでは、科学者は複雑な蛋白質のシステム、協同性や相関相互作用などからキネティック情報を抽出できます。

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

using-three-color-single-molecule-fret-to-study-correlation-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K ビュー.  University of Freiburg. ここでは、3色 smFRET データと 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデルとその解析を取得するためのプロトコルを提案する.このアプローチでは、科学者は複雑な蛋白質のシステム、協同性や相関相互作用などからキネティック情報を抽出できます。

ビデオ: Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

生化学

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

生物工学

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

イメージングタンパク質間相互作用 in vivoで</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

生物学

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

生きた細菌におけるタンパク質とタンパク質相互作用のFLIM-FRET測定

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

FRET感作発光を伴う生細胞におけるタンパク質相互作用の評価(英語)

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

BIFC-FRET-FLIMアッセイによるMADS型転写因子の2つのモノマーとカルシウムセンサタンパク質の三者間相互作用の測定

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

Source: Dunsing, V. et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58582">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the fluctuations of fluorescence intensity.

細胞接触部でのタンパク質相互作用を研究するための蛍光変動分光法

Source: Dunsing, V. et al. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp.&#160;(2018).
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3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

要約

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