我々の方法は、タンパク質複合体形成の運動学を研究するのに役立ちます。タンパク質複合体がいかに緊密であるか、またタンパク質複合体形成が他のタンパク質によって干渉される場合について説明します。この技術により、蛍光をレポーターとして定量的に用いたタンパク質とタンパク質の相互作用を研究することができ、当社のアッセイは、タンパク質複合体の関連付けと解離をリアルタイムで監視することができます。
まず、タンパク質データベースからCOL1 CAND1複合体のデータから始まるFRETアッセイを設計します。PyMOLで構造をロードし、ウィザードメニューに移動し、CAND1の最初のアミノ酸とCOL1の最後のアミノ酸との間の距離を推定するために測定機能を使用します。次に、オンラインスペクトルビューアをロードし、7-アミノ-4-メチルクマリンとFlASHの励起および発光スペクトルを同時に見る。
AMCはフレットドナーであり、FlASHはフレットアクサクサです。付随するテキストプロトコルに従ってFRETドナータンパク質を用いて細胞を調製する。次いで、まず、COL1ソーターゼRBX1複合体を発現する大腸菌細胞のペレットに50ミリリットルのリシスバッファーを添加することにより、COL1ソーターゼRBX1複合体を精製する。
50%振幅で超音波処理で氷上の細胞を氷。電源を 3 分間切り替えて 1 秒オンにし、サンプルが過熱しないように 1 秒オフします。得られた細胞ライセートを50ミリリットルの遠心チューブに移し、25,000回gで遠心分離して45分間細胞の破片を取り除きます。
その後、上清を5ミリリットルのグルタチオンビーズに加え、4°Cでインキュベートして細胞のリセートをクリアします。インキュベーションに続いて、ビーズのライセート混合物を摂氏4度で2分間1、500回gで遠心分離する。その後、上清を取り除く。
次に、プロテアーゼ阻害剤を有さない5ミリリットルのリシス緩衝液でビーズを洗浄する。溶液を遠心した後、上清を取り除きます。次に、洗浄されたビーズに3ミリリットルのリシスバッファーを加え、ビーズスラリーを空の列に移します。
新しい列に、5ミリリットルの溶出バッファーを加え、そのカラムを10分間インキュベートし、溶出液を回収します。次に、グルタチオンビーズから溶出物に1ミリリットル当たり5ミリグラムで200マイクロリットルのトロンビンを加える。摂氏4度で一晩インキュベーションした後、タンパク質サンプルをバッファーAで3倍希釈し、タンパク質サンプルを1分間に5ミリリットルのゼロポイントで平衡化されたカチイオン交換クロマトグラフィーカラムにロードします。
次に、バッファAにゼロ~50%の緩衝値Bを加えて、1分間に1ミリリットルの流量でタンパク質を溶出させる。次に、FRETドナータンパク質を含む溶出画をプールし、30キロダルトンカットオフを有する限外濾過膜を使用して2ポイント5ミリリットルに濃縮する。さて、最初に脱塩カラムを使用してFRETドナータンパク質サンプルのバッファーをソーターゼバッファーに変更することによって、ソーターゼ媒介トランスペプチドを介してCOL1のc末流に7-アミノ-4-メチルクマリンを加える。
これを達成するために、まず25ミリリットルのソーターゼバッファーで脱塩カラムを平衡化する。次に、FRETドナータンパク質溶液の2点5ミリリットルをカラムにロードし、流れを捨てます。次に、ソーターゼバッファーの3ポイント5ミリリットルでサンプルを溶出し、流れを通して収集します。
溶出液の900マイクロリットルに、600マイクロモル精製ソーターゼA溶液の100マイクロモルリットルと25ミリモルGGGG-AMCペプチドの10マイクロリットルを加える。一晩暗闇の中で摂氏30度で反応混合物をインキュベートし、COL1-AMC-RBX1を生成する。次に、すべてのサンプルをサイズ除外クロマトグラフィー列にロードし、バッファーのカラム体積の5倍の1ポイントで溶出します。
最後に、COL1-AMC-RBX1を含む溶出画分をプールします。テキストプロトコルに従って、FRET アクソクタータンパク質を調製します。多くのステップは、FRETドナータンパク質調製物と同様である。
完了したら、Flash CAND1溶液を準備します。まず、FlASH溶液の1マイクロリットルを、作りたてのテトラサイ-CAND1溶液の50マイクロリットルに加えます。組み合わせた溶液をよく混ぜ合わせ、暗闇の中で室温で混合物を1〜2時間インキュベートし、FlASH CAND1溶液を形成します。
300マイクロリットルのFRETバッファーで、コル1-AMC-RBX1を70ナノモルの最終濃度に加え、溶液をキュベットに移します。キュベットをフッ素計のサンプルホルダーに入れます。350ナノメートルの励起光でサンプルを励起し、1ナノメートル単位で400〜600ナノメートルの発光信号をスキャンします。
次いで、300マイクロリットルのFRETバッファーに、COL1-AMC-RBX1とFlASH-CAND1の両方を70ナノモルの最終濃度に加えます。350ナノメートルの励起光でサンプルを励起し、400〜600ナノメートルの発光信号を1ナノメートル単位でスキャンします。励起光を350ナノメートルに設定し、450ナノメートルの発光光を通過させ、500〜650ナノメートルの発光光をブロックするバンドパスフィルタを使用します。
充填位置のサンプルバルブで、水で満たされた3ミリリットルのシリンジを接続します。次に、サンプルシリンジドライブを上下に数回動かして2本のサンプル注射器を水で洗い、完成したら水を捨てます。次に、FRETバッファーで満たされた3ミリリットルのシリンジを接続します。
サンプルシリンジドライブを数回上下に動かしてFRETバッファーで2つのサンプルシリンジを洗浄し、終了時に水を捨てます。さて、3ミリリットルのシリンジを接続し、FRETバッファーに100ナノモルCOL1-AMC-RBX1を使用して、最初のサンプルシリンジ、シリンジAをロードします。その後、サンプルバルブを駆動位置に回し、3ミリリットルのシリンジをシリンジBに接続し、FRETバッファにFlASH CAND1のナノモルを100ナノモルでシリンジBをロードし、そのバルブを駆動位置に回します。
ソフトウェアで取得中のコントロールパネルを開き、60秒間にわたってCOL1-AMCの放出を記録します。その後、単一のショットを取ります。各ショットから時間の経過と経過とともに測定された蛍光信号の減少と単一の指数曲線に適合させます。
先に示したようにシステムを洗浄し、FRETバッファー内の100ナノモルCOL1-AMC-RBX1と100ナノモルFlASH CAND1の溶液をシリンジAに追加します。次に、Skp1-Skp2の溶液をシリンジBにロードし、充填位置にある間にシステムに接続します。シリンジBをロードし、サンプルをドライブ位置に回します。
ソフトウェアで、コントロールパネルを入手して開きます。COL1-AMC の放出を 30 秒にわたって記録するようにプログラムをセットアップします。その後、単一のショットを取ります。
蛍光シグナルは、シリンジAとシリンジBからの溶液を混合した後、時間の経過とともに増加する。そして、COL1-AMCのピークが低くなり、FlASH CAND1のピークが高くなりました。全長CAND1をFRETに使用した場合、ドナーピークは強度の10%減少を示した。
しかし、最初のらせんを切り捨てたCAND1を使用した場合、ドナーピーク強度の低下を30%に増加させ、FRET効率の向上を示唆し、COL1-AMCとFlASH CAND1の間のFRETから信号変化が生じることを確認し、ドナーFRETは受入器のチェイスとして知られている過剰なラベルなしCAND1と混合した。その結果、ドナーピークは完全に回復し、アクサクサピークは減少した。ここに示されているのは、線形回帰分析後のCAND1濃度を用いた平均観測K値のプロットである。
複合体の定数上で測定するために、50ナノモルCOL1-AMCを一連の観察された解離速度定数に使用し、FlASH CAND1の濃度を増加させると50ナノモルCOL1-AMCを混合して測定した。オン定数の測定と同様に、COL1およびCAND1の観測解離定数は、停止流量フルオロメーター上でドナー信号の回復を時間経過に伴って監視することによって発見された。ここでドナーシグナルは急速に増加し、1秒間にゼロポイント4の観測K値を明らかにした。
対照的に、あらかじめ組み立てられた複合体にバッファーを添加した場合、COL1 CAND1の急速な解離がSkp1 Skp2によって引き起こされたことを示唆するシグナルの増加は認められなかった。できるだけ暗闇の中で蛍光色素を保つようにしてください。
