Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione di ricerca tedesca (INST 39/969-1) e il Consiglio europeo della ricerca attraverso l'accordo di sovvenzione del CER n. 681891.

1. installazione e prerequisiti
<ol><li>Eseguire le misure di smFRET multi-colore su un TIRFM di tipo a prisma. Una descrizione di una configurazione di due colori come una pubblicazione di Giove è dato riferimento a12.<ol>
<li>Costruire un TIRFM multi-colore. Un layout generale è dettagliato in 9.</li>
		<li>Uso commutabile, pompato a diodi laser onda continua a stato solido, che rendono inutile l'uso di persiane meccaniche nei percorsi di eccitazione.</li>
		<li>Impiegare un prisma asimmetrico, di forma allungato che impedisce la riflessione posteriore del fascio di eccitazione dal lato posteriore per inserire l'obiettivo.</li>
		<li>Utilizzare lenti di 2 pollici acromatico asferiche silice fusa nei percorsi di rilevamento che raccolgono quanta più luce possibile e prevenire auto-fluorescenza e aberrazioni, per esempio, distorsioni nelle regioni fuori centro dell'immagine.</li>
		<li>Concentrarsi ogni percorso di rilevamento sul chip di EMCCD con una lente separata. Questo consente una messa a fuoco ottimale di ogni canale di rilevamento. Attenzione: Classe 3B laser sono utilizzati nella TIRFM. Questo significa che sono pericolosi se l'occhio è esposto direttamente, ma diffuse riflessioni non sono nocivi. Garantire la conformità con laser precauzioni di sicurezza secondo le normative di governo locale prima di far funzionare il sistema.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare i fattori di correzione per le proprietà di configurazione e fluoroforo in anticipo utilizzando campioni di dsDNA.<ol>
<li>Utilizzare un campione di dsDNA ad alta-FRET per ogni colorante in combinazione con il ricettore avendo la lunghezza d'onda più lunga di eccitazione (per l'installazione di presentato: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Assicurarsi che il DNA è ulteriormente modificato con una biotina.</li>
		<li>Diluire il campione a 5 nM con buffer di TNM (5 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2) e 2 mM Trolox (utilizzare anche questo buffer per misura).</li>
		<li>Immobilizzare il dsDNA come descritto per Hsp90 ai punti 2.5 e 2.7.</li>
		<li>Calcolare i fattori di correzione per perdita apparente (LC) e gamma apparente (ag) da tracce di singola molecola che mostrano un evento sbiancante accettore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Costruire una camera di flusso che è un panino di una diapositiva di quarzo passivato PEG/biotina-PEG, una sottile pellicola che è adesivo su entrambi i lati e un vetrino coprioggetti. Per i protocolli di dettaglio per la pulizia del quarzo diapositive e passivazione vedere riferimento9.<ol>
<li>Uso di spessore (3 mm) quarzo diapositive per geometricamente impedire la raccolta di luce laser sparsi nell'interfaccia di quarzo-glicerolo tra il prisma e la diapositiva di quarzo funzionalizzati.</li>
		<li>Utilizzare un sottile (40 µm) pellicola che è spruzzato con adesivo sul lato non adesivo sigillante. Il film sottile riduce la distanza tra l'obiettivo e di molecole di superficie-collegato. Riscaldare fino a 80 ° C e premere.</li>
		<li>Posto un coprioggetto in alto a sinistra. Riscaldare fino a 80 ° C e premere. Utilizzare una goccia di glicerolo quando mettendo la camera di flusso sopra il prisma. Nota: I materiali del prisma e le diapositive di quarzo così come il glicerolo sono indice-abbinati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rapidi Hsp90 da Saccharomyces cerevisiae sotto forma di due mutanti di punto singolo cisteina alle posizioni D61 o Q385. Aggiungere un motivo di arrotolato-arrotola C-terminale per evitare la dissociazione del dimero a concentrazioni picomolare. Etichettare le proteine mutanti separatamente e scambiare i monomeri per ottenere eterodimeri etichettati con Atto488 alla posizione dell'amminoacido 61 e Atto550 dell'amminoacido posizione 3859.</li>
</ol>2. misurazione
<ol><li>Avviare il software della fotocamera e impostare i parametri di imaging come specificato di seguito:<ol>
<li>Impostare la temperatura per il sensore di raffreddamento più basso possibile (-95 ° C con raffreddamento ad acqua esterna) per diminuire il rumore di corrente di buio.</li>
		<li>Utilizzare le impostazioni della fotocamera che sono ottimizzate per la registrazione di singola molecola: 3,3 µs spostamento verticale velocità, tensione normale orologio verticale, 17 MHz 16 bit orizzontale leggere, pre-amplificazione guadagno 3, guadagno di moltiplicatore di elettroni 1.000.</li>
		<li>Impostare l'attivazione dell'acquisizione di "Esterno" e il tempo di esposizione di 70 ms. film di Record con una lunghezza di 750 cicli di acquisizione. Nota: Spegnere la luce di camera quando la fotocamera è l'acquisizione per evitare la saturazione del sensore EMCCD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Creare una cartella sul SSD locale per la misurazione. Nel software impostazioni andare al pilota < Auto-Save > abilitare < Auto-save > e scegliere il formato di file "Tiff" per acquisizione di film. Selezionare la cartella sul SSD come percorso di salvataggio automatico.</li>
	<li>Avviare il software che controlli l'acusto-ottico sintonizzabile filtro (AOTF), il software che controlla il funzionamento dei laser e il software di trigger che sincronizza i laser, AOTF, persiane nel percorso di rilevazione e telecamere. Regolare la potenza del laser con il AOTF (ca. 3 mW prima di entrare il prisma) e caricare il pattern di attivazione corretto.</li>
	<li>Montare il supporto del campione con il prisma e la camera di flusso, collegare il tubo, inserire il tubo di aspirazione in una microcentrifuga tazza e collegare il tubo di uscita di una pompa a siringa. A filo della camera con circa 150 µ l di tampone, allineare l'eccitazione fascio e messa a fuoco. Candeggina qualsiasi contaminanti fluorescente sulla superficie spostando lentamente lungo il campo di rilevamento completo della diapositiva con un laser potente di circa 10 mW per tutti i laser. Questa operazione richiede circa 1 h. Nota: se non diversamente specificato, il buffer utilizzato contiene 40 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl e 10mm MgCl2.</li>
	<li>A filo circa 300 µ l di una soluzione di NeutrAvidin (0,25 mg/mL in tampone) nell'alloggiamento e incubare per 1 min. Flush fuori NeutrAvidin non associato con buffer e a filo circa 300 µ l di una soluzione di BSA (0,5 mg/mL in tampone) attraverso la camera. Nota: Difetti di questo blocco restanti funzionalizzazione superficiale di adsorbimento non specifico di BSA in superficie.</li>
	<li>Immobilizzare l'esempio caricando la camera di flusso con circa 150 µ l della biotinilato ed etichettati Hsp90 alle concentrazioni aumentanti (diluite in tampone + 0,5 mg/mL BSA) fino a quando non viene raggiunta una sufficiente densità di superficie, che di solito è il caso ad una concentrazione di 5-22. Sciacquare la proteina non associata con circa 300 µ l di tampone + 0,5 mg/mL BSA.</li>
	<li>A filo in 150 µ l di 25 nM AMP-PNP * nel buffer + 0,5 mg/mL BSA. Lasciare Incubare per 5 minuti e ripetere questo passaggio una volta per garantire la concentrazione corretta del nucleotide. Nota: Per gli esperimenti in presenza di ulteriori, senza etichetta AMP-PNP, anche aggiungere 250 µM AMP-PNP.</li>
	<li>Iniziare con l'acquisizione di dati. Per una quantità appropriata di dati acquisire circa 20 film che dura circa 1,5 ore.<ol>
<li>Spostare la posizione della camera del campione perpendicolare alla trave di eccitazione con un piezo stepper per modificare il campo visivo.</li>
		<li>Regolare la messa a fuoco con il z-piezo che controlla l'altezza dell'obiettivo, se necessario. Questo non dovrebbe essere necessario troppo spesso quando la camera di misura è montata senza inclinazione.</li>
		<li>Preparare la registrazione delle telecamere premendo < prendere segnale > il software della fotocamera e iniziare i cicli di eccitazione/acquisizione utilizzando il pulsante < Start > nel software trigger. Verrà avviata l'acquisizione dell'intensità di fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prima registrazione di un filmato con perline fluorescenti che mostrano l'emissione di fluorescenza nell'intervallo spettrale di tutti i canali di rilevamento del programma di installazione per eseguire una registrazione del canale. Quindi, rilevare posizioni della perla nel film calibrazione ricercando le macchie brillanti e determinare che la posizione centrale da una gaussiana adatta per il profilo di intensità. Salvare le coordinate di perle che si trovano in tutti i canali e montare entrambi l'offset di mappatura in x - e y-direzione con un 2D polinomio di grado tre9.</li>
</ol>3. selezione di tracce di singola molecola
<ol><li>Analisi dei dati avviene con in-House scripts utilizzando Igor Pro. Caricare tutti gli script necessari con l'apertura di "iniTIRF.ipf" e selezionare il corretto tipo di esperimento. Nota: In seguito, < Button > specifica di elementi selezionabili nel menu o l'interfaccia utente. Chiamate di funzione sono indicate tra virgolette, ad esempio, "Print"Hello World"". Questi comandi possono essere incollati alla riga di comando di Igor Pro (senza le virgolette che lo contiene).</li>
	<li>Assicurarsi che i parametri per la registrazione del canale di rilevamento vengono caricati.</li>
	<li>Avviare l'interfaccia grafica facendo clic su < smFRET nuovo | Analisi GUI >.</li>
	<li>Caricare i film (cioè, la sequenza di fotogrammi con 512 x 512 pixel archiviati come pile TIFF a 16 bit) che tengono l'intensità nei rispettivi canali. Eseguire questa operazione premendo il pulsante < carico Film > e selezionando i file dal cosiddetto "Maestro" e "slave" telecamere uno dopo l'altro.</li>
	<li>Identificare le posizioni di potenziale singole molecole tramite la ricerca per le macchie più brillanti nella somma dei primi cinque fotogrammi in un certo canale di rilevamento. Calcolare le posizioni corrispondenti in tutti gli altri canali di rilevamento dalla mappatura canale. Per ottenere la traccia di intensità di fluorescenza, sommare l'intensità di un quadrato di pixel intorno alla posizione centrale per ogni fotogramma. Eseguire questa operazione premendo il pulsante < trovare tracce > nella GUI. Nota: La lunghezza del lato del quadrato (in pixel) è dato da: 2 * < somma Pxs > + 1.</li>
	<li>Per ogni molecola, è necessario calcolare una traccia comune intensità prima come la somma di tutte le tracce di questo posto con lo stesso colore di eccitazione. Valutare il profilo di intensità della molecola in tutti i canali per i seguenti criteri:<ol>
<li>Un grosso modo piatto altopiano dell'intensità di crudo misto e una decolorazione singolo passo per tutti i colori di eccitazione, anticorrelated comportamento nei canali di rilevamento, rilevamento della fluorescenza rossa (che indica FRET per un associato AMP-PNP *) almeno una volta all'interno del traccia e non più passaggi nella fluorescenza rossa, che indicherebbe la presenza di due AMP-PNP * associato a un dimero di Hsp90.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se questi criteri sono soddisfatti, salvare le tracce di fluorescenza dello spot per ulteriori analisi. Fare questo selezionando la traccia con il cursore e premendo il pulsante < Salva > nel grafico "timeline". Controllare manualmente le tracce di intensità in tutti i tre canali di rilevamento dopo l'eccitazione blu per circa 200 molecole per il film.</li>
</ol>4. calcolo delle tracce parziali di fluorescenza
<ol><li>Visualizzare tutte le tracce di intensità di fluorescenza per una delle molecole salvate. Utilizzare i cursori nel grafico per selezionare intervalli di tempo.</li>
	<li>Selezionare un intervallo di tempo in cui tutti i fluorofori sono sbiancati già. L'intensità media sfondo viene calcolato da questa gamma e sottratto la traccia di intensità in ogni canale. Fare questo premendo il pulsante < sfondo >.</li>
	<li>Selezionare l'intervallo di efficienza FRET, dove almeno entrambi i coloranti attaccati al Hsp90 (Atto488 e Atto550) sono presenti. Assicurarsi di escludere le tracce che contengono un evento lampeggio (Vedi Figura 3B). Questi eventi sono caratterizzati da un'intensità di fluorescenza di drop-in un canale senza un accompagnamento aumento in qualsiasi altro canale.</li>
	<li>Calcolare le tracce PF . Eseguire questa operazione premendo il pulsante < PF Calc >. I fattori di correzione predefinite di apparente perdita (LC) e gamma apparente (ag) vengono applicati all'intensità crudo per correggere foto-fisiche e proprietà di installazione.</li>
</ol>5. popolazione selezione e montaggio di istogramma 3D
<ol><li>Rimuovere le molecole che mostrano un rapporto segnale-rumore basso nelle tracce PF . Molecole che superano l'intervallo [-1; 2] in qualsiasi traccia PF per oltre il 10% dei fotogrammi vengono rimosse dal set di dati. Fare questo mediante l'esecuzione di "RemoveTracesLowSNR()" dalla finestra di comando.</li>
	<li>Calcolare le proiezioni 2D binned dei dati PF . Trama <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq12.jpg"> </img>sopra <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq13v2.jpg"> e <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq14.jpg"> sul <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq13v2.jpg"> nell'intervallo [-0,5; 1,5] con una risoluzione di 100 x 100 bidoni. A tale scopo, eseguire:<ol>
<li>"HistFret2D ("r_b","r_g", binHist = 100)"</li>
		<li>"HistFret2D ("r_b","g_b", binHist = 100); MoveWindow 553,5, 42.5, 1055.25, 508,25"</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare la relativa popolazione di ogni stato distinguibile nelle proiezioni 2D.<ol>
<li>Portare in primo piano il grafico appropriato ed eseguire "panelHist2DCount()".</li>
		<li>Premere il tasto < Init > e disegnare un poligono a mano libera intorno alla vetta.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante < Count >. Il numero di punti dati nel poligono e il numero totale di punti dati nella proiezione vengono stampati nella finestra di comando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare un istogramma 3D dei dati PF eseguendo "HistFret3D ("g_b","r_b","r_g")".</li>
	<li>Normalizzare l'istogramma 3D per un integrale di 1. Eseguire le seguenti operazioni:<ol>
<li>"NewDataFolder/S fit0"</li>
		<li>"Duplicato/O:: FRET: Hist3D, Hist3D"</li>
		<li>"Variabile /G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3"</li>
		<li>"Hist3D = div; Stampa div"</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fornire parametri iniziali per la gaussiana 3D fit e preparano le strutture dei dati necessarie.<ol>
<li>Eseguire "Gauss3D_initParam(); modificare W_coef_old."</li>
		<li>Aggiungere le popolazioni dello stato alla fine del vettore parametro.</li>
		<li>Eseguire "Gauss3D_prepareFit()." Nota: W_coef_old è un vettore che contiene i parametri iniziali per la vestibilità. Questo significa che per ogni stato <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq15.jpg"> e la popolazione dello stato, che è concatenata alla fine del vettore. Assicurarsi che la matrice di covarianza è simmetrica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misura la somma di S 3D gaussiana funzioni per l'istogramma 3D di PF , con S il numero di stati distinguibili.<ol>
<li>Eseguire "do3D()." Questo può richiedere un'ora o più su un normale ufficio PC, a seconda della qualità dei parametri iniziali.</li>
		<li>Eseguire "postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); modificare W_coef."</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizzare il risultato in forma. Per ognuna delle due proiezioni 2D, utilizzare i seguenti comandi:<ol>
<li>"contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)"</li>
		<li>"contourPF3D_colorize()"</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. analisi cinetica con 3D Ensemble HMM
<ol><li>Preparare un ensemble HMM eseguire per estrarre le informazioni cinetiche. Un HMM è ottimizzato da tutte le molecole nel set di dati. Utilizzare le informazioni ottenute nel passaggio precedente per definire la posizione e la larghezza di ogni stato nello spazio 3D PF .<ol>
<li>Inizializzare l'interfaccia di utente HMM (< HMM | Init HMM >) e scegliere il numero appropriato di Stati (nel caso i dati di Hsp90 questo significa < NumStates > = 5), il numero di dimensioni del segnale in ingresso (< NumDims > = 3) e il tipo di input (< Input Type > = "FRET bgr 3D").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ottimizzare i parametri del HMM lasciando il software convergono la probabilità che il HMM (eseguire "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14)") fino a quando il cambiamento nella matrice di transizione rispetto all'iterazione precedente scende sotto una soglia (10 -14 di per la somma della variazione assoluta per ogni probabilità di transizione). Questo produce la MLE per le probabilità di transizione in circa un'ora su un normale PC in ufficio.</li>
	<li>Ripetere la selezione della popolazione, raccordo gaussiana e l'ottimizzazione di HMM per sottoinsiemi di dati (ad esempio, il 75% del set di dati completo). Se il set di dati completo è stata fusa da diversi esperimenti, ripetere l'ottimizzazione anche per ciascuno dei singoli esperimenti. Analisi di sottogruppi permette di stimare l'incertezza della selezione manuale della popolazione e la variabilità all'interno del set di dati.</li>
	<li>Calcolare l'IC per le probabilità di transizione, che una relazione sull'eterogeneità di set di dati e la precisione dell'eh.<ol>
<li>Ottenere una stima approssimativa dei limiti CI eseguendo "cd $(radice: path3Dimport +"HMM"); loop_getCI_estimate_limits()."</li>
		<li>Calcolare i limiti esatti dell'IC eseguendo:</li>
		<li>"loop_getCI_HMM_converge(1)"</li>
		<li>"CIresults_conv_new()"</li>
		<li>"cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv()"</li>
		<li>"cd:: cmp_CI_conv; CI_plot2 ("HMM", doAppend = 0) "</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condensare le informazioni cinetiche disponibili per semplificare l'interpretazione.<ol>
<li>Raccogliere informazioni sul tempo, un nucleotide con etichettato rimane associato a Hsp90. Fare questo comprimendo gli Stati associati a AMP-PNP * (cioè, S1, S2 e S3, vedi anche Figura 2) e compilare l'istogramma del tempo di permanenza. Eseguire "cd $(radice: path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ", che combina la dimora di dichiara S0 e S4 così come S1, S2e S3.</li>
		<li>Estrarre i tempi di permanenza dal percorso di Viterbi per ciascuno stato di interesse e confrontare l'istogramma risultante di tempo di permanenza per diverse condizioni sperimentali. Eseguire "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."</li>
		<li>Per un quadro più dettagliato, crollo degli Stati che hanno distinto PF ma sono funzionalmente identici per facilitare l'ulteriore analisi dei dati, ad esempio, nel caso di un esperimento a tre colori con Hsp90 con etichetta e del nucleotide, Stati S2 e S 3 può essere compresso. Eseguire "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Vi presentiamo la procedura sperimentale per ottenere dati di smFRET tre colori per un sistema complesso della proteina e una descrizione dettagliata dell'analisi di queste misurazioni. Questo approccio offre la possibilità unica di valutare direttamente la correlazione tra più siti di interazione o cambiamenti conformazionali.
Al fine di ottenere dati di singola molecola multi-colori adatti sulle proteine è importante eseguire misurazioni riproducibili a un livello basso rumore. Ciò può ...

Molte proteine assolvere la loro funzione in dinamici complessi con altre molecole, mediati dai cambiamenti conformazionali e transitorie associazioni su una vasta gamma di scale cronologiche1,2,3. Accoppiato ad una fonte di energia esterna (ad es., ATP) queste interazioni dinamiche possono portare alla direzionalità in un ciclo funzionale e, infine, mantenere il non-equilibrio stazionario in una cella, il prerequisito per la vita.
Al fine di comprendere appieno queste macchine molecolari, una descrizione statica guidata da studi strutturali non è sufficiente. Inoltre, è essenziale avere conoscenza del modello cinetico e per determinare le costanti cinetiche tasso. Diversi metodi esistenti consentono ai ricercatori di studiare le dinamiche delle interazioni binarie tra due molecole di interesse, ad esempio, la risonanza plasmonica di superficie, metodi di rilassamento con una lettura spettroscopica (ad es., salto o flusso interrotto tecniche) e risonanza magnetica nucleare. Tuttavia, la loro applicabilità è nella maggior parte dei casi limitati a semplici sistemi di due stati (ad esempio, un limite e uno stato non associato) a causa della media inerente agli esperimenti di massa. Nei casi in cui siano coinvolti più Stati o intermedi, cedono solo una miscela complessa delle costanti di tasso. Metodi di singola molecola come pinzette ottiche o magnetiche o due colori smFRET, cioè, un donatore e un fluoroforo accettore, con un campione di superficie-immobilizzata possono recuperare le costanti di velocità per tutti osservati cambiamenti conformazionali. Tuttavia, quando si tratta di interazioni che interessano più di un binding sito, questi metodi rimangono limitati e le informazioni sulle interazioni possibili correlazioni di due (o più) saranno sempre accessibili via indirette conclusioni da una serie di esperimenti.
Multi-colore smFRET4,5,6,7,8,9 offre l'opportunità di studiare l'interazione tra questi componenti direttamente, in tempo reale e sotto condizioni quasi-fisiologiche10. Questo permette di indagare, ad esempio, l'associazione dipendente dalla conformazione di un ligando o di un'altra proteina8,9,11. L'approccio globale presentato qui è per etichettare la proteina di interesse alle posizioni specifiche, per allegare una proteina alla superficie della camera di misura e per monitorare l'intensità di fluorescenza nel tempo su un TIRFM di tipo a prisma (per dettagli Vedi 9 , 12). la prossimità spaziale delle tinture diverse quindi può essere determinata dal trasferimento di energia tra di loro. Strategie di etichettatura può variare da proteina a proteina (rivisto in 13) ed esistono linee guida per evitare artefatti nelle misure smFRET14.
Poiché un colorante donatore può trasferire energia al ricettore diversi coloranti in un esperimento di smFRET multi-colore, la posizione relativa di tutti i coloranti non è accessibile dall'eccitazione di uno tintura solo15,16. Ma in combinazione con alternanza di eccitazione laser (ALEX17e ha commentato in 18) questo metodo fornisce tutte le informazioni spazio-temporali a frazioni di secondo e risoluzione sub-nanometrica.
In linea di principio, ad alta risoluzione informazioni strutturali possono essere ottenute utilizzando le distanze di Inter-tintura calcolato dalla combinazione di tutte le intensità di fluorescenza in un esperimento di smFRET multi-colore con ALEX. Tuttavia, qui ci concentriamo sulla identificazione dello stato e separazione così come l'estrazione di modelli cinetici, dove è indispensabile smFRET multi-colore. Quando "solo" determinazione della struttura di triangolazione è voluta, una serie di esperimenti di smFRET di due colori più semplice con alto rapporto segnale-rumore può essere eseguita12,19.
Usiamo la fluorescenza parziale (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) come un proxy per il trasferimento di energia tra due fluorofori7. Il PF è calcolato dall'intensità di fluorescenza analoga per l'efficienza FRET di un esperimento di due colori:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
Dove, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> è l'intensità di emissione canale em dopo l'eccitazione con colore ex, e c è il ricettore con la lunghezza d'onda più lunga. Canali di rilevazione rappresentano la stessa posizione nella camera del campione ma registrare diversi campi di spettro della luce di fluorescenza. Lo stesso identificatore per eccitazione e di emissione sono utilizzati nel presente protocollo (cioè, "blu", "verde" e "rosso").
A causa delle carenze sperimentali le intensità di fluorescenza misurata dipendono non solo sul trasferimento di energia, ma anche sulle proprietà fluoroforo e installazione. Per ottenere l'efficienza di trasferimento di vera energia tra due fluorofori, le intensità misurate devono essere corretto. La procedura seguente si basa sul riferimento9. Fattori di correzione per perdita apparente (LC, vale a dire, la rilevazione di fotoni da un fluoroforo in un canale destinata per un altro colorante) e gamma apparente (ag, vale a dire, il rendimento quantico di fluorescenza del colorante e la efficienza di rivelazione del canale) sono ottenuti da tracce di singola molecola che mostrano un accettore candeggio evento.
La dispersione del colorante donatore in ogni canale possibile acceptor viene calcolata da tutti i punti dati dalle tracce di fluorescenza registrata dove l'accettore sbiancato ma il donatore è ancora fluorescente (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
La mediana dell'istogramma perdita viene utilizzata come il fattore di perdita apparente. Dopo la correzione per la perdita, il fattore gamma apparente è determinato dallo stesso insieme di tracce. Viene calcolato dividendo il cambiamento di fluorescenza nel canale ricettore dal cambiamento di fluorescenza nel canale donatore con lo sbiancamento del colorante accettore:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
Dove c è ancora una volta il canale di rilevamento per il ricettore con la lunghezza d'onda più lunga. La mediana della distribuzione risultante viene utilizzata come il fattore di correzione apparente.
La corretta intensità in ciascun canale sono stati ottenuti da:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
Il PF è quindi calcolato in base alla:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
Diverse popolazioni possono essere separati nello spazio multi-dimensionale, attraversato dal s PF. La posizione e la larghezza di ogni stato è determinata inserendo i dati con funzioni gaussiane multi-dimensionale. Successiva ottimizzazione di uno eh globale basato su tutte le tracce PF fornisce una descrizione quantitativa della cinetica osservata. Anche piccoli cambiamenti delle tariffe sono rilevabili.
HMMs consentono di dedurre un modello di stato da una raccolta di tracce tempo rumoroso. Il sistema è considerato di essere in uno di una serie di discreti, stati nascosti in qualsiasi dato momento e l'effettiva osservazione (cioè, l'emissione) è una funzione probabilistica di questo stato nascosto20. Nel caso di dati di smFRET TIRFM, l'emissione probabilità bio a stato possono essere modellati da funzioni di densità di probabilità gaussiana continuo. A intervalli di tempo discreti regolarmente spaziati, le transizioni da uno a un altro stato possono verificarsi secondo la probabilità di transizione che è tempo-invariante e dipende solo dallo stato corrente. La matrice di transizione A contiene queste probabilità di transizione unij tra tutti gli stati nascosti. La distribuzione di stato iniziale <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> dà le probabilità relative allo stato <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> per il primo punto di tempo di una traccia di tempo. Utilizzando un approccio di massima verosimiglianza, questi parametri possono essere ottimizzati per meglio descrivere i dati con l'avanti-indietro e Baum-Welch algoritmi20,21. Questo produce gli stimatori di massima verosimiglianza (MLE). Infine, la sequenza di stato che più probabilmente prodotta la traiettoria delle osservazioni può essere dedotta con l'algoritmo di Viterbi. A differenza di altre analisi HMM del smFRET dati24,25,26 non usiamo il HMM come una mera "smoothing" dei dati ma il modello di stato cinetico l'Estratto dal set di dati senza la necessità per il montaggio di tempo di permanenza istogrammi27. Analisi HMM sono fatto con in-House scripts utilizzando Igor Pro. Implementazione del codice si basa su riferimento21. Forniamo un kit di software e dati esemplari sulla nostra pagina Web per seguire le sezioni 5 e 6 del presente protocollo (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Software completo è disponibile su richiesta.
Tempo punti nei dati con PF < -1 o PF > 2 in qualsiasi canale di rilevamento sono assegnate la probabilità di emissione minima per tutti gli Stati (10-200). Questo previene le transizioni artificiale in questi punti di dati.
I parametri per la probabilità di emissione sono ottenuti dal fit dell'istogramma 3D PF con funzioni gaussiane come descritto al punto 5.7. Questi parametri sono tenuti fissi durante l'ottimizzazione dell'eh.
Nell'approccio presentato, il vettore di distribuzione stato iniziale e la matrice di transizione vengono utilizzati globalmente per descrivere l'intero ensemble di tracce. Essi vengono aggiornati basato su tutti i N molecole dal set di dati secondo riferimento27.
Parametri di avvio per la distribuzione di stato iniziale sono determinati dalle proiezioni 2D dell'istogramma PF (punto 5.3) e le probabilità di transizione sono riportate a 0,05 fatta eccezione per le probabilità di rimanere nello stesso stato, che sono scelti tali che la probabilità di lasciare un certo stato viene normalizzata all'unità.
Un metodo di analisi di probabilità viene utilizzato per dare gli intervalli di confidenza (CIs) per tutte le transizione tariffe21,22, che servono come stime significative per loro incertezza. Per calcolare i limiti dell'IC per un tasso specifico, la probabilità di transizione di interesse è fissata su un valore diverso dal MLE. Questo produce la prova modello λ'. Un test di ratio (LR) probabilità del rischio <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> dato il set di dati 0 viene eseguita secondo:
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
Il 95% di confidenza associato per il parametro è raggiunto quando LR supera 3.841, il quantile 95% di un X2-distribuzione con un grado di libertà22,23.
Il potere del metodo è dimostrato utilizzando la Hsp90. Questa proteina abbondante è trovata nei batteri e negli eucarioti ed è parte della risposta stress cellulare28. È un promettente bersaglio di farmaci nel trattamento di cancro29. Hsp90 è un omodimero con una tasca di legame del nucleotide nel dominio N-terminale di ogni subunità30. Può subire transizioni tra almeno due conformazioni globalmente distinti, uno chiuso e uno N-terminale a forma di V aperta, conformazione19,31,32. La natura dimerica direttamente solleva il problema dell'interazione tra i due siti di legame del nucleotide in Hsp90.
Di seguito, forniamo un protocollo passo-passo per l'acquisizione dati e l'analisi di un esperimento di tre colori smFRET il lievito Hsp90 e del nucleotide. L'associazione dipendente dalla conformazione di fluorescente contrassegnati AMP-PNP (AMP-PNP *, un analogo non hydrolyzable dell'ATP) viene analizzato. L'applicazione della procedura descritta permette lo studio di associazione del nucleotide e allo stesso tempo i cambiamenti conformazionali di Hsp90 e quindi rivela la cooperatività tra le due tasche di associazione del nucleotide di Hsp90.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vibration-damped optical table&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Newport, Irvine, CA, USA</td><td>RS2000</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 473nm LX 75mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1185052</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 532nm LS 50mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1261779</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 594nm LS 60mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1233470</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 637nm LX 140mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1196625</td><td></td></tr><tr><td>laser control unit</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1234465</td><td>Scientific Remote</td></tr><tr><td>aspheric telescope lenses</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td></tr><tr><td>CF ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 473/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 532/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 594/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex4</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>FL635-10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>DM ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZQ594RDC</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>DM ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>570DCXR</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>DM ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZQ491RDC</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>AOTFnC-Vis</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;lambda;/4 plate</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td></td><td>high-NA objective</td></tr><tr><td>piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td><td>piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td></tr><tr><td>piezo stepper</td><td>Newport, Irvine, CA, USA</td><td>PZA12</td><td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td></tr><tr><td>achromatic aspheric lenses</td><td>Qioptiq Photonics GmbH &amp;amp; Co. KG, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>G322-304-000</td><td>d=50mm, f=200mm</td></tr><tr><td>adjustable optical slit</td><td>Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td><td>27.160.1212</td><td>max. aperture 12 x 12 mm</td></tr><tr><td>DM det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>T 600 LPXR</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>H 560 LPXR superflat</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>HC BS R635</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>BP det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>525/40 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>586/20 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>631/36 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det4</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>700/75 ET Bandpass</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>optical shutters detection</td><td>Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td><td>Uniblitz VS25S2T0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>digital I/O card, PCIe-6535</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syringe pump</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>PHD22/2000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flow chamber&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>quartz slides</td><td>G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Spectrosil2000, h=3mm</td></tr><tr><td>TEGADERM film</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>1626W</td><td>10 x 12cm</td></tr><tr><td>spray adhesive</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>Photo Mount 050777</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td>Immersol G</td><td></td></tr><tr><td>immersion oil</td><td>OLYMPUS EUROPA SE &amp;amp; CO. KG, Hamburg, Germany</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>prism</td><td>Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td><td></td><td>Suprasil1</td></tr><tr><td>aluminium prism holder</td><td></td><td></td><td>custom built</td></tr><tr><td>hollow setscrews</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>with custom drilling</td></tr><tr><td>Tygon S3 E-3603 tubing</td><td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>2-4450</td><td>ACF00001</td></tr><tr><td>PTFE tubing</td><td>Bohlender GmbH, Gr&amp;uuml;nsfeld, Germany</td><td>S1810-08</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sample&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td><td></td><td></td><td>UniProt ID P02829</td></tr><tr><td>Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td><td>ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP*</td><td>Jena Bioscience, Jena, Germany</td><td></td><td>&amp;gamma;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td></tr><tr><td>Fluospheres</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>F8764</td><td>amine-modified, 0.2 &amp;mu;m, yellow-green fluorescent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td>version 4.30</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td></tr><tr><td>MDS control software</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td>version 2.03a</td></tr><tr><td>Coherent Connection</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>version 3</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td><td></td><td>version 6.37</td></tr></tbody></table>

using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions

Trasferimento di energia di risonanza di singola molecola Förster (smFRET) è diventata una tecnica ampiamente utilizzata biofisica per studiare la dinamica delle biomolecole. Per molte macchine molecolari in una proteine delle cellule devono agire insieme ai partner di interazione in un ciclo funzionale per adempiere il loro compito. L'estensione di due colori di multi-colore smFRET permette di sondare contemporaneamente più di una interazione o cambiamento conformazionale. Questo non solo aggiunge una nuova dimensione agli esperimenti di smFRET, ma offre anche la possibilità di studiare direttamente la sequenza di eventi e di rilevare interazioni correlate quando si utilizza un campione immobilizzato ed una fluorescenza di riflessione interna totale microscopio (TIRFM). Di conseguenza, multi-colore smFRET è un versatile strumento per lo studio biomolecolare complessi in maniera quantitativa e dettagliatamente in precedenza irraggiungibili.
Qui, dimostriamo come superare le sfide speciali di multi-colore smFRET esperimenti sulle proteine. Vi presentiamo protocolli dettagliati per ottenere i dati e per l'estrazione di informazioni cinetiche. Questo include i criteri di selezione traccia, separazione di stato e il recupero delle traiettorie di stato dai dati rumorosi utilizzando un ensemble 3D modello di Markov nascosto (HMM). Rispetto ad altri metodi, le informazioni cinetiche non viene recuperate da istogrammi di tempo di permanenza, ma direttamente dall'HMM. Il quadro di massima verosimiglianza ci permette di valutare criticamente il modello cinetico e fornire significative incertezze per le tariffe.
Applicando il nostro metodo per la proteina di scossa di calore 90 (Hsp90), siamo in grado di districarsi tra l'associazione del nucleotide e globali cambiamenti conformazionali della proteina. Questo ci permette di osservare direttamente la cooperatività tra le due tasche di associazione del nucleotide del dimero Hsp90.

Multi-colore smFRET misure permettono la rilevazione diretta di correlazione tra due o più siti di interazione distinte. Questo rende la tecnica unica per studiare sistemi multi-componenti, ad esempio complessi proteici. Ci concentriamo sulla presentazione di un esperimento di tre colori smFRET qui, che serve come un esempio illustrativo.
Il flusso di lavoro generale del metodo è illustrato nella Figura 1<...

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Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando tre colori singola molecola FRET per studiare la correlazione delle interazioni della proteina

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere dati di tre colori smFRET e la sua analisi con un ensemble 3D modello di Markov nascosto. Con questo approccio, gli scienziati possono estrarre informazioni cinetiche da sistemi proteici complessi, tra cui il cooperativity o interazioni correlate.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K Views.  University of Freiburg. Qui, presentiamo un protocollo per ottenere dati di tre colori smFRET e la sua analisi con un ensemble 3D modello di Markov nascosto. Con questo approccio, gli scienziati possono estrarre informazioni cinetiche da sistemi proteici complessi, tra cui il cooperativity o interazioni correlate.

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Ricerca

Biochimica

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Bioingegneria

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Biologia

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Analisi spaziotemporale bidimensionale automatizzata di sonde FRET mobili a singola molecola

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

Misurazioni FLIM-FRET delle interazioni proteina-proteina nei batteri vivi.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

Determinazione dell'interazione tripartita tra due monomeri di un fattore di trascrizione MADS-box e una proteina sensore di calcio mediante saggio BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

Source: Dunsing, V. et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58582">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the fluctuations of fluorescence intensity.

Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'interazione delle proteine a contatto cellulare

Source: Dunsing, V. et al. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp.&#160;(2018).
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Usando tre colori singola molecola FRET per studiare la correlazione delle interazioni della proteina

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