Name: improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

我々 は特に IGBMC 動物施設のスタッフのスタッフ IGBMC 高スループット シーケンス機能、「フランス Génomique」コンソーシアム (ANR10-INBS-09-08) のメンバー、IGBMC のすべての一般的なサービスをありがちましょう。この作品は、CNRS、INSERM、AFM、リーグ国立 contre le 癌からの補助金によって支えられた、フランスの国営ラベル ANR-10-アイデックス-0002-02、Labex INRT ANR-10-アイデックス-0001-02 Investissements d'Avenir プログラムの下で ANR を通じて基金とANR-AR2GR-16-CE11-009-01。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。S.J にミニステール デ期リーグ国立 contre le 癌と ANR-AR2GR-16-CE11-009-01、V.U によって支えられらデ ラ凝った。ID は 'デフランス labellisée' リーグのナシオナル contre le がんです。

マウスは、ケアおよび実験動物の使用に関する制度のガイドラインに従い、国立動物診療ガイドライン (欧州委員会指令 86/609/CEE; に従って保たれました。フランス語令 no.87 848)。フランス国民の倫理委員会で承認されたすべてのプロシージャ。
 1 です。 筋肉組織分離 頚部転位によって <ol><li>犠牲 1 つアダルト 6 に 8 週齢マウス。Sterlise 70% エタノールで洗浄によって肢細かい点はさみと鉗子を使用して後肢の筋肉 (大腿四頭筋腓腹筋、脛骨前方) を解剖と 。
	注: 1 つのマウスの組織の約 500 mg をもたらすべきである</li>。
	<li>1 mL の小型の同種の準備に冷たい低張性バッファーを含む 2 mL 試験管に筋肉をミンチ (&#60; 2-3 mm 3) を使用して個はさみの罰金し、5-10 分のための 4 ° C でベンチ トップ アジテーターに関する振動管を残す</li>
</ol> 2。組織溶解 注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください。
<ol><li>14 mL 丸底チューブにホモジュネートを転送し、5 mL の冷たい低張性バッファー (EDTA 無料プロテアーゼ抑制剤のカクテルそして PMSF) で再懸濁します。
	<ol><li>Homogenise 14 mL の丸底チューブに 15-30 秒の緩い dounce (3 分以内 20 30 ストローク) または機械的組織ホモジナイザーを使用してみじん切りにした筋肉組織 。
		注: この段階では光学顕微鏡検査によって評価される換散の効率と追加の中断を行うことが必要な場合です</li>。
	</ol></li> <li>15 mL チューブに磨砕液を転送し、冷たい低張性バッファーを使用して 10 の mL にボリュームを埋めます。次のマウスに進む前に以下のように磨砕液を修正します</li>。
</ol> 3。固定 <ol><li>ホルムアルデヒドを最終濃度が 1% に加え、室温で 10 分間振る</li>。
	<li>固定と室温で 5-10 分間揺れを停止する各管で 0.125 M の最終的な集中にグリシンを追加します</li>。
</ol> 4。核の準備 注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください。
<ol><li>Homogenise 固定ライセート使用緩い dounce (5 〜 10 ストローク).
	<ol><li>核および細胞残骸を取得する 15 mL チューブ 1,000 x g で 4 ° C で 5 分間遠心し転送します</li>。
	</ol></li> <li>上澄みを除去し、5 mL の新鮮な低張バッファーでペレットを再懸濁します。70 μ m 携帯こし器を通って 50 mL のチューブに液をフィルターします。再濾液を 40 μ m セル ストレーナー フィルターします</li>。
	<li>は、核のペレットを取得する 4 ° C で 5 分間 15 mL チューブ 1,000 × g で遠心分離し濾液を転送します 。
	注: この段階で核することができますがすぐに超音波処理、またはスナップ乾燥ペレットとして液体窒素で凍結し、-80 に格納されている ° C</li>
</ol> 5。超音波 <ol><li>核ペレット (機械と dounce の両方の均質化のため約 50 μ L) の容積を査定するパックされた核容積の 4 回に 3 まで超音波処理バッファーでそれを再懸濁し、超音波、超音波発生装置を使用しての 4 ° C で 10-15 分の。 
	注: クロマチン (6) 下記のとおりただちに分析または凍結して格納できます-80 で ° C</li>
</ol> 6。次の超音波クロマチンのフラグメント サイズを評価する 注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください。
<ol><li>デ-架橋、クロマチンの 30 μ L を 1.5 mL の試験管に取る 5 M 20 μ L を追加し、塩化ナトリウム。500 μ L にボリュームを完了し、65 ° C で一晩インキュベートします。
	<ol><li>次の日、処理を 1 μ L, プロテイナーゼ K を (20 mg/mL 在庫)、42 ° C 実行フェノール/クロロホルム クロロホルム抽出で 1 時間 0.5 M の EDTA の 10 μ L 2 M トリス pH 6.8, および 10 μ とナトリウムの acetat の 1 つのボリュームで DNA を沈殿させるe (3 M) と 1 時間-80 ° c または-20 で一晩 100% エタノールの 2 つの容積 ° C</li>
	</ol></li> <li>13,500 x g で 15 分間、上清をデカントでの遠心分離で DNA をペレットし冷たい 70% エタノールや 5 分上清をデカント、再び遠心分離で徹底的にペレットを洗浄し、ペレットを風乾します</li>。
	<li>は、TE バッファーの元のボリューム (30 μ L) でペレットを再懸濁します。260 nm/280 nm の吸光度によって分光光度計で DNA 濃度を測定します。クロマチンのフラグメントのサイズを評価するために電気泳動を行いピペットの 1.5% の agarose のゲルの別のレーンに DNA のサイズの梯子とともに DNA の 500-1,000 ng 。
	注: フラグメント サイズは 200-500 塩基対の間にする必要があり、対応するまたは悪い-断片化されていない DNA 検出の高分子量フラグメントはないはず。クロマチン ソリューション (手順 5) の長い時間再超音波し、再分析が最適なサイズになるまで上記のようことが必要な場合です</li>。
</ol> 7。クロマチン免疫沈降 (チップ) 注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください。
早かった 1 mL のエタノールで 50% スラリーによる <ol><li>蛋白質 G ブロック セファローズ ビーズ。ペレット、ベンチトップで 1 分間 400 × g で遠心分離によるビーズ遠心 400 x g で TE バッファー遠心の 1 mL で洗いし、ワシントンを繰り返す
	<ol><li>酵母 tRNA (在庫 10 mg/mL) の 2 回目の遠心分離、BSA (株式 20 mg/mL) の 25 μ L で希釈バッファーを内蔵の 1 mL に再停止と 20 μ L 後。4 回転 (40-60 rpm) によって、少なくとも 2 h 使用する前にビーズをブロック ° C</li>
		<li>クロマチン (手順 5) の希釈 50 μ g 8 〜 10 回チップ希釈バッファーを使用しています。ブロック ビーズ スラリーの 50 μ L を追加し、4 回転 (40-60 rpm) 2 時間インキュベート ° C. 遠心済みクリア クロマチンを取得して新鮮なチューブに移転 4 ° C で 400 x g で</li>。
	</ol></li> <li>免疫沈降、一次抗体 (例えば クロマチンの 10 μ g あたり 1-2 μ g) の適切な量を追加し、4 回転で一晩インキュベート ° C 
	注: 最適な抗体の量は製造業者によって推薦されるかもしれないまたは最適な濃縮が観察されるまでさまざまな量の抗体を持つチップ qPCR を実行することによって、経験的に決定できます。蛋白質 G セファローズ可能性があります使用される抗体のサブタイプによって蛋白質 A セファローズに置き換えることも</li>。
	<li>次の日ブロック ビーズを追加し、4 回転 (40-60 rpm) で 1 時間インキュベート ° C. 遠心ビーズをペレット、上清を除去し、チップを開始する 20-30 s の 400 x g で洗うです</li>。
	<li>チップの洗浄: バッファーが次の洗浄を実行: 低塩バッファーに一度し LiCl バッファーで 2 回、高の塩バッファーで 2 回、そして TE バッファーで 2 回。
	<ol><li>4 ° c (40-60 rpm) 回転で 10 分間各洗浄を行い、ベンチトップ遠心分離機で 20-30 s の 400 × g で遠心分離によって洗うたび間ビーズをペレットします</li>。
	</ol></li> <li>溶出、削除最後の洗浄と揺れながら室温で 15 分間 (新鮮な) 250 μ L 溶出バッファーのビードを再懸濁します</li>。
	<li>遠心分離機 x g と収集新鮮なチューブで溶出液 400 で。この 2 回のステップを実行して実行・ デ ・架橋溶出液 20 μ L NaCl 5 M と 1 μ L RNase A で一晩 (10 mg/mL)、扱うプロティナーゼ K のあり、フェノール/クロロホルム クロロホルム バキューム手順 6 のように行動します</li>。
	<li>TE バッファーの 50 μ L で再懸濁します、チップの品質をチェックする標準プロトコル 15 に従ってチップ qPCR の因数を使用します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq.">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li><li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAF4,+a+subunit+of+transcription+factor+II+D,+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation.">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613 (2014).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells.">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530 (2010).</li><li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington's+disease+mice.">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li><li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo.">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).</li><li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue.">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513 (2012).</li><li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression.">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li><li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling.">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li><li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここでアダルト マウス骨格筋このクロマチンは筋線維核内転写因子結合と共有結合のヒストンの修正を検出チップ実験に適しているショーからクロマチンを準備するための新しいプロトコルについて述べる。このプロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれます。最初の dounce または機械的剪断によって実行することができます組織混乱です。機械的剪断はより速くより再現性の高い、?...

クロマチン免疫沈降 (チップ) の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) に結合し、転写を研究する選択の方法と様々 な組織における遺伝子発現のエピジェネティック制御高スループット シーケンス (チップ seq) となっています。細胞タイプ1。この技法は、ゲノムは共有結合性クロマチン修飾ヒストン バリアントの占有率、転写因子結合2,3プロファイリングできます。
培養細胞からチップを実行することが確立している哺乳類動物組織からチップのままより困難です。チップのクロマチンを準備、組織切片・細胞の種類ごとに最適化が必要ないくつかの重要な手順が含まれます。クロマチンは、培養細胞の細胞の溶解液や、原子核の次の浄化から用意できます。哺乳類ティッシュの場合効率的な換散、ホルムアルデヒド固定および核の精製は、クロマチンの最適な回復を確保するために重要です。また、その浄化の前後に核を修正するかどうかの選択は実験的に決定します。これらの障害にもかかわらず、肝臓、精巣、または脳4,5,6などの組織からチップに正常に行われています。骨格筋の場合このような物理的に抵抗力がある組織、構造タンパク質の含有量が高いと核の分離を表わすは特に困難です。この特異性を考えると、他の組織のために最適化されたプロトコルを与えない満足のいく結果骨格筋の。
ここで物理的に破壊組織、ホルムアルデヒド固定し核と超音波処理の分離を含むマウス骨格筋組織からチップ グレード クロマチンを分離するプロトコルについて述べる。様々 な転写因子や RNA ポリメラーゼ II、コバレントマテリアルのヒストンの修正7の qPCR チップとチップ seq を実行することによってこの組織からチップに適したクロマチンを準備するこの手法の有効性を示した.
この新しい技術が以前に報告されたプロトコル8時間、転写因子のゲノムのローカライゼーションの変更中に長いコラゲナーゼ消化手順を構成するよりもはるかに高速と遺伝子発現の変化が起こるかもしれない。速さを核隔離され、固定は、ここで説明する方法をより忠実にネイティブのゲノムの占有状態をキャプチャするクロマチンを準備する特に魅力的になります。また、筋肉組織からクロマチンの分離または蛋白質の抽出のための他の方法が記述されている8,9,10され選択した遺伝子、チップ seq チップ qPCR 実験用データは、それらを使用して報告されています。ここで報告メソッドは転写因子やヒストン変更チップ seq に適した、それゆえ必要があります 3/4 C や HiC クロマチン構造キャプチャ ・ アプリケーションに適しても。

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose beads</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde EM grade</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>yeast tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Blue</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Antibody</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Antibody</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Focused Ultrasonicator</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m and 40 &amp;mu;m cell strainers (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

成体マウス骨格筋構造蛋白質の含有量が高い物理的に抵抗性組織からクロマチンの準備のための効率的かつ再現性のあるプロトコルについて述べる。大人のマウスから切り裂かれた四肢の筋肉物理的、機械的均質化またはミンチと細胞ライセートのホルムアルデヒド固定前に低張性バッファー内の douncing の組み合わせによって中断されます。固定の核は機械的均質化または douncing 細胞の残骸を削除する連続ろ過のさらなるサイクルによって精製しました。精製された核は、すぐに、後の段階で凍結後する超音波に処理できます。クロマチンが効率的に超音波処理および転写因子、RNA ポリメラーゼ II、および共有結合のヒストンの修正のプロファイルによって示されているように、クロマチン免疫沈降実験に適した取得します。このプロトコルにより作製したクロマチンを使用して検出されたバインディング イベントは、主に筋線維核クロマチン繊維関連の他の衛星と血管内皮細胞からの存在にもかかわらずで行われているものです。このプロトコルはそのため成体マウスの骨格筋における遺伝子発現制御の研究に適応です。

核を分離するには、18,000 と 22,000 の rpm (材料の表を参照) で、15 または 45 s のため解剖とみじん切りにした筋肉組織の力学的均質化を行った。すべての条件で核組織破片から分けることができるが、収率は低い速度 (図 1 aB) を使用して最適です。核は、3-5 分 (図 1 aと示されていないデータ) の dounci...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

クロマチン免疫沈降による筋線維の遺伝子の規則の研究に適応した成体マウス骨格筋からクロマチンの準備のための新しいプロトコルが表示されます。

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K ビュー.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. クロマチン免疫沈降による筋線維の遺伝子の規則の研究に適応した成体マウス骨格筋からクロマチンの準備のための新しいプロトコルが表示されます。

ビデオ: Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

遺伝学

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

生化学

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

マウス四肢筋からのサテライト細胞単離とフローサイトメトリー解析

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

著者スポットライト:マウス筋幹細胞におけるCistrome解析 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&amp;RUN解析のための効率的なプロトコール

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

発生生物学

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

要約

さらに動画を探す

この動画の章

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ