Name: improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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Ringraziamo tutto il personale della struttura di sequenziamento di IGBMC elevato throughput, un membro del Consorzio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) e tutti i servizi generali di IGBMC in particolare il personale della struttura animale IGBMC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CNRS, INSERM, l'AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, i francesi dichiarano fondo attraverso l'ANR nell'ambito del programma d'Avenir Investissements etichettati ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e il ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Santiago è stata sostenuta dal Ligue Nationale contre le Cancer, ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U dal Ministère de l'enseignement et de la Recherche. ID è un 'équipe labellisée' della Ligue Nationale contre le Cancer.

topi sono stati mantenuti in conformità con le linee guida istituzionali per quanto riguarda la cura e l'uso degli animali da laboratorio e conformemente alle linee guida nazionali di cura degli animali (Commissione europea direttiva 86/609/CEE; Decreto francese n. 87-848). Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico nazionale francese.
 1. isolamento del tessuto muscolare <ol><li>sacrificio un adulto 6 a 8-settimana-vecchio mouse da dislocazione cervicale. Sterlise l'arto sciacquandolo con etanolo al 70% e sezionare i muscoli dell'arto (Gastrocnemius, Tibialis Anterior, quadricipiti) utilizzando forbici punta fine e forcipe. 
	Nota: Un mouse dovrebbe produrre circa 500 mg di tessuto.</li>
	<li>Tritare i muscoli in una provetta da 2 mL contenente 1 mL di tampone ipotonico ghiacciata ad una preparazione omogenea di piccoli (&#60; 2-3 mm 3) pezzi utilizzando bene le forbici e lasciare il tubo agitazione su un agitatore di panca superiore a 4 ° C per 5-10 min</li>
</ol> 2. Lisi del tessuto Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
<ol><li>Trasferire l'omogeneizzato in una provetta di turno-fondo 14 mL e risospendere in 5 mL di tampone ipotonico freddo (inibitore della proteasi EDTA-free cocktail e PMSF).
	<ol><li>Homogenise tessuto muscolare macinate utilizzando un lisata sciolto (20-30 colpi entro 3 min) o un omogeneizzatore meccanica del tessuto per 15-30 s in tubi di turno-fondo 14 mL. 
		Nota: L'efficienza di lisi può essere valutato in questa fase da microscopia chiara, e se necessario, possono essere eseguite ulteriori disagi.</li>
	</ol></li> <li>Trasferire l'omogeneizzato per provette da 15 mL e riempire il volume a 10 mL utilizzando buffer ipotonico freddo. Difficoltà l'omogeneizzato come descritto di seguito prima di procedere con il prossima mouse.</li>
</ol> 3. Fissazione <ol><li>aggiungere formaldeide all'1% di concentrazione finale e agitare per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M in ogni tubo per fermare la fissazione e agitare per 5-10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol> 4. Preparazione di nuclei Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
<ol><li>Homogenise la fissa lisato utilizzando un lisata sciolto (5-10 colpi).
	<ol><li>Trasferimento a un tubo da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per ottenere nuclei e detriti cellulari.</li>
	</ol></li> <li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in fresco 5 mL di tampone ipotonico. Filtrare il lisato attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta da 50 mL. Filtrare nuovamente il filtrato attraverso un colino di cella di 40 µm.</li>
	<li>Trasferire il filtrato in una provetta da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 ° C per ottenere la pallina nucleare. 
	Nota: In questa fase, i nuclei possono essere immediatamente sonicati o snap congelato come un pellet asciutto in azoto liquido e conservato a -80 ° C.</li>
</ol> 5. Sonicazione <ol><li>valutare il volume del pellet nucleare (circa 50 µ l per meccanici e lisata omogeneizzazione) e risospendere esso in tampone di sonicazione fino a 3 o 4 volte di volume nucleare ricco e trattare con ultrasuoni per 10-15 min a 4 ° C, utilizzando un sonicatore . 
	Nota: La cromatina può essere analizzata immediatamente come descritto di seguito (6) o congelata e conservata a -80 ° C.</li>
</ol> 6. Valutare la dimensione del frammento di cromatina dopo sonicazione Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
<ol><li>a de-reticolare, prendere 30 µ l di cromatina in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 20 µ l 5m NaCl. Completano il volume a 500 µ l e incubare a 65 ° C durante la notte.
	<ol><li>Il giorno successivo, eseguire un trattamento con proteinasi K di 1 µ l (20 mg/mL di brodo), 10 µ l 2 M Tris pH 6,8 e 10 µ l di EDTA 0.5 M per 1 h a estrazione di eseguire un fenolo-cloroformio/cloroformio 42 ° C. e precipitare il DNA con 1 volume di sodio acetato e (3 M) e 2 volumi di etanolo al 100% per una h a-80 ° C, o a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Pellet il DNA mediante centrifugazione a 13.500 x g per 15 min. decantare il supernatante e lavare la pallina accuratamente con etanolo 70% freddo e centrifugare nuovamente per 5 min, decantare il supernatante e asciugare all'aria il pellet.</li>
	<li>Risospendere il pellet in volume originale (30 µ l) di buffer di TE. Misurare la concentrazione di DNA allo spettrofotometro di assorbanza a 260 nm/280 nm. Pipettare 500-1.000 ng di DNA con una scaletta di formato di DNA su corsie separate di un gel di agarosio 1.5% ed eseguire l'elettroforesi per valutare la dimensione del frammento della cromatina. 
	Nota: Dimensione del frammento deve essere compresa tra 200-500 paia di basi e non ci dovrebbe essere nessun frammento rilevabile ad alto peso molecolare corrispondente a non o mal-frammentato DNA. Se necessario, la soluzione della cromatina (passo 5) può essere ri-sonicata per un tempo più lungo e quindi analizzata nuovamente come descritto sopra, fino ad ottenuta la dimensione ottimale.</li>
</ol> 7. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
<ol><li>Perle di sepharose blocco della proteina G di aliquotare 1 mL del liquame 50% in etanolo. Pellet i branelli mediante centrifugazione a 400 x g per 1 min in un benchtop centrifugare e lavare con 1 mL di TE buffer centrifuga a 400 x g e ripetere il wash.
	<ol><li>Dopo la seconda centrifugazione, risospendere in 1 mL di tampone di diluizione di ChIP con 25 µ l di BSA (stock 20 mg/mL) e 20 µ l lievito tRNA (stock 10 mg/mL). Bloccare le perline per almeno 2 h prima dell'uso di rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C.</li>
		<li>Diluire 50 µ g di cromatina (passo 5) 8-10 volte con tampone di diluizione dei ChIP. Aggiungere 50 µ l di liquami tallone bloccato e incubare per 2 h rotante (40-60 rpm) a 4 ° C. centrifuga a 400 x g a 4 ° C per ottenere pre-sgomberata cromatina e trasferirlo in una nuova provetta.</li>
	</ol></li> <li>Per immunoprecipitazione, aggiungere la quantità appropriata di anticorpo primario (ad es., 1-2 µ g / 10 µ g di cromatina) e incubare per una notte con rotazione a 4 ° C. 
	Nota: La quantità ottimale di anticorpo può essere raccomandata dal fornitore o può essere determinata empiricamente eseguendo ChIP-qPCR con diverse quantità di anticorpo fino ad arricchimento ottima è osservare. Anche proteine G sepharose può essere sostituita da proteina A sepharose a seconda del sottotipo di anticorpo usato.</li>
	<li>Aggiungere le perline bloccate il giorno successivo e incubare per 1 h con rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C. centrifuga a 400 x g per 20-30 s a pellet le perline, rimuovere il supernatante e avviare il ChIP lava.</li>
	<li>ChIP lavaggi: eseguire i seguenti lavaggi con i buffer: una volta con tampone salino di basso e poi due volte con tampone salino elevato, due volte con tampone di LiCl e infine due volte con il tampone TE.
	<ol><li>Eseguire ogni lavaggio per 10 min con rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C e pellet le perline tra ogni lavaggio mediante centrifugazione a 400 x g per 20-30 secondi in una centrifuga da banco.</li>
	</ol></li> <li>Per eluizione, rimuovere l'ultimo lavaggio e risospendere le perle in 250 µ l di tampone di eluizione (preparata) per 15 min a temperatura ambiente agitando.</li>
	<li>Centrifuga a 400 x g e raccogliere l'eluato in una nuova provetta. Eseguire questo passaggio due volte e quindi de-crosslink l'eluato durante la notte con 20 µ l NaCl 5 M e 1 µ l della RNasi A (10 mg/mL), trattare con proteinasi K e cloroformio/del fenolo-cloroformio extragire come nel passaggio 6.</li>
	<li>Risospendere in 50 µ l di buffer di TE e utilizzare le aliquote per ChIP-qPCR secondo protocolli standard 15 per controllare la qualità del ChIP.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq.">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li><li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAF4,+a+subunit+of+transcription+factor+II+D,+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation.">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613 (2014).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells.">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530 (2010).</li><li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington's+disease+mice.">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li><li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo.">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression.">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li><li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling.">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li><li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Qui descriviamo un romanzo protocollo per la preparazione della cromatina da muscoli scheletrici topo adulto e dimostrano che la cromatina è adatta per gli esperimenti di ChIP che rilevano associazione di fattore di trascrizione e modificazioni istoniche covalente nei nuclei della fibra di muscolo. Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la rottura del tessuto che possa essere eseguita mediante lisata o tosatura meccanica. Cesoia meccanica è più veloce e più riproducibile e pertanto è il meto...

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e sequenziamento ad alta (ChIP-seq) sono diventati i metodi di scelta per lo studio di trascrizione e regolazione epigenetica dell'espressione genica in vari tessuti e tipi di cellule1. Questa tecnica permette di genoma profilatura di modificazioni covalenti della cromatina, occupazione variante dell'istone e fattore di trascrizione associazione2,3.
Mentre l'esecuzione di ChIP da cellule coltivate è ben consolidata, ChIP da tessuti di mammiferi rimane più impegnativo. Preparazione della cromatina per ChIP prevede diversi passaggi critici che devono essere ottimizzate per ogni tipo di tessuti e cellule. Cromatina può essere preparata da lisati cellulari delle cellule coltivate o seguente purificazione dei loro nuclei. Nel caso di tessuti di mammiferi, efficiente Lisi, fissazione di formaldeide e purificazione dei nuclei sono fondamentali al fine di garantire un recupero ottimale della cromatina. Inoltre, la scelta se risolvere i nuclei prima o dopo la loro purificazione deve essere determinato sperimentalmente. Nonostante questi ostacoli, il ChIP è stato eseguito con successo da tessuti quali fegato, testicolo o cervello4,5,6. Nel caso del muscolo scheletrico, la rottura di un tessuto resistente fisicamente, che esibisce un alto contenuto di proteine strutturali e l'isolamento dei suoi nuclei è particolarmente impegnativa. Data questa specificità, protocolli ottimizzati per altri tessuti non danno risultati soddisfacenti per i muscoli scheletrici.
Qui descriviamo un protocollo per isolare la cromatina ChIP-grado da tessuto muscolare scheletrico del mouse che coinvolge fisicamente interrompendo il tessuto, fissazione di formaldeide e quindi l'isolamento dei nuclei e sonicazione. L'efficienza di questo metodo per preparare cromatina adatta per ChIP da questo tessuto è stato dimostrato eseguendo ChIP-qPCR e ChIP-seq per vari fattori di trascrizione, RNA polimerasi II e istone covalente modifiche7.
Questa nuova tecnica è molto più veloce di un protocollo precedentemente segnalati8 composto da lunghi passaggi di digestione della collagenosi durante i quali, cambiamenti nella localizzazione genomica dei fattori di trascrizione e le alterazioni nell'espressione genica possono aver luogo. La rapidità con cui i nuclei sono isolati e fissa rende particolarmente attraente per preparare della cromatina che cattura più fedelmente lo stato nativo occupazione genomico il metodo qui descritto. Inoltre, anche se hanno altri metodi per l'estrazione di isolamento o proteine della cromatina da tessuto muscolare sono stato descritto8,9,10 e utilizzato per esperimenti di ChIP-qPCR su geni selezionati, nessun ChIP-seq dati sono stati segnalati li utilizzano. Il metodo segnalato qui è adatto per la modifica di fattore e istone trascrizione ChIP-seq e quindi dovrebbe anche essere adatto per 3 / 4C o applicazioni di acquisizione di HiC cromatina conformazione.

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose beads</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde EM grade</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>yeast tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Blue</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Antibody</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Antibody</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Focused Ultrasonicator</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m and 40 &amp;mu;m cell strainers (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

Descriviamo un protocollo efficiente e riproducibile per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico di topo adulto, un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Muscoli degli arti sezionati da topi adulti fisicamente sono interrotte da omogeneizzazione meccanica, o una combinazione di macinazione e douncing, in un buffer ipotonico prima della fissazione della formaldeide del lysate delle cellule. I nuclei fissi sono purificati da ulteriori cicli di omogeneizzazione meccanica o douncing e filtrazioni sequenziale per rimuovere i detriti cellulari. I nuclei purificati possono essere sonicati immediatamente o in una fase successiva dopo il congelamento. La cromatina può essere sonicata in modo efficiente ed è adatto per esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina, come illustrato dai profili ottenuto per fattori di trascrizione, la RNA polimerasi II e modificazioni istoniche covalente. L'associazione di eventi rilevati utilizzando la cromatina preparata dal presente protocollo è principalmente quelli che si svolgono nei nuclei della fibra di muscolo nonostante la presenza di cromatina da altro satellite fibra-collegato e cellule endoteliali. Questo protocollo è pertanto adattato per studiare la regolazione genica in muscolo scheletrico del topo adulto.

Per isolare i nuclei, abbiamo effettuato omogeneizzazione meccanica del tessuto del muscolo dissecato e macinate per s o 15 o 45, a 18.000 e 22.000 giri/min (Vedi Tabella materiali). In tutte le condizioni, i nuclei hanno potevano essere separati dai detriti dei tessuti, ma la resa è stata ottima usando la velocità più bassa (Figura 1A-B). I nuclei potrebbero anche essere preparati da douncing per 3-5 min (<strong class="x...

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico

Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l&#39;immunoprecipitazione cromatina

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Biochimica

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Isolamento di cellule satelliti dai muscoli degli arti di topo e analisi della citometria a flusso

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

Autore in primo piano: Analisi della Cistrome nelle cellule staminali muscolari di topo 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&amp;RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Biologia dello sviluppo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l'immunoprecipitazione cromatina

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo