Name: a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
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私たちはQuinnipiac UniversityのKellerとMagie Labsのメンバー全員に有益な提案をいただき、ありがとうございます。特に、Keller Lab内でこの損傷アッセイを開発したBarron L. Lincoln IIに感謝したいと思います。 LC Kellerに授与されたQuinnipiac University of Arts and Science Grant-In-Aidにも感謝したいと思います。

1.試薬および装置の準備<ol><li> 1X解離緩衝液を調製する（70のNaCl、5mMのKCl、0.02mMのCaCl 2を、20mMのMgCl 2を 、10mMのNaHCO 3を、115 mMスクロース、5 mMのトレハロース、5mMのHEPES、pHは7.2）。 </li><li> 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製する。 </li><li> 0.01％Triton X-100を含む1x PBSを使用して1x PBTを調製します。 </li><li>フルーツジュース寒天プレートを準備する。 14簡潔には、H 2 O 700mLおよびオートクレーブ中で寒天30gを混合する。メチルパラベン0.5gをエタノール10mLに溶解し、果汁濃縮物（ブドウまたはリンゴ）300mLに添加する。濃縮物をオートクレーブ寒天溶液に混合し、10mm×35mmペトリ皿の蓋に注ぐ。 注：ブドウ寒天培地プレミックスは、さまざまな企業から購入することもできます（ 材料表を参照）。 </li><li>幼虫を機械的に傷つけることを可能にするサイズ5の鉗子を得る。 </li><li>標準的なショウジョウバエの CO 2を使用する</s麻酔に基づく麻酔装置。 </li></ol> 2. ショウジョウバエの幼虫の選択<ol><li> 25℃で培養した放浪している3齢幼虫を含むショウジョウバエのバイアルまたはボトルを取る。 </li><li>外観に基づいて10個の個々の2 番目または3 番目の幼虫を選択する。第3齢幼虫は、前枝の奇形の出現によって識別することができ、第2齢幼虫はより小さく、よりクラブ様の前棘を有する。 注：幼虫の段階は、タイミングによっても識別することができます。 25℃で、第2齢幼虫は孵化後約48時間後に現れ、第3齢幼虫は約24時間後に脱皮する。 NMJで神経変性を調べることに興味がある場合、第2齢の幼虫を傷つける必要がある。 </li></ol> 3.機械的損傷のためのショウジョウバエ幼虫の準備<ol><li>慎重に個々の幼虫を鉗子や絵筆で慎重に選んでください。とにかくそれを圧縮しないでください。 </li><li>冷たい1X PBSまたは解剖緩衝液を含むガラス皿に直接10匹の幼虫を置き、食物残骸を除去し、幼虫運動性を減速させる。 </li></ol> 4. ショウジョウバエ幼虫の機械的損傷および処置<ol><li>個々の幼虫をCO 2麻酔装置に置きます。 </li><li>切開顕微鏡下で、キュービクルを通して分節神経を視覚化するために、各幼虫をその背側に注意深く転がす。 </li><li> 位置の大きさ5の鉗子は、口のフックから始まる幼虫の長さのおよそ1/2から2/3の距離を下っています。いったん配置されると、サイズ5の鉗子で分節神経を含む腹側キューティクルの約1/3が挟まれる。 <ol><li>幼虫の分節神経が傷ついていることを確認するには、分節神経を粉砕するのに十分な力をかけてください。正確な力量を決定するには、10匹の幼虫を粉砕し、5時間後の死亡率は50％未満である。 </li></ol></li><li>傷害後、約0.5gの酵母ペーストを含む果汁寒天プレートに幼虫を注意深く移す。その前端が酵母ペースト上にあるように、各幼虫を置いてください。 注：幼虫の分節神経が損傷したことを確実にするために、寒天プレートに移した後、幼虫の運動性が崩壊することがあります。負傷した幼虫は、損傷の部位の後ろで効果的に麻痺するが、口のフックと餌をまだ動かすことができる。損傷後の動物の高い死亡率は一般的であるため、実験に必要な量よりも20〜50％多い動物を傷つけることが最善である。 </li><li>空の100×15mmペトリ皿の底に、酵母ペーストと10匹の傷害した幼虫を含む寒天プレートを置く。湿ったペーパータオルで寒天プレート上の負傷した幼虫を含むこのペトリ皿を覆い、ペーパータオルが幼虫または寒天プレートに触れないようにします。これを置くペトリ皿を室温でより大きな気密容器に入れる。 </li><li>傷害後の特定の期間（6,12、または24時間）後に解剖のために幼虫を回収する。 注：軸索細胞骨格に対する損傷の即時の影響を調べるために、幼虫を損傷後に直接解剖することができる。軸索輸送欠陥を調べるために、幼虫を損傷の約6時間後に解剖することができる。損傷の約12時間後に、ユビキチン化タンパク質の蓄積が観察され、損傷の24時間後に、NMJにおける運動ニューロンの変性が観察され得る。 </li></ol> NMJでの神経変性の解析<ol><li>前述のようにショウジョウバエの幼虫NMJを解剖する。 15、16背側表面に沿って切断したシルガードプレート上に簡単に説明すると、ピン幼虫、及び体壁筋肉組織を露出させる解剖緩衝液滴のピンとフィレット。 4％パラホルムアルデヒド（PFA）またはBouin&#39;s Solutionのいずれかで幼虫を抗ニューロンと筋肉を視覚化するために使用されるボディ。 注意：Bouin固定液があまりにも過酷な場合があるため、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タンパク質タグを視覚化する場合は、PFA固定を使用する必要があります。 </li><li> 11、13、16は 、同時にシナプス前運動ニューロンと隣接シナプス後（SSR）筋襞をマークするために、以前に記載された免疫蛍光を行います。蛍光共役型西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（1：300） 17でシナプス前膜および軸索を視覚化し、活性部位を抗Bruchpilot（Brp）抗体（nc82; 1：100; Developmental Studies Hybridoma Bank）を用いて染色することができる。抗Dicsラージ（Dlg）抗体（1：10,000）でシナプス後の筋肉を同時に標識する。 18 </li><li>以前に記載されているように、NMJでの神経変性を定量化するための確立されたアッセイを実施する。 8 </suP&gt;、9、10、11、12、13、14簡単に説明すると、同時に前およびシナプス後コンパートメントの両方のために個々のNMJを可視化します。シナプス後のマーカーで標識されているがシナプス前のマーカーではないブトンは、神経変性の部位を示す（ 図1 ）。 NMJあたりの平均ブトン数および動物あたりのNMJの平均数を定量化することができる。 </li></ol>

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	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. 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H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. 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著者は何も開示することはない。

以前に記載され、ここに示されたニューロンの機械的損傷は、 ショウジョウバエの幼虫の分節神経における損傷/ストレスを誘発するために使用され得る。 4、5、6、14この実験的手法は、神経変性を導く事象の時系列を分析するために、ならびに損傷後の運動ニューロンの細胞体における転写の変化を調べるために以前に使用されてきました。 5、14また、この技術は、観察し、 ショウジョウバエの幼虫における軸索変性と再生を研究するために、マイクロ流体チップと併せて記載されています。この技術の7つの制限事項は、けがの導入時にキューティクルの穿刺による幼虫の死亡が含まれます。しかし、大量の幼虫は、shで粉砕することができます高幼虫死亡率を克服するための期間を短縮する。私たちが含まれている修正は、24時間後に傷害を発生するNMJ、で運動ニューロン変性を視覚化することが重要である2 番目の齢や早期の第3齢幼虫の損傷です。 ここでは、ニューロンの機械的損傷がNMJでの運動ニューロン変性を研究するために利用できることを示す。我々は、ニューロンおよびそれらの関連タンパク質が隣接筋よりもより速く変性するという事実を利用して、神経変性を定量化する確立された方法を使用する。神経変性を観察し、定量化するために8、9、10、11、12、13、14、NMJが同時に前および後シナプスマーカーの両方について染色されることが重要です。ここでは、活性領域マーカーBrpおよびシナプス後マーカーDlgの使用を示しているが、NMJで神経変性を研究するために利用できる他のプレシナプスおよびシナプス後マーカーの数多くのものがある。さらに、自分が選んだ蛍光標識分子を用いて、神経変性プロセス中のそれらの効果を研究することができる。 1）それは非常に安価である、2）ほとんどのショウジョウバエの研究室には既に必要な装置がある、3）組織は固定されているなど、いくつかのメリットがあるが、マイクロフルイディクス7のような軸索損傷後の変性を研究する方法は複雑である。従来の蛍光顕微鏡法を用いて損傷後の神経変性事象を定量化することができる。 我々は、このプロトコールが、損傷後の神経変性に関連する広範囲の細胞および分子機構を調べるために適応され得ることを想定する。特に、これらの方法は、ニューロン傷害および運動ニューロン変性および再生前後の任意の蛍光標識されたタンパク質の特徴を示す。

ニューロンの変性は、正常な発達中に起こり、自然な老化過程、傷害、ストレス、または病状によって引き起こされうる。 ショウジョウバエのmelanogasterは、一般的なフルーツフライは、ニューロンの変性を駆動する分子メカニズムの顕著な類似性のため、神経変性を研究するためのシンプルで強力なモデル生物を提供します。これらの類似性は、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有するという事実によって強調される。 1はまた、数多くのアッセイおよび人間の神経変性疾患を研究するための技術のツールは、ショウジョウバエで開発され、利用されています。 ショウジョウバエ内で2、3、神経筋接合部（NMJ）は、両方の細胞および電気生理学的特性の解析を可能にし、可視nに神経筋疾患を研究するための重要なシステムであることが証明されましたユーロン - 筋肉の接続。 図2は、本研究では、分節神経の再現性の傷害を可能にし、ショウジョウバエの幼虫におけるin vivo神経細胞傷害アッセイを説明します。この運動ニューロン損傷は、損傷後24時間のNMJにおいて神経変性を生じる細胞事象の一時的な配列を生じる。神経変性を生じる運動ニューロンを再現可能に傷つける能力は、変性過程に必要とされる特定の遺伝子の同定、ニューロン損傷に対する転写応答の解剖および保護シグナル伝達カスケードの分析などの多様な用途を有する。 図4、 図5、 図6は、この方法は、生きている動物における神経変性および再生を研究するために、マイクロ流体と組み合わせて使用されてきました。 7 我々は、確立された定量アッセイを利用して、運動ニューロン変性イオンが機械的損傷後にショウジョウバエ NMJで検出される。このアッセイは、シナプス前膜およびタンパク質の損失が、シナプス後の筋膜の折畳みによって特徴付けられる潜在網状赤血球（SSR）の分解に先行するという事実に基づいている。 8、9、10、11、12、13このアッセイは、シナプス前ニューロンが隣接シナプス後筋肉への接続を失った「シナプス足跡」の定量化を可能にします。変性工程は、幼虫の発育12を通じて進行性であることが示されており、変更されたシナプスの発達又は発芽によって説明することができません。 8、9、10、11、12広告既存の突然変異よりも機械的損傷を使用することの利点は、それが、NMJでの神経変性に至る細胞事象の時間的順序の解剖を可能にすることである。 13

<table><tbody><tr><td>Micro-dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>Various tank sizes can be purchased</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Anesthetizing Apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Stainless-steel pins, size 0.1</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>To pour dissecting plates</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>Dissecting Stereo MIcroscope</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anti- nc82 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>One can you Alexa Fluor&amp;reg; 488, 594 or 647</td></tr><tr><td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Used to create humid chamber for larval recovery</td></tr></tbody></table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

ニューロンの変性は、正常な発達中、および傷害、ストレス、および疾患に応答して起こる。ニューロン変性の細胞の特徴は、ヒトおよび無脊椎動物において、これらの過程を駆動する分子メカニズムと同様に著しく類似している。 ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）は、神経変性疾患の細胞の複雑さを研究するための強力で単純な遺伝モデル生物を提供する。実際には、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有し、ヒト神経変性疾患を研究するためにハエを用いて多数のツールおよびアッセイが記載されている。より具体的には、 ショウジョウバエの神経筋接合部（NMJ）は、神経細胞と筋肉との間の構造的結合を解析する能力のために、神経筋疾患を研究するための有効なシステムであることが証明されている。ここでは、 ショウジョウバエの in vivo運動ニューロン損傷アッセイについて報告する。24時間までにNMJにおいて神経変性を再現可能に誘発する。この方法論を用いて、運動ニューロン変性をもたらす細胞事象の時間的順序を記載した。傷害方法は多様な用途を有し、神経変性に必要な特定の遺伝子を同定し、神経損傷に対する転写応答を解剖するために利用されている。

ここに示した手順を使用して、我々は、機械的な神経損傷が神経変性事象の時間的解剖を可能にすることを実証した。 14、イベントのシーケンスが以前に特徴付けられ、軸索トラフィッキング欠陥続いて細胞骨格の即時中断、ユビキチン化タンパク質の蓄積、およびそれに続く神経変性の24時間後に傷害で始まるされている18。傷害の前に、WT NMJsは、シナプス前マーカーであるBrpを、NMJ全体にわたるシナプス後マーカーDlgに付随して示す （ 図1A ）。分節神経の機械的損傷は中程度から重度の神経変性を誘導することができ、Dlgで染色されたブトンは今やシナプス前活性ゾーンタンパク質Brpを欠いている（ 図1B ）。 Dlgで染色されているがBrp染色が欠けているブトンはいずれも &quot;syn&quot;とみなされますこのような神経変性表現型の頻度と重症度の両方を、前述のように定量化することができる[ 11] 。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56128/56128fig1.jpg" /> 図1：機械的ニューロン損傷は、筋肉のNMJで神経変性を誘導する6/7。 （ A ）損傷していないNMJsはシナプス前マーカーであるBrp（緑色）と、シナプスマーカーであるDlg（赤色）とをNMJ全体にわたって示す。 （ B ）ニューロンの機械的損傷は、Brpの消失とともにDlg染色されたブトン（赤色）によって示される神経変性を誘導する。矢印は、神経変性の個々の部位を示す。スケールバー=10μm。 <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56128/56128fig1large.jpg" target="_blank">より大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください</a>この数字。

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A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

ここでは、3齢幼虫の神経筋接合部（NMJ）における運動ニューロンの神経変性を視覚化および定量化するために、 ショウジョウバエ幼虫における分節神経を傷つける簡単かつ広くアクセス可能な方法について説明する。

研究のための単純な神経細胞学的損傷法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;運動ニューロン変性

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

5.5K ビュー.  Quinnipiac University. ここでは、3齢幼虫の神経筋接合部（NMJ）における運動ニューロンの神経変性を視覚化および定量化するために、 ショウジョウバエ幼虫における分節神経を傷つける簡単かつ広くアクセス可能な方法について説明する。 

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Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

生物工学

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

神経科学

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

発生生物学

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

医学

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neuromuscular Disorders

Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observe Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila Larvae

Source: Li, D., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/57557/" target="_blank">A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video describes two-photon laser ablation of axons in a Drosophila melanogaster larva and an example protocol to induce injury and image the injury site.

2光子レーザーによる神経損傷:ショウジョウバエ幼虫の軸索変性と再生の観察法

Source: Li, D., et al. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. 
...

生物学

Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）

幼虫

Mechanically Injuring Drosophila Larvae Segmental Nerves to Induce Neurodegeneration

Source: Danella, E. B., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56128">A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration.</a> J. Vis. Exp. (2017).
The video demonstrates inducing neurodegeneration in Drosophila larva segmental nerves via mechanical injury. The ventral cuticle of anesthetized larvae is pinched using forceps to cause injury to the segmental nerves. The injured larvae are maintained with food, allowing the injury to cause degeneration of the motor neurons in the nerves, causing disruption of their neuromuscular junctions (NMJs).

ショウジョウバエの幼虫を機械的に傷つけ、神経分節神経を誘発する。

1. Preparation of Reagents and Equipment 

	Prepare 1x Dissection Buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sucrose, ...

研究のための単純な神経細胞学的損傷法

要約

さらに動画を探す

この動画の章

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

に神経変性を定量化するために、マス組織学

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

神経変性と関連した成人ショウジョウバエにおけるシナプス変性の可視化

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

2光子レーザーによる神経損傷:ショウジョウバエ幼虫の軸索変性と再生の観察法

ショウジョウバエの幼虫を機械的に傷つけ、神経分節神経を誘発する。

研究のための単純な神経細胞学的損傷法

要約

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における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

に神経変性を定量化するために、マス組織学

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

2光子レーザーによる神経損傷:ショウジョウバエ幼虫の軸索変性と再生の観察法

ショウジョウバエの幼虫を機械的に傷つけ、神経分節神経を誘発する。

神経変性と関連した成人ショウジョウバエにおけるシナプス変性の可視化