Name: a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

ברצוננו להודות לכל חברי המעבדות קלר ומגי באוניברסיטת קוויניפיאק להצעות מועילות. בפרט, ברצוננו להודות Barron L. לינקולן II לפיתוח assay זה פגיעה בתוך המעבדה קלר. כמו כן, ברצוננו להודות Quinnipiac אוניברסיטת קולג &#39;לאמנויות ומדע גרנט- In-Aid הוענק ל LC קלר.

1. הכנה של ריאגנטים וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x הצפת Dissection (70 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 0.02 מ&quot;מ CaCl 2 , 20 מ&quot;מ MgCl 2 , 10 מ&quot;מ NaHCO 3 , סוכרוז 115 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ טרילהוז, 5 מ&quot;מ HEPES, pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x PBT באמצעות 1x PBS עם 0.01% Triton X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיץ פירות אגר צלחות. 14 בקצרה, לערבב אגר 30 גרם 700 מ&quot;ל של H 2 O ו החיטוי. ממיסים 0.5 גרם של Paraben מתיל 10 מ&quot;ל של אתנול ולהוסיף פתרון 300 מ&quot;ל של מיץ פירות להתרכז (ענבים או תפוח). מערבבים להתרכז פתרון אגר autoclaved ויוצקים לתוך המכסים של 10 מ&quot;מ x 35 מ&quot;מ צלחות פטרי. הערה: פריקקס אגר ענבים כוח ניתן גם לרכוש מחברות שונות (ראה Tabls של חומרים ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג גודל 5 מלקחיים המאפשרים אחד מכני לפגוע בזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תקן תסיסנית CO 2 </sUb&gt; מכשיר הרדמה מבוסס. </li></ol> 2. בחירת זחלים תסיסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בקבוקון או בקבוק תסיסנית המכיל זחלים instar השלישי נודדים כי כבר מתורבת ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10 בודדים 2 nd או 3 rd insta הזחלים מבוסס על המראה. הזחלים instar השלישי יכול להיות מזוהה על ידי המראה של spiracles מסועף הקדמי, בעוד הזחלים instar השני הם קטנים יותר יש יותר כמו מועדון spiracles הקדמי. הערה: ניתן לזהות את שלבי הזחל גם על ידי תזמון. ב 25 ° C, הזחלים instar השני מופיעים כ 48 שעות לאחר הבקיעה, ואת השלישי זחלי instar זחילה כ 24 שעות מאוחר יותר. אם מעוניינים לבחון neurodegeneration ב NMJ, הזחלים instar השני צריך להיפגע. </li></ol> הכנת זחלים תסיסנית עבור פגיעה מכנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לבחור זחלים בודדים על ידי מלקחיים או מכחול, להיות זהיריםלא לדחוס אותו בכל מקרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ישר עשר זחלים לתוך צלחת זכוכית המכיל קר 1X PBS או חיץ לנתיחה להסיר כל פסולת מזון כדי להאט את תנועת הזחל. </li></ol> 4. מכני פגיעה וטיפול של זחלים תסיסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל זחל בודדים על מנגנון הרדמה CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, בזהירות לגלגל כל זחל על הצד הגבי שלהם כדי לדמיין את עצבי הסגמנטלי דרך לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום בגודל 5 מלקחיים כ 1/2 ל 2/3 דרך לאורך הזחל החל בפה ווים. לאחר מיקומו, קמצוץ כ 1/3 של לציפורן הגחון המכיל את העצבים הסגמנטליים עם גודל 5 מלקחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח עצבים סגמנטליים הזחל נפצעו, להחיל כוח מספיק כדי למחוץ את עצבי הסגמנטלי אבל לעזוב את לציפורן ללא פגע. כדי לקבוע את הכמות הנכונה של כוח, לרסק 10 זחלים ולהבטיחשיעור התמותה לאחר 5 שעות מתחת ל -50%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פגיעה, בזהירות להעביר זחלים לצלחת אגר מיץ פירות המכיל כ 0.5 גרם של שמרים להדביק. מניחים כל זחל כך הקצה הקדמי שלה על הדבק שמרים, להמשך האכלה למרות תנועתיות משובשת. הערה: כדי להבטיח עצבים סגמנטליים הזחל נפגעו, תנועתיות הזחל שיבשו ניתן לראות לאחר העברת צלחת אגר. הזחל נפגע משותק למעשה האחורי לאתר הפציעה, אבל עדיין יכול להזיז את הפה ווים שלהם להאכיל. שיעור תמותה גבוה של בעלי חיים לאחר פגיעה הוא נפוץ ולכן עדיף לפגוע 20-50% יותר בעלי חיים ממה שנחוץ לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום צלחות אגר המכיל להדביק שמרים 10 זחלים פצע לתוך תחתית של צלחת פטרי 100 x 15 מ&quot;מ ריקה. מכסים את צלחת פטרי, המכיל עכשיו את הזחלים הפגועים על צלחת אגר עם מגבת נייר לחה, להבטיח כי מגבת נייר לא לגעת הזחלים או צלחות אגר. מקום זהצלחת פטרי לתוך מיכל חזק יותר אוויר, ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר זחלים לנתיחה לאחר תקופות שנקבעו (6, 12, או 24 שעות) שלאחר הפציעה. הערה: כדי לבחון את ההשפעות המיידיות של פגיעה על השלד של axonal, הזחלים ניתן לגזור ישירות לאחר הפציעה. כדי לבחון פגמים הובלה אקסונל, הזחלים ניתן לגזור כ 6 שעות לאחר הפציעה. בערך 12 שעות לאחר הפציעה הצטברות של חלבונים אוביקטיניטד ניתן לראות, ו 24 שעות לאחר הפציעה, ניוון של נוירונים המנוע ב NMJ ניתן לצפות. </li></ol> 5. ניתוח של Neurodegeneration ב NMJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תסיסנית הזחל NMJ כפי שתואר לעיל. 15 , 16 בקצרה, הזחלים פין על צלחת Sylgard, לחתוך לאורך פני הגבי, ואת פילה עם סיכות בטיפה של חיץ לנתיחה לחשוף את שרירי הגוף בגוף. תקן הזחלים או paraformaldehyde 4% (PFA) או פתרון של בויין בהתאם אנטיגופים המשמשים לדמיין נוירונים ושרירים. הערה: קיבוע PFA יש להשתמש אם תגי חלבון ניאון, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא להיות דמיינו כמו מקבע של בווין יכול להיות קשה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע immunofluorescence, אשר תוארה בעבר 11 , 13 , 16 , כדי לסמן בו זמנית נוירונים המנוע presynaptic ו סמינרי (SSR) סף שרירים. דמיינו קרום presynaptic ו אקסונים עם peroxidase חזרת פלואורסצנטי מצומדות (HRP) (1: 300) 17 אזורי פעיל יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדנים נגד ברוכפילוט (Brp) (nc82, 1: 100, מחקרים התפתחותיים היברידומה בנק). במקביל, תווית שרירים פוסט-סינפטיים עם נוגדנים נוגדי-דיכאון גדולים (D: 1) (1: 10,000). 18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay הוקמה לכימות neurodegeneration ב NMJ כפי שתואר לעיל. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 בקצרה, במקביל לדמיין NMJs בודדים הן לפני ואחרי תאים סינפטיים. כל boutons שכותרתו עם סמנים postsynaptic אבל לא סמנים presynaptic מצביעים על אתרים של neurodegeneration ( איור 1 ). המספר הממוצע של boutons לכל NMJ כמו גם את המספר הממוצע של NMJs לכל חיה ניתן לכמת. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

פגיעה מכנית העצבית שתוארה קודם לכן הפגינו כאן יכול לשמש כדי לגרום לפציעה / מתח העצבים הסגמנטליים של הזחלים תסיסנית . 4 , 5 , 6 , 14 טכניקה זו ניסיוני כבר מועסקים בעבר לנתח את הרצף הזמני של אירועים המוביל neurodegeneration, כמו גם לבחון שינויים תעתיק בגופם התא הנייד נוירון שלאחר הפציעה. 5 , 14 בנוסף, טכניקה זו תוארה בשיתוף עם שבבי microfluidics כדי לבחון ולחקור ניוון axonal ו התחדשות בזחלים תסיסנית . 7 מגבלות של טכניקה זו כוללות מוות של הזחלים עקב ניקוב של לציפורן במהלך הקדמה של הפציעה. עם זאת, מספר גדול של זחלים ניתן למחוץ בשאורט תקופה של זמן כדי להתגבר על שיעור מוות גבוה הזחל. שינוי זה כללנו הוא פציעה של instar 2 nd או הזחלים instar 3 rd מוקדם, שהינה קריטית לדמיין ניוון הנוירון המוטורי בבית NMJ, אשר מתרחשת 24 שעות לאחר פציעה. כאן, אנו מדגימים כי פגיעה מכנית נוירונים יכול להיות מנוצל ללמוד ניוון נוירון המנוע ב NMJ. אנו משתמשים בשיטה מבוססת כדי לכמת נוירודגנרציה כי מנצל את העובדה נוירונים חלבונים הקשורים שלהם להתנוון מהר יותר מאשר השריר הסמוך. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 כדי לפקח לכמת ניוון, זה קריטי כי NMJ להיות מוכתמים בו זמנית הן סמנים מראש ו postsynaptic. הנה, אנחנו דלהדגים את השימוש של סמן אזור פעיל Brp ואת סמן postsynaptic Dlg, עם זאת, יש שפע של סמנים אחרים מראש ו postsynaptic זמין כי ניתן להשתמש כדי ללמוד neurodegeneration ב NMJ. בנוסף, fluorescently מתויג מולקולות של בחירה של אחד יכול להיות מועסק כדי לחקור את ההשפעות שלהם במהלך תהליך neurodegenerative. ישנן שיטות מסובכות יותר ללמוד ניוון לאחר פגיעה axonal, כגון microfluidics 7 , אבל השיטה שלנו יש מספר יתרונות: 1) הוא זול מאוד, 2) רוב המעבדות תסיסנית כבר יש את הציוד הדרוש, 3) הרקמה קבועה כך מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי ניתן להשתמש כדי לכמת אירועים נוירודגנרטיבים פוסט פוסט. אנו רואים כי פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לבחון מגוון רחב של מנגנוני הסלולר המולקולריים הקשורים neurodegeneration לאחר הפציעה. בפרט, שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לבחון את behAvior של כל חלבון מתויג fluorescently לפני ואחרי פגיעה נוירונים ניוון נוירון המנוע התחדשות.

ניוון עצבי מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית יכול להיגרם על ידי תהליך ההזדקנות הטבעי, פציעה, מתח, או מצבי מחלה. תסיסנית melanogaster , זבוב הפירות המשותף, מספק אורגניזם מודל פשוט וחזק ללמוד neurodegeneration בשל הדמיון המדהים של המנגנונים המולקולריים המניעים את התנוונות של נוירונים. קווי דמיון אלה מודגשים על ידי העובדה כי כ -70% של גנים אנושיים הקשורים המחלה יש הומולוג תסיסנית . 1 בנוסף, מבחני רבים וכלים טכנולוגיים ללמוד מחלות נוירודגנרטיביות אנושית פותחו וניצל תסיסנית . 2 , 3 בתוך תסיסנית , צומת neuromuscular (NMJ) מאפשר ניתוח של תכונות הסלולר והן אלקטרופיזיולוגיים הוכיח להיות מערכת חשובה ללמוד מחלות neuromuscular בשל n גלויחיבורי שריר יורון. 2 במחקר זה, אנו מתארים את assay פגיעה vivo נוירון בזחלים תסיסנית המאפשר הפציעה לשחזור של עצבים סגמנטליים. זו פגיעה motoneuron התוצאות ברצף הזמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך neurodegeneration ב NMJ 24 שעות לאחר הפציעה. היכולת לשכפל מוטורונורונים פגמים וכתוצאה מכך neurodegeneration יש יישומים מגוונים כגון זיהוי גנים ספציפיים הנדרשים לתהליך ניוונית, דיסקציה של תגובות תעתיק פציעה עצבית, וניתוח של מפלים איתות מגן. 4 , 5 , 6 שיטה זו שימשה גם בשילוב עם microfluidics ללמוד ניוון העצב התחדשות בבעלי חיים. 7 אנו מנצלים assay כמותי הוקמה לבחון degenerat נוירון המנועיון ב NMJ תסיסנית לאחר פגיעה מכנית. Assay זה מבוסס על העובדה כי אובדן של קרום presynaptic וחלבונים קודמת פירוק של reticulum subsynaptic (SSR) המאופיינת על ידי foldynaptic קרום שרירי הקפלים. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 assay זה מאפשר כימות של &quot;טביעות רגליים סינפטי&quot; שבו נוירון מראש סינפטי איבד את הקשר השריר postsynaptic הסמוך. תהליך ניוונית הוכח להיות פרוגרסיבי לאורך התפתחות הזחל 12 ולא ניתן להסביר על ידי שינוי סינפסה שינוי או נבטים. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 המודעההתצפית של שימוש פגיעה מכנית על מוטציות preexisting היא שזה מאפשר לנתיחה של רצף הזמני של אירועים סלולריים המוביל עד neurodegeneration ב NMJ. 13

<table><tbody><tr><td>Micro-dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>Various tank sizes can be purchased</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Anesthetizing Apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Stainless-steel pins, size 0.1</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>To pour dissecting plates</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>Dissecting Stereo MIcroscope</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anti- nc82 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>One can you Alexa Fluor&amp;reg; 488, 594 or 647</td></tr><tr><td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Used to create humid chamber for larval recovery</td></tr></tbody></table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

ניוון של נוירונים מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית בתגובה על פגיעה, מתח, מחלה. סימפטומים הסלולר של התנוונות העצבית דומים להפליא אצל בני אדם וחסרי חוליות כמו המנגנונים המולקולריים המניעים תהליכים אלה. זבוב הפירות, תסיסנית melanogaster , מספק אורגניזם מודל גנטי פשוט אך פשוט כדי לחקור את המורכבות הסלולרית של מחלות נוירודגנרטיבי. למעשה, כ 70% מכלל גנים אנושיים הקשורים למחלה יש homolog דרוזופילה וכן שפע של כלי מבחנים תוארו באמצעות זבובים כדי לחקור מחלות ניווניות אנושיות. באופן ספציפי יותר הצומת neuromuscular (NMJ) ב תסיסנית הוכיחה להיות מערכת יעילה ללמוד מחלות neuromuscular בגלל היכולת לנתח את הקשרים המבניים בין הנוירון לשריר. הנה, אנו מדווחים על vivo המנוע assay פגיעה נוירון תסיסנית , אשרReproducibly גורם neurodegeneration ב NMJ על ידי 24 שעות. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו רצף זמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך ניוון נוירונים מוטוריים. שיטת הפציעה יש יישומים מגוונים יש גם נוצלו כדי לזהות גנים ספציפיים הדרושים neurodegeneration ו לנתח תגובות תמליל לפציעה העצבית.

באמצעות הנוהל המוצג כאן, יש לנו הוכיח כי פגיעה מכנית העצבית מאפשרת לנתיחה הזמני של אירועים נוירודגנרטיביים. 14 , 18 רצף האירועים כבר מאופיין בעבר ומתחיל עם הפרעה מיידית של השלד, ואחריו פגמים הסחר אקסונל, הצטברות של חלבונים הנמצאים ubiquitinated, ו neurodegeneration הבאים 24 שעות לאחר הפציעה. לפני הפציעה, WT NMJs להראות את האזור presynaptic פעיל סמן ברפ ב אפוזיציה סמן postsynaptic Dlg בכל NMJ כולו ( איור 1 א ). פגיעה מכנית של עצבים סגמנטליים יכולה לגרום להתפתחות נוירו-דגנרטיון בינונית עד קשה, שבה boutons מוכתמים עם Dlg עכשיו חוסר presynaptic פעיל אזור חלבון Brp ( איור 1B ). כל bouton כי הוא מוכתם Dlg אבל חסר מכתים Brp נחשב &quot;synטביעת aptic&quot; ואפשר לסמוך לכמת כאירוע ניווניות. שניהם תדירות וחומרת פנוטיפ ניווניות ניתן לכמת כפי שתואר לעיל. 11 <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56128/56128fig1.jpg" /> איור 1: פגיעה מכנית נוירונלית גורם neurodegeneration ב NMJ של שריר 6/7. ( א ) NMJs Uninjured להראות מראש סינפטי סמן אזור פעיל, Brp (ירוק) ב אפוזיציה עם סמן postsynaptic, Dlg (אדום) בכל NMJ. ( ב ) פגיעה מכנית נוירונלית גורם neurodegeneration המצוין על ידי Dlg מוכתמת boutons (אדום) עם אובדן של Brp. ראשי חץ מצביעים על אתרים בודדים של ניוון מוחי. סולם בר = 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56128/56128fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של</a>הדמות הזאת.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

5.5K Views.  Quinnipiac University.  כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי. 

Video: A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengineering

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Developmental Biology

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

מודל פציעה דרוזופילה In Vivo ללמוד Neuroregeneration ב ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicine

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons בדרוסופילה מלאנוסטר

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

הערכת השלמות המבנית של הצמתים העצביים-שריריים האורכיים הגביים בדרוזופילה

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neuromuscular Disorders

Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observe Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila Larvae

Source: Li, D., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/57557/" target="_blank">A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video describes two-photon laser ablation of axons in a Drosophila melanogaster larva and an example protocol to induce injury and image the injury site.

פגיעה עצבית הנגרמת על ידי לייזר בשני פוטונים: שיטה לצפייה בניוון והתחדשות אקסונים בזחלי דרוזופילה

Source: Li, D., et al. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. 
...

Biology

Drosophila melanogaster (fruit fly)

Larva

Mechanically Injuring Drosophila Larvae Segmental Nerves to Induce Neurodegeneration

Source: Danella, E. B., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56128">A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration.</a> J. Vis. Exp. (2017).
The video demonstrates inducing neurodegeneration in Drosophila larva segmental nerves via mechanical injury. The ventral cuticle of anesthetized larvae is pinched using forceps to cause injury to the segmental nerves. The injured larvae are maintained with food, allowing the injury to cause degeneration of the motor neurons in the nerves, causing disruption of their neuromuscular junctions (NMJs).

1. Preparation of Reagents and Equipment 

	Prepare 1x Dissection Buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sucrose, ...

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב