Name: creating and applying a reference to facilitate the discussion and classification of proteins in a diverse group
Uploaded: 2017-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
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継続的な tardigrade 抗菌ペプチドの研究は、中西部大学研究事務所主催プログラム (ORSP) から学内資金によってサポートされます。ORSP、研究デザイン、データ収集、分析、解釈、または原稿を準備する役割がなかった。

1 です。 興味の蛋白質群を定義する機能を決定する <ol><li>グループの一部と見なされるために必要な機能に関する合意がある場合を決定する相談以前の出版物。不一致や研究グループ間の意見の違いのメモを取るし、別の 1 つのサブグループを区別するために役立つ可能性がある特徴があります</li>。
	<li>以前文献で定義する特性が解決されない場合は、保存機能を識別するための出発点として、グループの代表者と見なされているシーケンスを使用します</li>。
</ol> 2。該当するシーケンスを収集 <ol><li>レビューが書かれている場合、グループを代表しているシーケンスの分析を含む、これらのシーケンスは、生のデータセット。受入番号、文献で参照を使用してシーケンスを取得し、編集プログラム標準の順序で保存 (例えば、 EditSeq Lasergene スイートまたは 1 つの利用できる多くの無料のオンライン).</li>
	<li>は、グループには 1 つの構造のデータベースで定義されている場合のデータベースはデータベースに記載されている加盟番号を使用して取得シーケンス グループの一員として、シーケンスを含めるし、標準シーケンス編集で保存プログラムでは、上記のようにします 。
	注: たとえば、SCOP データベースで CS αβ (サソリ毒素のような) スーパーファミリーに分類されるシーケンスはこちら: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.</li> <li>実行基本的なローカルパブリックなオンライン データベース国立センターの生物工学情報 (NCBI) 文献にない含まれているシーケンスを見つけることが提供または構造の配置検索ツール (ブラスト) 14 検索データベース。最も結果を完了、両方蛋白質ブラスト (blastp) を使用し、タンパク質 (tblastn) のクエリ プログラムと爆発を翻訳これらは、両方で利用できる: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
	<ol><li>使用シーケンスをクエリ シーケンスとして興味のグループの一部であることが知られています。コピーして、上部にある検索ボックスにシーケンスを貼り付けるかあれば GenBank 加盟番号または gi 識別子を提供します</li>。
		<li>は、ドロップ ダウン メニューからデータベースを選択します。Blastp の重複を除いた蛋白質シーケンス (nr) を選択し、tblastn のタグを表現します</li>。
		<li>有機体の有機体または分類群名を入力し、入力時に表示されるリストから選択する設定で特定の分類で検索します。追加有機体または除外する分類を追加するをクリックして、&#34; + &#34; ボタンと別のフィールドが表示されます。有機体または分類群の名は、入力して、チェック時に表示される一覧から選択するを入力することによって生物ボックスの任意の不要なイチイを除外、&#34; 除外 &#34; 右側のボックスです</li>。
		<li>をクリックして追加のパラメーターにアクセス &#34; アルゴリズム パラメーター &#34;、ページの下部に。パラメーターを変更するための理論的根拠がない限り、デフォルトのままにします</li>。
		<li>をクリックして、&#34; 爆発 &#34; 解析を実行するボタン; 結果を表示いくつかの時間がかかることがあります。一般的には、ヒットの期待値 (または e 値) を含むを取得 &#34; -05 &#34; またはより良いし、編集プログラム標準の順序で保存します。
		<ol><li>すべてのヒットがこのしきい値を超えるなら、すべて該当するシーケンスを取得する ([アルゴリズム パラメーター] セクション) ターゲット シーケンス数の増加と検索を再実行します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>必要に応じて、トリム無関係な情報 (例えば、 CS αβ 折りは、成熟したペプチドにのみ適用されます) を除外するシーケンス。信号ペプチドおよび支柱 15 を使用して除去するためプロ ペプチッド識別 (利用できるオンライン)、またはより洗練された信号ペプチド予測 16 SignalP (利用できるオンライン).</li>
</ol> 3。重要な機能が識別されたに基づくスプレッドシート参照を生成する <ol><li>重要グループの特徴を識別します。たとえば、昆虫 クロキンバエなど ( 図 1) 8 から A をディフェンシンの溶液構造によって決定的に確立された CS αβ 倍を使用します。
	<ol><li>この倍にはシステイン安定ヘリックス (CSH) 17 と呼ばれる小さいモチーフが含まれています; (X は任意のアミノ酸) CXXXC でこのモチーフを識別する 2 つのジスルフィド結合を形成する CXC の上流 ( 図 1 固体、ピンクのライン). 
		注: CS αβ モチーフを完了する追加システイン CSH モチーフ ( 図 1、ピンクの点線) の各半分の前に配置から形成される 3 番目のジスルフィド結合します</li>。
	</ol></li> <li>スプレッドシートに機能を定義するこれらを入力してください。 図 2 を参照してください。
	<ol><li>保存機能とこれらの機能の間のスペースを表す列の使用。列番号を合わせて、一貫した幅があることを確認十分な幅を維持します。幅を使用して設定、&#34; 形式 |列の幅 &#34; 関数 ( 図 2、ピンクの矢印).</li>
		<li>シーケンス名の行を使用します</li>。
		<li>シーケンスが機能は、塗りつぶし関数 ( 図 2、ピンクの正方形) を使ってボックスを入力します。機能間の間隔、間のボックスにアミノ酸の数を入力し、品切れにしておきます。たとえば、C2 と C3 と C5 と C6 の間に定義された間隔で六つのシステインを含む参照を与える昆虫ディフェンシン シーケンスを使用します</li>。
	</ol></li> <li>構造データベースおよび文献に基づくグループのメンバーとして以前に確立した代表的なシーケンスを追加します 。
	注: たとえば、先行文献と SCOP データベースを識別する包含のためのいくつかのグループ: 昆虫ディフェンシン、短鎖サソリ毒素、長鎖サソリ毒素 MGD 1、植物のディフェンシン、ABFs 線虫、ショウジョウバエ から drosomycins とmacins。文献はまたこのスーパーファミリー 18 の祖先を表す場合があります唯一の 4 つのシステインと細菌シーケンスを識別します。これらのシーケンスを追加する 6 から 10 の参照のシステインの数を増加させるが、重要な構造の特徴 ( 図 3) のアライメントを維持します。
	<ol><li>シーケンス (たとえば、余分なシステイン) のサブグループを定義する可能性のある機能を追加する、&#34; 挿入 &#34; 関数 ( 図 3、ピンクの矢印).</li>
		指定されたシーケンスから欠落している機能未充足のままおよび介在のアミノ酸を表すボックスとそれを組み合わせるある場合は <li>。必要に応じて、差し込み印刷とセンター機能 ( 図 3、ピンク色のボックス) を使用してセルを結合します</li>。
	</ol></li> <li>大きなスーパーファミリーの各グループの変化のより良い画像を得るために 続行シーケンスをグループに追加します。( 図 4) の比較を容易にするためにグループの特性を要約します。
	<ol><li>アミノ酸の主な機能の間の数が変化、6-12 (6 に 12 アミノ酸) といずれかを示すスラッシュなど、範囲を示すハイフンを使用して/または、7/10 (7 または 10 アミノ酸) など</li>。
		<li>は、参照に含めるには、関連が十分に頻繁に発生しないシーケンスの機能に注釈を付ける方法を選択します。たとえば、システインはこのスーパーファミリーで重要なのでラベルを追加システイン ( 図 4、ピンク色のボックス).</li>
	</ol></li> <li>Newl を追加ガイドとして確立されたシーケンスを使用してスプレッドシートに y 識別シーケンス。たとえば、クマムシ (黄色) からシーケンスを追加する tardigrade のシーケンスが ( 図 5 スペース用シーケンスごとに 1 行の代わりに集計が表示されます) スーパーファミリーのいくつかの異なるグループに入ることを示しています</li>。
	<li>( 図 6) の行を並べ替えることによって分類群内変動を表示します</li>。
</ol> 4。アミノ酸の線形の改良への参照を使用して 注: 多重配列アライメントに使用することができます多くのプログラムがありますが、このデモは分子進化遺伝学解析 (MEGA6) を使用して 19 だから無料でダウンロードして利用できます。
<ol><li>をダウンロードしてソフトウェアをインストールします</li>。
	<li>を選択してメガの新しい整列を開始 &#34; 編集/ビルド配置 &#34; 整列タブの選択の下で &#34; 新しい線形を作成 &#34;] をクリックし、表示されるボックスに &#34; OK &#34; を選択 &#34; タンパク質。 &#34;</li>。
	<li>選択 &#34; ファイルから挿入のシーケンス &#34; で、&#34; 編集 &#34; シーケンスをインポートするメニュー 。
	注: シーケンスは、メガにインポートできる FASTA 形式でする必要があります。既定では、異なるアミノ酸の種類を反映する背景色が使用されますの下でこのオプションをオフにすることができます、&#34; 表示 &#34; メニュー</li>。
	<li>すべてのシーケンスを入力すると、屈曲アーム アイコンをクリックし、&#34; 整列蛋白質 &#34; 筋アルゴリズム 20 を使用してシーケンスを配置する 。
	注: ClustalW も可能です。
	<ol><li>場合は何も選択したポップアップをされており、すべてを選択するように求められますことを示すメッセージをクリックして &#34; OK。 &#34;</li> <li>注: ウィンドウが開き、いずれかのいくつかのパラメーターを変更することができるが、彼らは変更のみ必要がありますそうする理由があります。この分析は、以前紙 12 分析シーケンスのサブセットを使用します</li>。
	</ol></li> <li>チェックの配置が重要な機能に基づく; シーケンス上のトップ バー アミノ酸が完全にはすべての列が表示されますメモが保存されている (*)。参照してください 図 7。初期配置が 4 つの保存されたシステイン ( 図 7、ピンク色のボックス); の 3 つだけを示していますを参照してください。列を見下ろして AlCRP シーケンスが明らかにずれている ( 図 7、ピンクの矢印).</li>
	間の大きいギャップの解消を取得する <li>とダッシュ ハイライト表示、保存された C、&#34; 削除 &#34; キー。任意のアミノ酸を強調しないまたは同様削除されます</li>。
	右側にアミノ酸を移動、ハイライトしスペースバーを押して <li>
	<ol><li>注整列構造システインがなりました、AlCRP と CXXXC のモチーフの最後の C が配置 ( 図 8) で保存されています。シーケンスの最も重要な機能の優先順位に応じて位置を調整する</li>。
	</ol></li></ol> 5。グループ識別による系統解析から結果を参照比較 <ol><li>予備線形から決定どのシーケンスが系統解析; シーケンスの数が少ないために含める必要があります、このステップが必要はありません。
	<ol><li>すべてのシーケンスを含む配置ファイルのまま系統解析の冗長なシーケンスを削除 (重複シーケンスの 図 9、ピンク ボックス ショー ペア).</li>
		<li>データ セットには、配列の多数が含まれている場合、予備分析を実行して、グループから選択の代表者は、常に、クレードを形成します</li>。
	</ol></li> <li>最高のアミノ酸置換モデルを決定します。
	<ol><li>([データ] タブで) メガ形式で配置をエクスポートします</li>。
		<li>[モデル] メニューに移動し、選択 &#34; を見つける最高 DNA/タンパク質モデル &#34; 変更することができますいくつかのパラメーターを持つウィンドウが開きます; 先ほど保存したファイルを選択し、それを開きます。</li>。
		<li>は、それらを変更する理由がある場合を除き、既定のパラメーターを使用します。クリックして &#34; 計算 &#34; 分析を開始します</li>。
	</ol></li> <li>メガで最大尤度 (ML) 解析を実行します。
	<ol><li>選択 &#34; 構築/テスト最大尤度ツリー &#34; 系統メニューから</li>。
		<li>モデルは 5.2 からデータに最適であると判断を選択 (置換モデルとして最高出力を与える &#34; レート サイトの中で &#34; パラメーター).</li>
		<li>ツリーのサポートのメジャーを取得する選択 1,000 ブートス トラップをレプリケートします</li>。
		<li>をクリックして &#34; を計算 &#34; 解析を実行するにはメガは、&#34; ツリー エクスプ ローラー &#34; ツリーを視覚化する</li>。
	</ol></li> <li>MrBayes オープン ソース ソフトウェア 21 でベイジアン解析を実行します 。
	注: MrBayes マニュアルはこのサイトからもできます。これは基本的な手順を提供するものですし、ベイズ法による系統解析を行うための包括的なガイドではありません。
	<ol><li>PAUP (ネクサス) 形式でメガ配置を MrBayes プログラムと同じフォルダーにエクスポートします</li>。
		<li>オープン MrBayes そして種類 &#34; exe ファイル名 &#34; (例えば、 &#34; exe Alignment.nex &#34;).</li>
		<li>は、モデルと解析パラメーターを指定します。5.2 のステップで指定されたいずれかモデルを選択するか、&#34; 混合 &#34; 設定は様々 なモデルを試してみて、最高の事後確率を持つ木のモデルの周波数を報告 (prset aamodelpr = 混合)。タイプ &#34; showmodel &#34; 現在のモデルの設定を報告して &#34; mcmc を助ける &#34; それぞれの簡単な説明、現在のパラメーター設定を表示する</li>。
		<li>を使用しての世代数を設定、&#34; mcmcp ngen = &#34; コマンド (100 万が一般的です).</li>
		<li>型 &#34; mcmc &#34; 分析を開始します</li>。
		<li>世代の数が完了すると、プログラムは世代以上を追加する求められます。分割周波数の平均標準偏差が 0.1 より小さい場合は、なしを入力します。それは 0.1 の上、解析を続行するべきか (マニュアル参照) いくつかのパラメーターを変更する必要があります</li>。
		<li>使用の &#34; sumt &#34; ツリー ファイルを生成するためのコマンドです</li>。
		<li>フィグツリーでツリーを表示できる分析が完了すると、コンセンサス ツリーが生成される、(利用可能なオンライン).</li>
	</ol></li> <li>メソッドは一貫した結果を生成するかどうかを表示するツリーを比較します 。
	注: いくつかのシーケンスは、多くの情報を与えないように: 木をうまく解決できない場合があります、枝が最小限にサポート ( 図 10).</li>
	<li>系統解析がこれらのグループをサポートするかどうかに参照を使用して特定のグループにツリーを比較します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Matsuyama, K., Natori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Three+Antibacterial+Proteins+from+the+Culture+Medium+of+NIH-Sape-4,+an+Embryonic+Cell+Line+of+Sarcophaga+peregrina.">Purification of Three Antibacterial Proteins from the Culture Medium of NIH-Sape-4, an Embryonic Cell Line of Sarcophaga peregrina.</a> J Biol Chem. 263 (32), 17112-17116 (1988).</li><li>Lambert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immunity:+Isolation+from+immune+blood+of+the+dipteran+Phormia+terranovae.+of+two+insect+antibacterial+peptides+with+sequence+homology+to+rabbit+lung+macrophage+bactericidal+peptides.">Insect immunity: Isolation from immune blood of the dipteran Phormia terranovae. of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides.</a> PNAS. 86 (262-266), (1989).</li><li>Dimarcq, J. -. 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著者は、何を開示します。

グループ内でのタンパク質の命名基準は明確にする必要がありますが、これは常にそうではありません。フォールド CS αβ のシーケンスは、様々 な生物を使用して命名法の異なるシステムの結果し同様、特性のレベルを変化させる多くのラボで研究されている.完全に新しい命名法を課すしようとすると、妥当ではないと以前の文学をコンサルティングするとき大いに混乱になります。スーパーファミリーを基準にしてその特性を明らかにする蛋白質の名に加えて番号システムの参照を使用できます。
名前付けと分類はそうではないため明確な基準が付いている蛋白質のグループの恩恵をスプレッドシート内の参照を生成するシーケンスの多数を要約し、重要な特性の可視化の役に立つことがあります。配列アラインメントとロゴは各サイトで保護のレベルを調査するために役立ちますが、積極的に構造や機能の重要なシーケンス機能を優先しないでください。構造に焦点を当てた CS αβ 例が、結合部位を形成する特定のアミノ酸は、定義する機能として組み込むことができます。CS αβ ペプチドの具体的な抗菌/有毒な活動を協議するシーケンス機能を識別すると、これらの活動に基づいてグループを明確に参照する追加でした。シグナルペプチドのかプロのペプチドの存在が重要な場合、予測の成熟したペプチドだけはこの例で使用されたが、各シーケンスの情報を追加できます。イントロンの場所と同様、特定の挿入または削除イベント含めることもできる場合、彼らは有益であると考えられています。系統解析は分子データ-それまでだ、MrBayes を使用する利点は、進化的重要性を持っている可能性がありますその他の特性の符号化データを分析できます。これらは、存在または不在、シーケンスだけでより多くの情報を提供するコーディングできます。
該当するシーケンスを収集プロトコルの重要なステップです。研究の範囲とそのグループのメンバーの分布に応じて広範な分類グループにまたがることがありますこの。目標は、蛋白質のグループ全体を理解することは、外からは報告されている通常種、いくつかのシーケンスがあることを検討してください。分類群は既によく表されます、追加シーケンスが低いまたは冗長検索から除外は適切かもしれません。BLAST 検索でヒットを取得するため基本的なルール親指に-の e 値を -05 のカットオフを使用します。E 値は、偶然予想ヒット数です。以下の信頼性の高い it のようなシーケンスを取得可能性がありますが、か特定の機能と思っているとは限りませんことこれは共有特定の特性が、高度に分化されるシーケンスのグループがある場合、いくつかの状況に適していますが、主要な特性があるが、高度に分化のシーケンスを返します。この問題に対処するいくつかの潜在的な方法があります。最初は、介在物の条件を満たすかどうかを参照してくださいに -05 遮断下にある検索で識別されるシーケンスを見てすることです。第二に、十分な情報がある場合は、位置固有反復爆発 (PSI-BLAST)22またはパターンのヒット開始ブラスト (ピピ-ブラスト)23を使用します。PSI-BLAST は次のラウンドのための新しいモデルを生成し、時々 最初の検索を特定していない検索発散シーケンスことができます最初の検索からの結果を使用します。ピピ-ブラスト クエリ シーケンスと共に提出するパターンが必要です。これは興味のパターンを含むに取得したシーケンスを制限します。このツールは、グループにユニークなモチーフを明確に識別することができる場合に特に便利です。
系統分析の正確なアライメントは欠かせません木の解釈、良い配置を使用して生成される場合のみ。配置を通知する参照を使用して、構造体または活動と見なされます場合にのみ明らかなエラーを避けるために助けることができます。シーケンスの冗長性は、プロジェクトに対して定義する必要があります。冗長に見える 2 つのシーケンスことが彼らに広く発散イチイからも、ほぼ同じ系統のためできないシーケンス、異なる構造や機能のプロパティがあります。あいまいさに関するシーケンスを含める必要がある場合、多重アライメントを生成され、アライメント変化影響系統発生の推論を確認個別に分析することができます。ここで紹介した方法は、線形を手動で調整の必要性をしないわけが、シーケンスが揃える必要があり、記載されているよりもより高度なバーコード技術と組み合わせて使える可能性がある方法を明らかにすることができます。以前13。
有用であること参照、現在単独でのシーケンスから明白ではない定義の特性を識別するために重要です。たとえば、システイン自体に関して各シーケンス番号が付けられるときの別の数字を持つシーケンス間のパターンをボンディング システインを比較することができないこととします。目標は、比較や議論、混乱の別の層を追加することを容易にすることです。参照のいくつかのイテレーションがあり、判断コールに含める機能を決定します。グループで異なるシーケンスを議論の一般的な方法を採用することがグループ全体の理解を増加することが期待されます。

特性および他の蛋白質との関係は、タンパク質の名前を反映すべき。残念ながら、名が発見の時に一般に割り当てられ、研究し続けており、大きな文脈の理解を変更可能性があります。タンパク質が独立して以上 1 つのラボ、命名やと思われる名前を割り当てるときに決定的な特性変更してもはや十分に蛋白質を区別する名前によって識別された場合、これは複数名につながることができます。他から。
無脊椎動物のディフェンシンは、変性専門語および分類の良い例を提供します。最初の無脊椎動物のディフェンシンは、昆虫から報告された、哺乳類ディフェンシン1,2知覚の相同性に基づいて提案された、名前「昆虫ディフェンシン"。用語のディフェンシンはまだ使用されて、その無脊椎動物、哺乳類のディフェンシンは、共通祖先3,4を共有しないにもかかわらず、明らかになった。種に応じて「ディフェンシン」無脊椎動物は六つまたは 8 つのシステイン (3 つまたは 4 つのジスルフィド結合となる) とさまざまな抗菌活性があります。線虫 remanei5から最近同定された cremycins などの状況、同じ特性を持つ蛋白質を複雑にディフェンシンは常に「ディフェンシン、」呼び出されませんよう。さらに、無脊椎動物の大きいディフェンシンは脊椎動物 β-ディフェンシンより他の無脊椎動物のディフェンシン6に関連する進化する可能性が高い。それにもかかわらず、研究者は時々、名前「ディフェンシン」どのシーケンスは、解析に含めるかを決定するときに依存します。
構造研究は、昆虫のディフェンシンとサソリ毒素7間の類似性を明らかにし、CS αβ 倍その後昆虫ディフェンシン8の構造特性を定義として設立されました。この倍は現在 5 つの家族が含まれています、タンパク質構造分類 (SCOP) データベース9でサソリ毒素のような (CS αβ) スーパーファミリーを定義します: 昆虫ディフェンシン、短鎖サソリ毒素、長鎖サソリ毒素MGD-1 (軟体動物) からと植物のディフェンシン。このスーパーファミリーは、最近は、cis ディフェンシン4とキャス/遺伝子 3 D データベース10、113.30.30.10 スーパーファミリーと同義です。様々 な無脊椎動物の分類、植物および菌類をこの倍を含んでいる蛋白質の名前が明確にはシステイン番号または接合パターン、抗菌活性、進化の歴史12に関連しないことから研究。
一貫性と明確な基準の欠如を名前を付け、このスーパーファミリーで新たに確認されたシーケンスの分類を困難に作る。このスーパーファミリー蛋白質を比較することに大きな障害となってシステインはそれぞれ個々 のシーケンスに対して (各シーケンスで最初のシステインは C1)、構造の役割を考慮する方法がないと番号が付けられます。これはシステインの同じ番号を持つシーケンスだけを比較できることを意味します。アラインメントと系統解析を難しくした CS αβ 折りを形成システイン以外ほとんどシーケンス保全がありません。構造的特徴を優先番号システムを開発することによってスーパーファミリー シーケンスことができますより簡単に比較して、整列します。保存機能だけでなく、これらのサブグループを定義するが、すぐに視覚化できることし、適切なコンテキストに新しいシーケンスをより簡単に配置できます。
本稿は、番号 CS αβ スーパーファミリーのシステム参照を生成する表計算ソフト (たとえばExcel) を使用します。それはこのシーケンスの比較を明確にしクマムシから識別される新しい CS αβ シーケンスに適用されますを示します。興味のシーケンスを使用する場合は、ガイダンスを提供するプロトコルを書かれた CS αβ スーパーファミリーを例として使用して、しかし、それはこのスーパーファミリーまたはシステイン豊富なシーケンスに固有するものではありません。このメソッドは、異なる分類群で独立して研究されているおよび/または分子解析ソフトウェアによって容易に認識されないことが離散特性を持つほとんどの全体的な相同タンパク質のグループに最も役に立つでしょう。されますので、限られたユーティリティの重要な機能は特定されていない場合、このメソッドは、重要な機能に関するいくつかの事前の意思決定を必要とします。主な目的は、順序関係の簡単な可視化を実現する方法を示すことです。これは、解析、配列アラインメントを通知する使用できますが、バーコード メソッドがオートメーション13のより多くの容量を持つ適切な代替になる配置と分析は主目標である場合。現在のメソッドは、3 D 構造の直接的可視化に役立つされませんので線形形式で各ペプチドの機能を表示します。

<table><tbody><tr><td>BLAST webpage</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>EditSeq (Lasergene suite)</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx</td></tr><tr><td>Excel 2013</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FigTree</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/</td></tr><tr><td>MEGA</td><td></td><td></td><td>www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MrBayes</td><td></td><td></td><td>http://mrbayes.sourceforge.net/</td></tr><tr><td>SCOP database</td><td></td><td></td><td>http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/</td></tr></tbody></table>

creating and applying a reference to facilitate the discussion and classification of proteins in a diverse group

さまざまな生物を使用して別のラボで研究されている関連タンパク質は全体としてグループを議論して、適切なコンテキストに新しいシーケンスを配置する困難の命名と分類、統一システムに欠けるかもしれない。構造に関連する重要なシーケンス機能を優先する参照の開発および/または蛋白質の多様なグループにいくつかの一貫性を追加する確立された名前に加えてアクティビティを使用できます。本稿は表示方法表計算ソフトで生成された参照することができます既存のタンパク質スーパーファミリーの間の関係を明らかにするだけでなく新しいの追加を容易にするため例としてシステイン安定化 α-ヘリックス (CS αβ) スーパーファミリーを使用します。シーケンス。それはまた参照が系統解析の妥当性に影響を与える一般的に使用されるソフトウェアで生成された配列アラインメントを絞り込むに役立つかを示しています。参照の使用は、分子解析によって適切にキャプチャされない機能を備えた、イチイの広いスペクトルからの高度に分岐のシーケンスを含む蛋白質のグループの最も役に立つでしょう。

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Creating and Applying a Reference to Facilitate the Discussion and Classification of Proteins in a Diverse Group

作成し、ディスカッションと多様なグループの蛋白質の分類を容易にする参照を適用します。

このプロトコルの目的は、首尾一貫した命名と分類基準に欠けているグループの発散の蛋白質のための参照を開発します。このリファレンスでは、分析と全体としてグループの議論を促進し、設立名に加えて、使用することができます。

Related proteins that have been studied in different labs using varying organisms may lack a uniform system of nomenclature and classification, making it ...

creating-applying-reference-to-facilitate-discussion-classification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Behavior

7.0K ビュー.  Midwestern University. このプロトコルの目的は、首尾一貫した命名と分類基準に欠けているグループの発散の蛋白質のための参照を開発します。このリファレンスでは、分析と全体としてグループの議論を促進し、設立名に加えて、使用することができます。

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Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality for: (1) The identification of related protein structure sets to user specified thresholds of similarity; (2) Their multiple alignment and structure superposition; (3) Sequence and structure conservation analysis; (4) Inter-conformer relationship mapping with principal component analysis, and (5) comparison of predicted internal dynamics via ensemble normal mode analysis. This integrated functionality provides a complete online workflow for investigating sequence-structure-dynamic relationships within protein families and superfamilies.

A protocol for the online investigation of protein sequence-structure-dynamics relationships using Bio3D-web is presented.

Bio3D-webとのタンパク質配列構造ダイナミクスの関係の研究

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

生化学

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

非正規の開いたリーディング ・ フレームから翻訳された蛋白質を発表する OpenProt データベースを利用した質量分析を用いたプロテオミクス解析

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

遺伝学

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. However, deriving biological insights from such valuable datasets is challenging. Here we introduce a systems biology-based software JUMPn, and its associated protocol to organize the proteome into protein co-expression clusters across samples and protein-protein interaction (PPI) networks connected by modules (e.g., protein complexes). Using the R/Shiny platform, the JUMPn software streamlines the analysis of co-expression clustering, pathway enrichment, and PPI module detection, with integrated data visualization and a user-friendly interface. The main steps of the protocol include installation of the JUMPn software, the definition of differentially expressed proteins or the (dys)regulated proteome, determination of meaningful co-expression clusters and PPI modules, and result visualization. While the protocol is demonstrated using an isobaric labeling-based proteome profile, JUMPn is generally applicable to a wide range of quantitative datasets (e.g., label-free proteomics). The JUMPn software and protocol thus provide a powerful tool to facilitate biological interpretation in quantitative proteomics.

We present a systems biology tool JUMPn to perform and visualize network analysis for quantitative proteomics data, with a detailed protocol including data pre-processing, co-expression clustering, pathway enrichment, and protein-protein interaction network analysis.

JUMPn:プロテオミクスにおけるタンパク質共発現クラスタリングとネットワーク解析のための合理化されたアプリケーション

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

コンピュータベースのタンパク質の構造と機能の予測のためのプロトコル

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

生物学

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

マイクロタンパク質同定と配列解析のための統合アプローチ

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

作成し、ディスカッションと多様なグループの蛋白質の分類を容易にする参照を適用します。

要約

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Bio3D-webとのタンパク質配列構造ダイナミクスの関係の研究

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

非正規の開いたリーディング・フレームから翻訳された蛋白質を発表する OpenProt データベースを利用した質量分析を用いたプロテオミクス解析

多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS)

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

JUMPn:プロテオミクスにおけるタンパク質共発現クラスタリングとネットワーク解析のための合理化されたアプリケーション

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

コンピュータベースのタンパク質の構造と機能の予測のためのプロトコル

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

マイクロタンパク質同定と配列解析のための統合アプローチ

作成し、ディスカッションと多様なグループの蛋白質の分類を容易にする参照を適用します。

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Bio3D-webとのタンパク質配列構造ダイナミクスの関係の研究

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多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS)

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短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

コンピュータベースのタンパク質の構造と機能の予測のためのプロトコル

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

マイクロタンパク質同定と配列解析のための統合アプローチ

非正規の開いたリーディング・フレームから翻訳された蛋白質を発表する OpenProt データベースを利用した質量分析を用いたプロテオミクス解析