Investigação em curso tardigrade peptídeo antimicrobiano é suportada pelo intramural de financiamento do centro-oeste Universidade escritório de pesquisa e programas patrocinados (ORSP). O ORSP não tinha qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados, análise, interpretação ou preparação do manuscrito.

1. determinar as características de definição do grupo de proteínas de interesse <ol><li>publicações anteriores de consulta para determinar se há um consenso sobre os recursos que são necessários para ser considerado parte do grupo. Tome nota de quaisquer inconsistências ou diferenças de opinião entre grupos de pesquisa e incluem características que podem servir para diferenciar um subgrupo de outro.</li>
	<li>Se a literatura anterior não resolver características definidoras, use sequências que são consideradas representativas do grupo como ponto de partida para identificar características conservadas.</li>
</ol> 2. Recolher sequências relevantes <ol><li>se comentários foram escritos que incluem análises de sequências que estão representando o grupo, incluem essas sequências no conjunto de dados bruto. Recuperar sequências usando números de adesão referenciados na literatura e salvar em uma sequência padrão, programa de edição (por exemplo, EditSeq em suíte Lasergene ou um dos muitos disponíveis para on-line gratuito).</li>
	<li>Se o grupo em questão tiver sido definido em um dos bancos de dados estruturais, incluem as sequências de que listas de banco de dados como sendo parte do grupo... recuperar sequências usando números de adesão fornecidos no banco de dados e salvar em uma sequência padrão de edição programa, como acima. 
	Nota: por exemplo, as sequências categorizadas na superfamília CS-αβ (Escorpião toxina semelhante) no banco de dados SCOP podem ser encontradas aqui: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.</li> <li>executar básico Local Pesquisas de 14 alinhamento ferramenta de pesquisa (explosão) do públicos on-line bancos de dados, disponíveis através do centro nacional para Biotechnology Information (NCBI) para encontrar as sequências que podem não ter sido incluídas na literatura ou estruturais bancos de dados. Para a maioria resultados completos, use tanto a proteína BLAST (blastp) e traduzido explosão com programas de consulta (tblastn) de proteína; Estes estão disponíveis em: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
	<ol><li>Sequências de uso conhecidas por ser parte do grupo de interesse, como sequências de consulta. Copiar e colar a sequência na caixa Pesquisar na parte superior ou fornecer um GenBank adesão número gi identificador ou, se disponível.</li>
		<li>Escolher o banco de dados no menu suspenso. Escolha sequências de proteína não-redundante (nr) para blastp e expressou tag sequência para tblastn.</li>
		<li>Busca de resultados específicos dos táxons no organismo de configuração digitando o nome do táxon ou do organismo e escolhendo na lista exibida durante a digitação. Para adicionar organismos adicionais ou táxons para excluir, clique no &#34; + &#34; botão e outro campo aparecerá. Excluir qualquer táxons não desejadas na caixa de organismo, digitando o nome do organismo ou táxon, escolhendo na lista exibida durante a digitação e verificando a &#34; excluir &#34; caixa à direita.</li>
		<li>Acessar parâmetros adicionais clicando no &#34; parâmetros de algoritmo &#34; perto da parte inferior da página. Deixe no padrão, a menos que haja uma justificativa para alterar um parâmetro.</li>
		<li>Clique o &#34; explosão &#34; botão para executar a análise; pode demorar algum tempo para que os resultados aparecem. Em geral, recuperar hits com um esperado valor (ou e-valor) de &#34; -05 &#34; ou melhor e salvar em uma sequência padrão, programa de edição.
		<ol><li>Se todos os hits estão acima desse limite, execute novamente a pesquisa com um aumento do número de sequências de destino (na seção de parâmetros do algoritmo) para obter todas as sequências relevantes.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Se necessário, apare as sequências para excluir informações irrelevantes (por exemplo, a dobra de CS-αβ aplica-se somente para o peptídeo maduro). Identificar o sinal peptídeos e pro-peptídeos para remoção usando ProP 15 (disponível on-line), ou SignalP para mais sofisticados sinal peptídeo previsão 16 (disponível on-line).</li>
</ol> 3. Gerar uma referência em uma planilha com base nos importantes recursos que foram identificados <ol><li>identifica as características que definem o grupo de interesse. Por exemplo, usar a dobra de CS-αβ definitivamente estabelecida pela estrutura de solução de insecto defensina A partir da mosca negra terraenovae ( Figura 1) 8.
	<ol><li>Deste aprisco inclui um motivo menor chamado a hélice estabilizada cisteína (CSH) 17; identificar esse motivo por um CXXXC (onde X é qualquer aminoácido) montante de um CXC que formam duas ligações de bissulfeto ( Figura 1 , sólido rosa linhas). 
		Nota: Para completar o tema CS-αβ, uma terceira ligação dissulfureto é formada a partir de cisteínas adicionais colocadas antes de cada metade do motivo do CSH ( Figura 1, pontilhada de linhas-de-rosa).</li>
	</ol></li> <li>Entrar estas definindo características em uma planilha. Consulte a Figura 2.
	<ol><li>Colunas de uso para as características conservadas e para representar os espaços entre estas características. Manter as colunas largas o suficiente para caber a números e garantir que eles tenham uma largura consistente. Definir a largura usando o &#34; formato | Largura da coluna &#34; função ( Figura 2, seta rosa).</li>
		<li>Usar as linhas para os nomes de sequência.</li>
		<li>Quando uma sequência tem o recurso, preencha a caixa usando a função de preenchimento ( Figura 2, Praça rosa). Para espaçamento entre recursos, insira o número de aminoácidos na caixa entre e deixá-lo vazio. Por exemplo, usando o inseto defensina sequência dá uma referência que inclui seis cisteínas, com espaçamentos definidos entre C2 e C3 e C5 e C6.</li>
	</ol></li> <li>Adicionar sequências representativas que foram previamente estabelecidas como membros do grupo, baseado na literatura e bancos de dados estruturais. 
	Nota: por exemplo, literatura anterior e banco de dados SCOP identificam vários grupos para inclusão: insetos defensinas, toxinas de cadeia curta Escorpião, Escorpião de cadeia longa toxinas, MGD-1 planta defensinas, nematódeo ABFs, drosomycins da drosófila, e macins. A literatura também identifica uma sequência bacteriana com apenas quatro cisteínas que representasse o ancestral desta superfamília 18. Adicionar essas sequências aumenta o número de cisteínas na referência de seis a dez anos, mas mantém o alinhamento das características estruturais importantes ( Figura 3).
	<ol><li>Para adicionar um recurso que é provável que definir um subgrupo de sequências (por exemplo, uma cisteína extra), use o &#34; inserir &#34; função ( Figura 3, flecha-de-rosa).</li>
		<li>Se existem recursos faltando em uma determinada sequência, deixar a caixa vazia e combiná-lo com caixas representando intermediárias de aminoácidos. Se necessário, mesclar as células usando o recurso de mesclagem e centro ( Figura 3, caixa-de-rosa).</li>
	</ol></li> <li>Continuar adicionando sequências aos grupos para obter uma melhor imagem da variação de cada grupo da superfamília maior. Resumir as características do grupo para facilitar comparações ( Figura 4).
	<ol><li>Quando o número de aminoácidos entre os principais recursos varia, usar um hífen para indicar um intervalo, como 6-12 (6 a 12 aminoácidos) e uma barra para indicar ou / ou, como 7/10 (7 ou 10 aminoácidos).</li>
		<li>Escolher uma maneira de anotar características de sequências que podem ser relevantes, mas não ocorrem com frequência suficiente para incluir na referência. Por exemplo, desde cisteínas são importantes para esta superfamília, rotular cisteínas adicionais ( Figura 4, caixas-de-rosa).</li>
	</ol></li> <li>Adicionar proposequências de y-identificado na planilha usando as sequências estabelecidas como um guia. Por exemplo, adicionando sequências de tardigrades (amarelo) mostra que as sequências tardigrade cair em diferentes grupos da superfamília ( a Figura 5 mostra resumos em vez de uma linha para cada sequência para fins de espaço).</li>
	<li>Mostrar a variabilidade dentro de um grupo taxonômico rearranjando as linhas ( Figura 6).</li>
</ol> 4. Usar a referência para refinar alinhamentos de aminoácido Nota: existem muitos programas que podem ser usados para alinhamentos múltiplos da sequência, mas esta demonstração irá utilizar a análise genética evolutiva Molecular (MEGA6) 19 porque está disponível para download gratuito.
<ol><li>Download e instalar o software.</li>
	<li>Comece um novo alinhamento no MEGA selecionando &#34; editar/construir alinhamento &#34; sob o Tab. Align selecione &#34; criar um novo alinhamento &#34; na caixa que aparece e clique em &#34; Okey. &#34; em seguida, selecione &#34; proteína. &#34;</li>
	<li>Select &#34; inserir a sequência de arquivo &#34; no &#34; editar &#34; menu para importar as sequências de. 
	Nota: Sequências precisará estar no formato FASTA para importação na MEGA. Cores de fundo que refletem tipos diferentes de aminoácidos são usadas por padrão, mas esta opção pode ser desativada sob o &#34; Display &#34; menu.</li>
	<li>Uma vez todas as sequências são inseridas, clique no ícone de braço flexionando e depois &#34; alinhar proteína &#34; para alinhar as sequências usando o algoritmo de músculo 20. 
	Nota: O ClustalW também está disponível.
	<ol><li>Se uma mensagem dizendo que nada tem estado selecionado aparece e pede para selecionar tudo, clique &#34; Okey. &#34;</li> <li>Nota: isso abre uma janela que permite alterar alguns parâmetros, mas eles só devem ser alterados não há razão para fazê-lo. Esta análise usa um subconjunto das sequências analisadas em um anterior de papel 12.</li>
	</ol></li> <li>Verificar o alinhamento baseado nas características do importantes; Observe que na barra superior as sequências irá mostrar todas as colunas onde o aminoácido é completamente conservada (*). Ver Figura 7. Veja que o alinhamento inicial mostra apenas três as quatro cisteínas conservadas ( Figura 7, caixas-de-rosa); olhando para baixo a coluna, a sequência de AlCRP é claramente alinhada ( Figura 7, flecha-de-rosa).</li>
	<li>Para se livrar da grande lacuna entre o eu e o C conservada, realçar os traços e pressione o &#34; excluir &#34; chave. Não destacar qualquer aminoácidos, ou eles serão excluídos também.</li>
	<li>De aminoácidos para a direita mover-se, destacar e pressione barra de espaço
	<ol><li>Nota que a AlCRP tem agora as cisteínas estruturais alinhadas e que a última C do motivo do CXXXC é conservada durante todo o alinhamento ( Figura 8). Ajustar o alinhamento conforme necessário para priorizar as características mais importantes das sequências.</li>
	</ol></li></ol> 5. Comparar os grupos identificados usando a referência com resultados de análises filogenéticas <ol><li>de alinhamentos preliminares, determinar quais as sequências devem ser incluídas em uma análise filogenética; para um pequeno número de sequências, esta etapa pode ser desnecessário.
	<ol><li>Manter um arquivo de alinhamento que inclua todas as sequências, mas para uma análise filogenética, remover sequências redundantes ( Figura 9, rosa caixas mostrar pares de sequências redundantes).</li>
		<li>Se o conjunto de dados inclui um grande número de sequências, execute uma análise preliminar e selecionados representantes de grupos que sempre formam um clado.</li>
	</ol></li> <li>Determinar o melhor modelo de substituição de aminoácido.
	<ol><li>Exportar o alinhamento no formato MEGA (sob a guia de dados).</li>
		<li>Vá para o menu de modelos e selecione &#34; encontrar melhores DNA/proteína modelo. &#34; escolha o arquivo que acabou de salvar e abri-lo; isso abrirá uma janela que tem alguns parâmetros que podem ser alterados.</li>
		<li>Usar os parâmetros padrão, a menos que haja uma razão para mudá-los. Clique &#34; calcular &#34; para começar a análise.</li>
	</ol></li> <li>Executar uma análise de máxima verossimilhança (ML) na MEGA.
	<ol><li>Escolher &#34; árvore de probabilidade máxima de construção/teste &#34; do menu de filogenia.</li>
		<li>Escolher o modelo determinado a ser o melhor ajuste para os dados da etapa 5.2 (a saída dar-se-á o modelo de substituição, bem como o melhor &#34; taxas entre sites &#34; parâmetro).</li>
		<li>1.000 escolher inicialização Replica para obter as medidas de apoio para a árvore.</li>
		<li>Clique &#34; calcular &#34; para executar a análise; MEGA tem um &#34; Tree Explorer &#34; para visualizar a árvore.</li>
	</ol></li> <li>Executar uma análise Bayesiana em MrBayes software open-source 21. 
	Nota: Um manual de MrBayes também está disponível neste site. Este destina-se a fornecer os passos básicos e não é um guia completo para realização de análise filogenética de Bayesian.
	<ol><li>Exportar o alinhamento de MEGA no formato PAUP (Nexus) na mesma pasta como o programa MrBayes.</li>
		<li>MrBayes aberto e tipo &#34; exe Filename &#34; (por exemplo, &#34; exe Alignment.nex &#34;).</li>
		<li>Especificar os parâmetros do modelo e análise. Escolher ou o modelo especificado na etapa 5.2 ou escolher o &#34; misto &#34; configuração que irá experimentar vários modelos e relatar a frequência do modelo nas árvores com as melhores probabilidades posteriores (prset aamodelpr = misto). Tipo &#34; showmodel &#34; para relatar as configurações atuais do modelo e &#34; ajudar mcmc &#34; Mostrar configurações de parâmetro atual, com uma breve explicação de cada um.</li>
		<li>Definir o número de gerações usando o &#34; mcmcp ngen = &#34; comando (1 milhão é típico).</li>
		<li>Tipo &#34; mcmc &#34; para começar a análise.</li>
		<li>Quando o número de gerações foi concluída, o programa irá pedir para adicionar mais gerações. Se o desvio-padrão médio das frequências de divisão é inferior a 0,1, digite n. Se está acima de 0,1, a análise deve ser permitida para continuar, ou alguns parâmetros devem ser alterados (Veja o manual).</li>
		<li>Uso o &#34; sumt &#34; comando para gerar a árvore de arquivos.</li>
		<li>Depois que a análise estiver concluída e uma árvore de consenso é gerada, a árvore pode ser visualizada em FigTree (disponível on-line).</li>
	</ol></li> <li>Comparar as árvores para ver se os métodos geram resultados consistentes. 
	Nota: Algumas sequências não fornecem muitas informações: as árvores podem não ser bem resolvidas e os ramos podem ter suporte mínimo ( Figura 10).</li>
	<li>Comparar árvores para os grupos identificados usando a referência para ver se estes grupos de apoio as análises filogenéticas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Matsuyama, K., Natori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Three+Antibacterial+Proteins+from+the+Culture+Medium+of+NIH-Sape-4,+an+Embryonic+Cell+Line+of+Sarcophaga+peregrina.">Purification of Three Antibacterial Proteins from the Culture Medium of NIH-Sape-4, an Embryonic Cell Line of Sarcophaga peregrina.</a> J Biol Chem. 263 (32), 17112-17116 (1988).</li><li>Lambert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immunity:+Isolation+from+immune+blood+of+the+dipteran+Phormia+terranovae.+of+two+insect+antibacterial+peptides+with+sequence+homology+to+rabbit+lung+macrophage+bactericidal+peptides.">Insect immunity: Isolation from immune blood of the dipteran Phormia terranovae. of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides.</a> PNAS. 86 (262-266), (1989).</li><li>Dimarcq, J. -. 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O autor não tem nada para divulgar.

Os critérios para a nomeação de uma proteína dentro de um grupo devem ser claros, mas isso não é sempre o caso. Sequências que têm o CS-αβ dobre têm sido estudadas em muitos laboratórios usando uma variedade de organismos, resultando em diferentes sistemas de nomenclatura, bem como diferentes níveis de caracterização. A tentativa de impor uma completamente nova nomenclatura não é razoável e resultaria em uma grande quantidade de confusão quando consultar a literatura anterior. Uma sistema de numeraçã...

Nome de uma proteína deve refletir é características e relação com outras proteínas. Infelizmente, geralmente os nomes são atribuídos no momento da descoberta e, como a investigação continua, pode mudar o entendimento do contexto maior. Isso pode levar a vários nomes se uma proteína independente foi identificada por mais de um laboratório, para mudanças na nomenclatura ou nas características supostamente definitivo ao atribuir o nome e o nome já não suficientemente diferenciando a proteína dos outros.
Invertebrados defensinas fornecem um bom exemplo de degeneração na nomenclatura e classificação. As primeiras defensinas invertebradas foram relatadas de insetos, e o nome "inseto defensina" foi proposto com base na homologia percebida para mamíferos defensinas1,2. O termo defensina ainda é usado, mesmo que é agora claro que defensinas invertebradas e mamíferos não compartilham um ancestral comum de3,4. Dependendo da espécie, um invertebrado "defensina" pode ter seis ou oito cisteínas (que formam três ou quatro ligações de bissulfeto) e uma variedade de atividades antimicrobianas. Para complicar a situação, as proteínas com as mesmas características como defensinas não são sempre chamadas "defensinas," tais como o cremycins recentemente identificados de Caenorhabditis remanei5. Além disso, defensinas grandes invertebradas são mais propensos a ser evolutivamente relacionadas com vertebrados β-defensinas do que para outros invertebrados defensinas6. Apesar disso, pesquisadores às vezes contam com o nome "defensina" ao determinar quais sequências devem ser incluídas nas análises.
Estudos estruturais revelaram a similaridade entre insetos defensinas e Escorpião toxinas7, e a dobra de CS-αβ posteriormente foi estabelecida como a característica estrutural do inseto defensinas8. Esta dobra define superfamília (CS-αβ) semelhantes a toxina de Escorpião na classificação estrutural das proteínas (SCOP) banco de dados9, que atualmente inclui cinco famílias: defensinas insetos, toxinas de cadeia curta Escorpião, Escorpião de cadeia longa toxinas, MGD-1 (a partir de um molusco) e defensinas de plantas. Esta superfamília é sinônimo com o recentemente descrito cis-defensinas4 e superfamília 3.30.30.10 na base de dados 3D CATH/Gene10,11. Estudos de uma variedade de táxons de invertebrados, plantas e fungos mostrar que os nomes das proteínas que contêm esta dobra não estão claramente relacionados com número de cisteína ou padrão de ligação, atividade antimicrobiana ou história evolutiva12.
A falta de consistência e critérios claros torná-lo desafiador para nomear e classificar sequências recentemente identificados nesta superfamília. Um grande obstáculo para comparar as proteínas esta superfamília é que cisteínas estão contadas em relação a cada sequência individual (a primeira cisteína em cada sequência é C1), com nenhuma forma de contabilizar o papel estrutural. Isto significa que podem ser comparadas apenas sequências com o mesmo número de cisteínas. Há pouco conservação de sequência que não seja as cisteínas formando a dobra de CS-αβ, que dificulta a alinhamentos e análises filogenéticas. Através do desenvolvimento de um sistema de numeração que prioriza as características estruturais, superfamília sequências podem ser mais facilmente comparadas e alinhadas. Características conservadas, bem como aqueles definir subgrupos, podem ser visualizadas rapidamente, e novas sequências podem ser mais facilmente colocadas no contexto apropriado.
Este artigo usa um software de planilha (por exemplo, Excel) para gerar uma referência a numeração para a superfamília de CS-αβ. Ele mostra como isso esclarece comparações entre sequências e aplica a novas sequências de CS-αβ, identificadas a partir tardigrades. Usando a superfamília de CS-αβ como um exemplo, o protocolo foi escrito para fornecer orientação ao usar sequências de interesse; no entanto, não se destina especificamente para esta superfamília ou sequências de rica em cisteína. Este método provavelmente será mais útil para grupos de proteínas que foram pesquisadas independentemente dos táxons divergentes e/ou tem pouca homologia de sequência geral, com características distintas que não podem ser facilmente reconhecidos pelo software de análise molecular. Este método requer algumas decisões a priori sobre características importantes, por isso vai ser de utilidade limitada se não características importantes foram identificadas. O objetivo principal é mostrar como uma simples visualização das relações sequência pode ser alcançada. Isto pode ser usado para informar o alinhamento da sequência e análise, mas se o alinhamento e a análise são os principais objetivos, um método de código de barras seria uma alternativa adequada que tem mais capacidade para automação13. O método atual exibe as características de cada peptídeo de forma linear, por isso não vai ser útil para a visualização directa da estrutura 3D.

<table><tbody><tr><td>BLAST webpage</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>EditSeq (Lasergene suite)</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx</td></tr><tr><td>Excel 2013</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FigTree</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/</td></tr><tr><td>MEGA</td><td></td><td></td><td>www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MrBayes</td><td></td><td></td><td>http://mrbayes.sourceforge.net/</td></tr><tr><td>SCOP database</td><td></td><td></td><td>http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/</td></tr></tbody></table>

creating and applying a reference to facilitate the discussion and classification of proteins in a diverse group

Proteínas relacionadas que têm sido estudadas em laboratórios diferentes, usando diferentes organismos podem carecer de um sistema uniforme de nomenclatura e classificação, dificultando a discutir no grupo como um todo e colocar novas sequências no contexto apropriado. Desenvolver uma referência que prioriza recursos sequência importantes relacionadas com a estrutura e/ou atividade pode ser usada para além de nomes estabelecidos para adicionar alguma coerência a um grupo diverso de proteínas. Este papel utiliza a superfamília da cisteína-estabilizado alfa-hélice (CS-αβ) como um exemplo para mostrar como uma referência gerada no software de planilha pode clarificar as relações entre proteínas existentes na superfamília, bem como facilitar a adição de novos sequências. Ele também mostra como a referência pode ajudar a refinar os alinhamentos de sequência gerados no software comumente usado, o que afeta a validade das análises filogenéticas. O uso de uma referência provavelmente será mais útil para grupos de proteínas que incluem sequências altamente divergentes de um amplo espectro de táxons, com características que não são adequadamente capturadas por análises moleculares.

Grupos de sequências na superfamília CS-αβ relatados na literatura são mostrados na Figura 4. Os pares de cisteína baseados a numeração para cada sequência de sugerem cinco grupos básicos (tabela 1, coluna do meio). Grupo 1 tem seis cisteínas que de bissulfeto de três títulos e inclui sequências de insetos, aracnídeos, moluscos, nematoides e fungos. Grupos 2, 3 e 4 têm 8 cisteínas que formam quatro ligações de bissulfeto. G...

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Creating and Applying a Reference to Facilitate the Discussion and Classification of Proteins in a Diverse Group

Criando e aplicando uma referência para facilitar a discussão e a classificação das proteínas em diversos grupos

O objetivo do presente protocolo é desenvolver uma referência para proteínas divergentes em um grupo que carece de critérios coerentes de nomenclatura e classificação. Esta referência irá facilitar as análises e discussões do grupo como um todo e pode ser usada além de nomes estabelecidos.

Related proteins that have been studied in different labs using varying organisms may lack a uniform system of nomenclature and classification, making it ...

creating-applying-reference-to-facilitate-discussion-classification

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

7.0K visualizações.  Midwestern University. O objetivo do presente protocolo é desenvolver uma referência para proteínas divergentes em um grupo que carece de critérios coerentes de nomenclatura e classificação. Esta referência irá facilitar as análises e discussões do grupo como um todo e pode ser usada além de nomes estabelecidos.

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Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality for: (1) The identification of related protein structure sets to user specified thresholds of similarity; (2) Their multiple alignment and structure superposition; (3) Sequence and structure conservation analysis; (4) Inter-conformer relationship mapping with principal component analysis, and (5) comparison of predicted internal dynamics via ensemble normal mode analysis. This integrated functionality provides a complete online workflow for investigating sequence-structure-dynamic relationships within protein families and superfamilies.

A protocol for the online investigation of protein sequence-structure-dynamics relationships using Bio3D-web is presented.

Investigando a Seqüência de Proteínas - Estrutura-dinâmica Relacionamentos com Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Bioquímica

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Espectrometria de massa-baseado Proteomics análises usando banco de dados OpenProt para desvendar novas proteínas traduzidas de Frames de leitura abertos não-canônicos

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Genética

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. However, deriving biological insights from such valuable datasets is challenging. Here we introduce a systems biology-based software JUMPn, and its associated protocol to organize the proteome into protein co-expression clusters across samples and protein-protein interaction (PPI) networks connected by modules (e.g., protein complexes). Using the R/Shiny platform, the JUMPn software streamlines the analysis of co-expression clustering, pathway enrichment, and PPI module detection, with integrated data visualization and a user-friendly interface. The main steps of the protocol include installation of the JUMPn software, the definition of differentially expressed proteins or the (dys)regulated proteome, determination of meaningful co-expression clusters and PPI modules, and result visualization. While the protocol is demonstrated using an isobaric labeling-based proteome profile, JUMPn is generally applicable to a wide range of quantitative datasets (e.g., label-free proteomics). The JUMPn software and protocol thus provide a powerful tool to facilitate biological interpretation in quantitative proteomics.

We present a systems biology tool JUMPn to perform and visualize network analysis for quantitative proteomics data, with a detailed protocol including data pre-processing, co-expression clustering, pathway enrichment, and protein-protein interaction network analysis.

JUMPn: Uma aplicação simplificada para agrupamento de co-expressão de proteínas e análise de rede em proteômica

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

Um protocolo para Computer-Based Estrutura de Proteínas e de Previsão de Função

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Biologia

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interactome-Seq: Um protocolo para a construção da biblioteca de Domainome, a validação e a seleção por Phage Display e a próxima geração de sequenciamento

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

Uma abordagem integrada para identificação de microproteínas e análise de sequências

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...