プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

このプロトコルの主な利点は、標識のコストを削減し、タンパク質抽出を改善し、高品質のデータを生成することです。当社のプロトコルの主な利点は、さまざまな種類のサンプルのラベル作成効率、再現性、信頼性の高いデータ取得です。IACUC承認プロトコルに従って安楽死させたマウスから四頭筋組織サンプルを分離した後、筋組織の10ミリグラムを計量し、ピンセットを使用して筋線維を分離する。

リセートを作成するには、分離した組織サンプルを、200マイクロリットルの1ミリジルコニアシリカビーズと500マイクロリットルのCHAPSライシスバッファーを含む2ミリリットルチューブに移します。ビーズのディスラプターにサンプルを入れ、2回の連続した45秒の実行を行います。第2サイクル後、DNA結合タンパク質を放出し、氷上で30秒間隔で50%振幅で超音波処理ごとに10秒間サンプルを10回超音波処理する。

最後の超音波処理の後、遠心分離物は、リゼートを、新しい遠心管に上清を転送します。還元/アルキル化試薬処理のために、新しい遠心管に条件ごとに200マイクログラムのタンパク質を移し、新鮮なCHAPSライシスバッファーを使用して各チューブの最終体積を最大100マイクロリットルにします。次に、各チューブに5マイクロリットルのTCEPを加え、55°Cで1時間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、132ミリモルTEABの132マイクロリットルに9ミリグラムのヨウドアセトアミドを溶解し、得られた375ミリモルのヨウドアセトアセトアミド溶液を光から保護する。その後、各サンプルに5マイクロリットルのヨウドアセトアミドを加え、光から保護された室温で30分間インキュベートします。メタノール/クロロホルム沈殿の場合、各100マイクロリットルのタンパク質に400マイクロリットルのメタノールを加え、サンプルを短時間渦液にします。

サンプルチューブの側面に堆積した液体を組み込むために、サンプルを簡単に遠心分離し、各チューブにクロロホルムの100マイクロリットルを追加します。短い渦の後、すぐにチューブを再び遠心分離してチューブの側面の液体を収集し、サンプルに300マイクロリットルの水を加えます。同じ遠心分離条件下で1分間、均質な溶液と遠心分離液を得るために激しく渦巻く。

遠心分離機の端に、チューブを慎重にラックに移し、重ね合わさから慎重に取り外します。残りのインター相とボトム相に300マイクロリットルのメタノールを加え、再び激しくサンプルを渦盛りします。サンプルを2分間遠心分離し、上清を慎重に吸引します。

その後、ペレットが少しししっとりと湿るまで、空気の流れの下で可能な限り多くの液体を各サンプルから穏やかに吸引します。約10分間、2分ごとに水分補給を評価します。必要に応じて、ペレットは、さらなる処理までマイナス80°Cで保存することができます。

タンパク質を消化するには、沈殿したペレットを100マイクロリットルのTEAB溶解バッファーに再懸濁し、100マイクログラムのトリプシンガラスバイアルの底に100マイクロリットルのトリプシン貯蔵溶液を加える。室温で5分後、各サンプルにタンパク質100マイクログラムあたり2.5マイクロリットルの作り出しトリプシン溶液を加え、一晩で摂氏37度でサンプルをインキュベートします。ペプチド標識の場合、各0.8ミリグラムのTMTタグバイアルをタグあたり41マイクロリットルの無水アセトニトリルで溶解し、ラベルを光から保護したまま、時折渦巻きで室温で5分間試薬をインキュベートします。

インキュベーションの終わりに、バイアルを短時間遠心分離し、室温で1時間インキュベーションするために各100マイクロリットルサンプルにTMTラベル試薬の41マイクロリットルを慎重に加えます。インキュベーションの終わりに、室温で15分間5%ヒドロキシラミンの8マイクロリットルを添加して反応をクエンチします。その後、マイナス80°Cで貯蔵するための新しい遠心管で等しいアリコートにサンプルを分割します。

この代表的なデータ取得において、39,653個のペプチドを分析し、そのうち4,457は2つの固有ペプチドを持ち、3,829は全てのチャネルに対してレポーターイオンを含んでいた。フォールド変化カットオフは、有意に低い存在量の296タンパク質および有意に高い存在量の108タンパク質を有する健康な細胞と比較して、病気からのタンパク質の相対的分布を決定するために使用された。パンサー分析は、その分子機能に基づいて、著しく低いまたはより高い存在量の疾患細胞に基づいてタンパク質の分類されたリストを示した。

有意に低いまたはより高い存在量のタンパク質の文字列分析は、さらにタンパク質間の複数の相互作用および強い関連を同定した。追加の方法は、タンパク質間相互作用を識別し、グループによって相互作用を分類し、さまざまな経路における相互作用を同定するために行うことができる。プロテオミクス技術は、詳細なタンパク質豊富情報を提供することにより、疾患発生のメカニズムを理解するためのバイオメディカル研究分野の強力なツールです。