著者は、独立賞 (K99CA201603) への国民の健康道機関国立がん研究所をご了承ください。

このプロトコルで使われる新生児ラット心筋細胞は次の機関動物ケアおよび Brigham および女性の病院の使用委員会によって承認された確立された手順56 2 日古い Sprague-dawley ラットから分離された.
1、Bioprinter の計測
<ol>
	<li>デュアルレイヤー、同心円状のマイクロ ヘッド; を構築するシースとして (例えば、18 G、1/2 インチ) 大きい鈍針の中心にコアとして (例えば、27 G、1 インチ) より小さい鈍針を挿入します。コア針が少し出ていることを確認してください (~ 1 mm) 外側シェル (図 1A) よりも長い。通常、先端で同心円配置を支援するためにバレルの側面内側/外側の針の間に適切なサイズのスペーサーを必要ことができます一時的挟ま場合が手動で、配置が調整されます。エポキシ接着剤でバレルの接合部をシールし、該当する場合の先端側からアライメント スペーサーを削除します。</li>
	<li>逆方向の中央の針のバレルに別の針 (23 G) を挿入します。 外側の針のバレルの側面にある穴を生成し、穴に、エポキシ接着剤でシールの順にサイズの一致の金属製のコネクタを挿入します。</li>
	<li>2 つの塩ビ管を bioink 及び架橋液の注入のデュアル チャネル シリンジ ポンプに印字ヘッドの入り江を個別に接続します。Poly(methyl methacrylate) は、プラスチック製のホルダーを使用して bioprinter の頭の上に押出機をマウントします。 注: Bioprinter 選択は、可用性に依存します。ここで私達は正常にいくつかの市販の bioprinters にこのセットアップをテストしました。ただし、x ・ y ・ z 電動ステージを備えて bioprinter 必要があります、原則として、有効にこのマイクロ プリント ヘッドの統合。</li>
</ol>
2. バイオプリンティングを用いた血管床
<ol>
	<li>アルギン酸 (4 w/v%、低粘度)、ゼラチン (ゲルマ、1-2 w/v%) メタクリロイル57,58,:dic Irgacure 2959 の混合物を使用して bioink を作る (0.2 - 0.5 wt.%) 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-イルに溶解] エタン スルホン酸 (HEPES 緩衝液 pH 7.4) 含む 10 vol.% ウシ胎児血清 (FBS)。</li>
	<li>10 vol.% 架橋キャリア流体として FBS を含む HEPES バッファーで 0.3 M CaCl2溶液を作ります。</li>
	<li>バイオプリンティングの直前に 5-10 分の治療を 0.05 w/v% トリプシンによるフラスコからひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) を切り離して、5-10 × 106セル/mL の濃度で bioink で細胞を再懸濁します。均一な分布を確実にゆっくりと 5 から 10 倍の懸濁液をピペットします。</li>
	<li>5 μ L/mL の同じ流量でデュアル チャネルのシリンジ ポンプを使用して bioink/架橋液の注入を開始します。フローは、彼らが安定するまで最大 1 分間継続的に実行する許可されます。その後、約 4 mm/s (図 1B) の堆積速度で bioprinter を制御することで印字ヘッドの移動を開始します。これらの速度は微調整が必要な場合があります最適バイオプリンティングを確保するため各新しいセットアップとチューニングします。バイオプリンティング プロセスは通常室温 (21-25 ° C) で行なわれるが、この温度を変更可能性があります。アルギン酸コンポーネントの高速イオン性ゲル化とを用いた足場 (図 1B) の沈着バイオプリンティング処理できるようにします。</li>
	<li>足場は、bioprinted が、した後は 20-30 s (図 1C) さらに光架橋約 5-10 mW/cm2の紫外線 (360-480 nm) で、ゲルマ成分による化学ゲル化を達成するため。</li>
	<li>バイオプリンティング架橋続いて、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 過剰 CaCl2を削除すると足場を軽くすすいでください。培養内皮細胞成長培地 (EGM) まで 16 日間の 37 ° C および 5 vol.% CO2でインキュベーターで媒体で Huvec 満載を用いた足場少なくとも 2 日ごとに変更。培養期間中に顕微鏡下で比較の形態を監視します。</li>
</ol>
3. 血管柄付き組織を構築します。
<ol>
	<li>比較は、ルーメンのような構造 (図 1D) を形成する足場に超極細の周辺に移行して、一度足場を取得し、優しく (例えばpolymethylsiloxane [PDMS] のスラブ) 疎水性表面上に配置します。フィルター滅菌の紙切れを使用して、毛管力と足場の間質性スペースからすべてのメディアを慎重に取り外します。</li>
	<li>すぐに培地での足場は、足場 (図 1E) の間質性スペース全体に潜入する必要があります上に 1-10 × 106セル/ml の密度で二次電池の種類 (例えば、心筋細胞) の懸濁液の滴 (約 20-40 μ L) を追加します。0.5 - 個々 の超極細に付着する細胞を許可するように 2 h のためのインキュベーター (37 ° C, 5 vol.% CO2、相対湿度 95%) でこのような構成を孵化させなさい。顕著な蒸発が観測されないように期間液滴サイズを監視します。</li>
	<li>目的の血管柄付きの組織が形成されるまで関連媒体の非付着性のセルおよび文化構成を削除する PBS 風呂で揺することによって足場は水洗い。</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

コーアクシャルのプリント ヘッドの構造は、コアと鞘から架橋剤からの両方の bioink の同時配信を可能にするのに成功したマイクロ バイオプリンティングに向けての重要なステップを表します。このプロトコルでは例のプリント ヘッドはシェルとコアと 18 G 針 27 G 針を使用して作成された中、は、さまざまな針のサイズが異なるを使用して組み合わせを容易に拡張可能性があります。ただし、フロー量の変化での結果は、各段階で配信、針のサイズの変化、bioink と (個別に調整可能なデュアル チャネルの 1 つではなく 2 つのシリンジ ポンプを使用して)、架橋剤との両方の可能性がありますも、bioprinter によって生じた堆積速度流量のさらなる最適化が必要になります。
現在のプロトコルのパラメーター (蒸着速度、流量、針のサイズ) の組み合わせは、中55平衡後約 150 μ m に膨らむだろう堆積直後約 120 μ m の直径を持つ bioprinted 超極細につながった。超極細の層の間のスペースがなかったのでこのようなサイズはまた約 bioprinted 構造の層の厚さに等しい。Bioprinted 超極細径はすべて 3 パラメーター54,の63; 関数です。架橋剤や成膜速度流量鞘針のサイズは、超極細径と負の相関に対し、超極細径と、bioink の流量と印字ヘッドのコア針のサイズは正の相関します。任意構造54,55を用いた足場の沈着量の印字ヘッドおよび/またはモーターを備えられた段階の動きを制御できるようになります。
さらに、bioink の定式化は、同様バイオプリンティングのプロファイルを変更可能性があります。たとえば、アルギン酸とゲルマの量を特定の用途に合わせて少し調整できます、ポリエチレン ・ グリコール-テトラアクリ レート (PEGTA) bioprinted 超極細40の力学を増加させるなど、bioink に付加的な材料をブレンドすることが可能。UV 架橋も埋め込まれた内皮細胞54の動作に影響することができますさらに bioprinted 超極細センターの機械的性質を決定します。このプロトコルでは報告されたパラメーターは、比較用に最適化されました。ただし、それは、血管内皮細胞の種類ごとの架橋パラメーター再、超極細の管腔形成を達成するために最適化する必要がありますが予想されます。
Bioprinted 血管床に二次電池種類をシードするには、疎水性表面の部分に足場を置き、ほとんど標準的な足場の間質性スペースが削除されていることを確認する必要が。これは、マイクロファイバーの表面に細胞数を最大化する液滴の自立とシードの中に足場をカプセル化を用いた構造に細胞懸濁液の直接浸潤をできるようになります。5 × 106セル/mL で心筋細胞の比較的高密度は現在のプロトコルで心筋組織を構築するために使用されたが、このような密度は特定組織の種類に合わせて任意調整できます。また無菌水を充填では実現することができます加湿環境を維持するために重要です播種用培地量が少ないが種まきの期間にわたって蒸発しない (すなわち、周囲の井戸や PDMS スラブの周囲の空間に)、足場付近の PBS を確保したり。
要約すると、血管組織の便利な作製のマイクロ バイオプリンティングの詳しいプロトコルを実施しています。この戦略は、芯鞘コーアクシャル印字ヘッドを使用して、鞘からコアと架橋結合のエージェントからハイブリッド bioink の同時押出を有効に。共押出、bioink すぐに受ける、bioprinter の動きのプログラム層を用いた足場を形成、アルギン酸コンポーネントの物理的な架橋結合、全体の構造は間を化学的にさらに長期的な安定性を許可するゲルマ コンポーネントの photocrosslinked。バイオプリンティング プロセス中に、超極細でカプセル化された内皮細胞は増殖し、血管床に足場を回すルーメンのような構造を仮定して周囲に移行できます。二次電池の種類を播くことによって血管柄付きの組織構造はその後に生成されます。このマイクロ バイオプリンティング戦略はユニークで、な肝臓、骨格筋などの組織型に便利に拡張することができ、心筋のほか癌目的のセル型の合理的な組み合わせによって、現在のプロトコルに示す特別設計されていた bioprinted を用いた足場のパターン。生体内組織再生の in vitro組織モデル化、このような方法で生成される血管柄付きの組織構造を使用できます。
このプロトコルで記述されているマイクロ バイオプリンティング戦略に関連付けられているいくつかの制限があります。まず、bioprinted 超極細径は架橋アルギン酸コンポーネントをコアで効率的に CaCl2ソリューション ハイドロゲル行列の拡散障壁による数百マイクロメートルに制限されます。過度に低い物理架橋密度は多層構造を不安定にさせるでしょう。第二に、CaCl2ソリューションの物理的な架橋剤は血管内皮前駆細胞などの比較よりも壊れやすい血管内皮細胞種に悪影響を及ぼす場合あります。幅広い種類の血管内皮細胞のようなバイオプリンティング法を使用しての可能性には、付加的な調査を必要があります。第三に、血管内皮細胞は、超極細のルーメンのような構造を形作ることができる、これらのマイクロファイバーのコアは灌流を有効にする中空ありません。したがって、栄養素および酸素まだ bioprinted 足場で間質性スペースを中心に提供します。Bioink64の光架橋性コンポーネントとしていけにえの材料の適応は、技術の将来のバージョンでこの問題を解決できます。また、bioprinted 中空を用いた構造42,43,65,66,,6768は、血管組織の直接の血流を確保するため血管床として使用する場合がありますを作成します。最後に、臨床規模組織のバイオプリンティング可能性があります挑戦を高スループットで拡大スケール バイオプリンティングを達成するために配列したマイクロ ヘッド69のデザインを取り入れたによって対処できる可能性が高い。

組織エンジニア リング目標生成機能組織代用置換、復元、またはそれらの怪我や病気、人体1,2,3,4、生体材料7,8,9,10生理活性分子5,6、目的のセルの種類の組み合わせを頻繁に拡張するために使用できます。最近では、モデルを生成する体外組織と器官用医薬品の開発、従来の単純化しすぎられる平面内細胞文化11,12,13,14,15,16,17,18,19の交換など、生体内で同等の重要な機能を模倣した組織工学技術がますます採用されても。両方の状況で複雑なマイクロアーキテクチャーと人間の組織の階層構造を要約する能力が重要なエンジニア リング組織10の機能を有効にして特に、エンジニア リング組織に血管のネットワークを統合する方法は、需要が血管新生でフィールド20,21,22,23の最大の課題の 1 つは、ため。
日には、様々 なアプローチはさまざまな程度の成功8のエンジニア リングの組織構造に血管の構造を構築する試みにこの点で開発しました。たとえば、自己血管内皮細胞のことができます血管ネットワーク24; の世代のため血管増殖因子の配信2625、持続的な血管新生を誘導します。血管系前駆細胞を使用し、ペリサイト容易に血管内皮細胞の増殖およびアセンブリ24,27;足場・ プロパティの設計により、新生28,29; の正確な変調また、細胞シート テクノロジーにより、血管層30の便利な操作のため。それにもかかわらず、これらの戦略は、設計された組織構造およびこうして限られた再現性内で血管がランダムに分布につながる血管の空間パターン形成を制御する能力を授けるないです。過去数年間バイオプリンティングは、自動または半自動の方法31,32,33高再現性と再現性で複雑な組織パターンの彼らの比類のない汎用性のため、このような課題の解決に向けた技術を有効にするクラスとして浮上しています。いけにえバイオプリンティング34,35,36,37,38、埋め込みバイオプリンティング39,40,41, と中空構造バイオプリンティング/立体組織自動製造42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53が血管や血管柄付き組織を生成する可能性が説明されています。
またを用いた足場を作製するマイクロ流体バイオプリンティング戦略が最近開発されている、ハイブリッド bioink から成るアルギン酸、ゼラチン メタクリロイル基 (ゲルマ) 同心印字ヘッドと塩化カルシウム (CaCl2) ソリューションのコアを介して配信されたプリント ヘッド54,55の外側シースの流れを行った。後続の光架橋多層膜を用いた足場の永続的な安定を確保しながらマイクロファイバー形成を有効にするアルギン酸コンポーネントの即時の物理的な架橋の許可 2 つのフローの共押出。注記のうち、bioprinted 超極細内にカプセル化血管内皮細胞が増殖し、血管床54,55を真似たルーメンのような構造を仮定してマイクロファイバーの方に移住する見つかりました。これらの bioprinted endothelialized 血管ベッドその後を表示でしたさらに55血管柄付き組織を構築する二次電池タイプを希望します。このプロトコルは、したがって組織エンジニア リングと organoid モデリングへの応用可能性の血管組織の便利な加工を保証する同心円状ノズルの設計で有効にするようなマイクロ流体バイオプリンティングの戦略の詳細な手順を提供します。

<table><tbody><tr><td>Alginic acid sodium salt from brown algae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0682</td><td>BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder</td></tr><tr><td>Gelatin type A from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>Gel strength 300</td></tr><tr><td>Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4&#039;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896</td><td>98%</td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td>Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>BioXtra, &amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001</td><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)</td></tr><tr><td>GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td>GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)</td></tr><tr><td>Endothelial cell growth medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12430054</td><td>High glucose, HEPES</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Clear 0.5 kg Kit</td></tr><tr><td>UV curing lamp system</td><td>Excelitas Technologies</td><td>OmniCure S2000</td><td>Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor</td></tr></tbody></table>

microfluidic bioprinting for engineering vascularized tissues and organoids

血管の組織工学を構築し、organoids は歴史的に挑戦されています。ここで多層ヒドロゲル超極細をインター レースで足場を生成するマイクロ流体バイオプリンティングに基づく手法について述べる.滑らかな達成するためにバイオプリンティング、コアの流れとシース流によって運ばれる架橋ソリューションから押出複合 bioink 製剤を含む芯鞘マイクロ プリント ヘッドはように設計され、bioprinter の上に装着。アルギン酸ゼラチン メタクリロイル (ゲルマ) をブレンドすることにより多糖の存在下で瞬時のイオン架橋を受ける選択恒久的な安定化を達成するためにゲルマ成分の二次光架橋続いて二価のイオン、このバイオプリンティング方式を用いた足場を得ることができた。重要なは、血管内皮細胞の bioprinted 超極細内部にカプセルは 16 日文化にわたって血管系に似たルーメンのような構造を形成できます。Endothelialized を用いた足場はさらに、超極細の間質性スペースに二次電池型の後播種によって血管柄付き組織を構築する血管床として使用することがあります。マイクロ流体バイオプリンティング高忠実度で血管組織の便利な工学の一般的な戦略を提供します。

マイクロ流体バイオプリンティング戦略を用いた足場低粘度 bioinks54,55を使用しての直接押出バイオプリンティングことができます。6 × 6 × 6 mm のサイズを図 2A足場に示すように3を含む &#62; 超極細 30 層が 10 分以内の bioprinted をあることができます。CaCl2アルギン酸コンポーネントの即時イオン架橋は上から見ると図 2 b および 2 Cの図に示すように bioprinted を用いた足場の長期安定性を確保するゲルマ コンポーネントのそれ以降の物理光架橋中バイオプリンティング プロセス中に優秀な構造完全性の許可。この場合、プロトコルでは、指定されたバイオプリンティング条件下で達成超極細だっただろうと若干増加超過腫れの直径の約 100-150 μ m です。
バイオプリンティング プロセス、bioink、イオン架橋と、光架橋のマイクロ押出しを含むカプセル化された比較の生存率が大幅に影響しませんでした。セルの比較的高い生存率を維持できる &#62; これらのすべての手順 (図 2D) 竣工後 80%。報告以前54,55, として、比較可能性が徐々 に増殖し、文化 (図 2F) で 16 日投稿-バイオプリンティング ルーメンのような構造を仮定する超極細の周辺に 0 (図 2E) の日に最初のランダム分布からマイクロファイバーに移行します。観察、比較のような行動は栄養素や酸素、インテリア55,59より超極細を周囲の高い可用性と同様、血管内皮細胞の組み込みインターフェイス ドリブン傾向による可能性が高かった。
用いた足場は、組織工学用のスタンドアロンのプラットフォームとしても機能できます。心筋組織を例として使用して、ラット新生児心筋細胞は 5 × 106セル/ml の密度で bioprinted の足場の間質性スペースにシードし、培養でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10 vol.% FBS とされました。媒体はその後媒体だけです 1/2 交換ごとの 2-3 日の55,の60,61,の62心筋細胞を破って、開始するまで最初の 2 〜 3 日で毎日変更されました。セルには、彼らの自発と同期細胞ソースと足場55の構成に応じて最大 9 28 日間暴行を維持できます。足場に成熟心筋細胞はまた、図 3に、サルコメア α-アクチニン (図 3B) とコネキシン 43 (図 3C) を含む共焦点蛍光画像のように心疾患バイオ マーカー機能の強い表現を示した。
血管内皮細胞と二次電池の種類を組み合わせて、血管柄付き組織をさらに組み立てることができます。もう一度、例として使用する心筋と文化の約 16 日後 bioprinted を用いた足場の血管床が形成された後、ラット新生児心筋細胞その後に播種した足場の間質性スペース。養殖と一般的なメディアの成熟は、EGM:DMDM の 1:1 の容積比で構成され後、出展と同期の自発的な鼓動55endothelialized 心筋組織を作成でした。さらに図 4に 1 面共焦点蛍光画像では、携帯型は、超極細 (図 4B) の境界に主に存在の比較と超極細 (図 4C) 外装を取り巻く心筋細胞の共存を明らかにしました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig1.jpg"> 
図 1: 血管柄付き組織を生成するためのマイクロ流体バイオプリンティング戦略を構築します。 
(A)芯鞘複合 bioink と CaCl2の共押出同軸プリント ヘッドの設計。(B E)血管柄付き組織の作製手順を示す図を作成します。この図は、Ref.55からの許可と変更されています。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig2.jpg"> 
図 2: バイオプリンティングを用いた血管床。 
(A)図 bioprinted 30 層を用いた足場。(B, C)Bioprinted 足場を示す顕微鏡写真の平面図と側面図。(D)の生存率の比較 bioprinted を用いた足場に荷を積んだ。緑と赤は、ライブと死んだ細胞をそれぞれ示します。(E, F)緑 fuorescent タンパク質 (GFP) の組織を示す蛍光顕微鏡写真-0 日 bioprinted 超極細の比較と 16 日投稿バイオプリンティング、それぞれ。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig3.jpg"> 
図 3: Bioprinted を用いた足場上における心筋細胞のそれに続く成長します。 蛍光顕微鏡の核(A) 、 (B)サルコメア α-アクチニン、 (C)コネキシン 43、および(D)重ね合わせを示します。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig4.jpg"> 
図 4: Endothelialized の心筋組織の構築です。 蛍光顕微鏡写真(A)核、 (B) GFP Huvec、両方の比較および心筋細胞、および(D)重ね合わせの(C) f-アクチンを示します。ニ インセット endothelialized 心筋組織の低倍率の画像を示しています。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足のデータセット。 G コードのサンプル ファイル バイオプリンティング 6 × 6 mm2正方格子隣接する超極細の 220 μ m 間隔で。

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Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

我々 は、二次電池の種類がさらに血管柄付き組織とオルガノイドを生成するには、このを用いた構造の間質性スペースに播種できるを用いた血管床をエンジニア リングのためのマイクロ流体バイオプリンティング戦略に基づく一般化されたプロトコルを提供します。

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K ビュー.  Harvard Medical School. 我々 は、二次電池の種類がさらに血管柄付き組織とオルガノイドを生成するには、このを用いた構造の間質性スペースに播種できるを用いた血管床をエンジニア リングのためのマイクロ流体バイオプリンティング戦略に基づく一般化されたプロトコルを提供します。

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Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

生物工学

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

κ-Carrageenan Sub-Microgel Mediumによる3Dバイオプリンティングの進歩

Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Medium

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic scaffolds. However, engineering a suitable gel suspension medium that balances precise bioink deposition with cell viability and function presents multiple challenges, particularly in achieving the desired viscoelastic properties. Here, a novel &#954;-carrageenan gel supporting bath is fabricated through an easy-to-operate mechanical grinding process, producing homogeneous sub-microscale particles. These sub-microgels exhibit typical Bingham flow behavior with small yield stress and rapid shear-thinning properties, which facilitate the smooth deposition of bioinks. Moreover, the reversible gel-sol transition and self-healing capabilities of the &#954;-carrageenan microgel network ensure the structural integrity of printed constructs, enabling the creation of complex, multi-layered tissue structures with defined architectural features. Post-printing, the &#954;-carrageenan sub-microgels can be easily removed by a simple phosphate-buffered saline wash. Further bioprinting with cell-laden bioinks demonstrates that cells within the biomimetic constructs have a high viability of 92% and quickly extend pseudopodia, as well as maintain robust proliferation, indicating the potential of this bioprinting strategy for tissue and organ fabrication. In summary, this novel &#954;-carrageenan sub-microgel medium emerges as a promising avenue for embedded bioprinting of exceptional quality, bearing profound implications for the in vitro development of engineered tissues and organs.

著者スポットライト:高解像度3Dバイオプリンティングのための均質な κ-カラギーナンサブマイクロゲルバスの開発

This study introduces a novel &#954;-carrageenan sub-microgel suspension bath, displaying remarkable reversible jamming-unjamming transition properties. These attributes contribute to the construction of biomimetic tissues and organs in embedded 3D bioprinting. The successful printing of heart/esophageal-like tissues with high resolution and cell growth demonstrates high-quality bioprinting and tissue engineering applications.

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic ...

工学

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

管状構造の組織工学のためのコア/シェル印刷足場

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

要約

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三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

微細と3D微小血管の組立

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

軟骨と皮膚組織類縁ミキシングユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブバイオプリンティング

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

管状構造の組織工学のためのコア/シェル印刷足場

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

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三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

微細と3D微小血管の組立

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

管状構造の組織工学のためのコア/シェル印刷足場

軟骨と皮膚組織類縁ミキシングユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブバイオプリンティング