The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).

<ol>
	<li>Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+rules+for+diffusive+drug+delivery+in+tumor+and+normal+tissues.">Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery.">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).</li><li>Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tissues+on+a+chip+for+drug+discovery.">Biomimetic tissues on a chip for drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).</li><li>Jeon, J. S., Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).</li><li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion.">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2016).</li><li>Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Self-Assembled+Microvascular+Networks+with+Microfabricated+PEG-Based+Hydrogels.">Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Biomimetic+Patterning+in+Hydrogels+to+Guide+Cellular+Organization.">Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization.</a> Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).</li><li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Hydrogels+with+Immobilized+EphrinA1+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li><li>Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-demanded+release+of+VEGF+from+synthetic,+biointeractive+cell-ingrowth+matrices+for+vascularized+tissue+growth.">Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth.</a> FASEB J. , (2003).</li><li>He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+assembly+of+3D+perfusable+microfluidic+hydrogels.">Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).</li><li>Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+mixing+in+three-dimensional+microvascular+networks+fabricated+by+direct-write+assembly.">Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly.</a> Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).</li><li>Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omnidirectional+Printing+of+3D+Microvascular+Networks.">Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks.</a> Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).</li><li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+of+Vascularized,+Heterogeneous+Cell-Laden+Tissue+Constructs.">3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs.</a> Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).</li><li>Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function.">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li><li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems.">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).</li><li>Dawson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+laws+for+capillary+vessels+of+mammals+at+rest+and+in+exercise.">Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise.</a> Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Photoablation+of+Guidance+Microchannels+into+Hydrogels+Directs+Cell+Growth+in+Three+Dimensions.">Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions.</a> Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).</li><li>Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+guidance+of+DRG+neurite+outgrowth+using+multi-photon+photo-ablation.">Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation.</a> , 116-119 (2009).</li><li>Applegate, M. B., Coburn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-based+three-dimensional+multiscale+micropatterning+of+biocompatible+hydrogels+for+customized+tissue+engineering+scaffolds.">Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).</li><li>Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-generated+microtracks+in+3D+collagen+lattices:+principles+of+MMP-dependent+and+-independent+collective+cancer+cell+invasion.">Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion.</a> PB. 8 (2), (2011).</li><li>Naik, P., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Blood-Brain+Barrier+Models:+Current+and+Perspective+Technologies.">In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies.</a> J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).</li><li>Choe, Y., Mayerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+Preparation,+Imaging,+and+Analysis+Protocols+for+Knife-edge+Scanning+Microscopy.">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy.</a> JoVE. (58), (2011).</li><li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+macro-scale+transmission+imaging+of+microvascular+networks+using+KESM.">Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM.</a> Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).</li><li>Chung, J. R., Sung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Exploration+of+Mouse+Brain+Microstructures+Using+the+Knife-Edge+Scanning+Microscope+Brain+Atlas.">Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas.</a> Front. Neuroinform. 5, (2011).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).</li><li>Slater, J. H., Culver, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Slater, J. H., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted,+Micropatterned+Surfaces+and+Image-Guided+Patterning+Using+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography.</a> Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).</li><li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration.">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).</li><li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically-tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions.">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+Hydrogels+for+Dynamic+Tuning+of+Physical+and+Chemical+Properties.">Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+two-photon+photodegradation+of+PEG+hydrogels+to+study+and+manipulate+subcellular+interactions+on+soft+materials.">Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials.</a> Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

画像誘導、レーザーベースの分解のための仮想マスクの使用を可能にするために、顕微鏡ソフトウェアの標準機能をオーバーライドする上で重要な、顕微鏡マクロが設定し、慎重に操作しなければなりません。どのように顕微鏡マクロで顕微鏡のソフトウェアインタフェースは時々直感に反することができ、多くの努力が、この方法を開発するために、両方のプログラムで最適な設定を決定する際に投資されました。基本的なレーザー走査型共焦点顕微鏡の使用の一般的な理解は、特に「ステージ」と発見し、正しくレーザーベースの分解を試みる前に、x、y、zの次元でヒドロゲルを位置決めするための「フォーカス」ウィンドウで、お勧めします。また、入口流路の作製は、プロトコルに重要です。中断蛍光種は、成功したイメージングおよびネットワークの特性評価のためのマイクロ流体システムを入力することができなければなりません。このプロトコルは、特定のに適用されることに留意することが重要であり、レーザー -顕微鏡ソフトウェアおよび顕微鏡マクロの特定のバージョンを実行している特定のフェムト秒パルスレーザーを用いて構成された走査型共焦点顕微鏡、（特定の材料/機器のリストの詳細を参照してください）。私たちは顕微鏡マクロの新しいバージョンは、画像誘導レーザ制御のために必要な必要な制御と機能性を欠いていることを発見しました。他の顕微鏡プラットフォームとパルスレーザ光源を用いることができるが、このプロトコルは、このシステムに特に適用され、プラットフォーム、レーザ源、およびソフトウェア実装に応じて変更が必要となります。このプロトコルを通して、基本的な原理はまだただし、適用されます。 このプロトコルへの潜在的な変更は、ハイドロゲル組成物を変化させることを含みます。ここで、我々は（脇マイクロ流体ネットワークの世代からの目的のために）5重量％、3.4 kDaのPEGDAヒドロゲルが、レーザーベースの分解を利用すると、PEG化フィブリンを含む合成および天然ヒドロゲル、両方を分解するために実装されました21,22フィブリノゲン、絹タンパク質ヒドロゲル23、及びコラーゲン24。レーザーパワー、走査速度、Zスライス間の間隔、及び繰り返し回数の調整は、他のヒドロゲル製剤に微小流体ネットワークを製造するために最適なパラメータを決定するのに役立つであろう。 技術の一つ電流制限は、時間の実現可能な量に分解することができるヒドロゲルの全体のボリュームです。 37.7 NJ /μm2でのレーザフルエンスを使用した場合、ヒドロゲル内にオープンボイドやマイクロ流体の特徴を作成するには、レーザー滞留時間は8.96マイクロ秒/ピクセル（または0.021ミクロン/μsでのレーザスキャン速度）で、またはより上でなければなりません。 （ 図1に見られるように）これらの設定では、0.014 mm 3でボリューム内の血管を分解するために1.4時間がかかります。下記の4.48マイクロ秒/ピクセルまたはのレーザー滞留時間を用いて、供給されるエネルギーは、ここで使用されるヒドロゲル製剤の完全分解に十分ではありません。異なるヒドロゲルの実装組成物は、この制限を克服することができます。光に敏感なコンポーネント34-36または大規模な多断面21-24を持つハイドロゲルが含まれている光不安定性ゲルの使用は、より少ないエネルギーの利用を可能にし、より高速な劣化につながる良いオプションです。次元の制限に関しては、特徴は、ヒドロゲル7の深い1.5ミリメートルまでに製造されています。深度達成は、対物レンズの作動距離の関数であり、in vivoイメージングのための最適化された超長作動距離対物レンズを使用して増大させることができます。最小の測定チャンネル7は、20X（NA1.0）水浸対物レンズは、 図1に発生した最小のチャンネルのサイズと同等の8.9ミクロンの3.3ミクロンの幅と深さを持っていた使用して作成しました。他のラボが低いNA対物レンズ21,23,24を使用しているが、我々はより小さな機能を備えたマイクロ流体ネットワークが高く使用して作製することができることを期待します縮小作動距離を犠牲にしてER NA対物レンズ。最終的に、しかし、技術の分解能は、集束レーザービーム、レーザ走査特性、レーザによって供給されるエネルギーの量の点広がり関数の関数であり、材料のレーザ吸収特性が劣化します。 また、レーザ特性が（速度、フルエンス、仮想のマスクとの間の間隔、及び繰り返し数）は、ヒドロゲル特性（架橋密度、マクロマー/モノマーの分子量、重量パーセント、及びヒドロゲルの種類に基づいて最適化されなければならない：合成対タンパク質ベース）、これらのように本質的にレーザー、したがって、プロセスの最終的な解決との相互作用が変更されます。供給されるエネルギーも使用目的によって影響されるように目標を切り替えたとき、追加の最適化が必要です。関連する費用に対して、パルスレーザと顕微鏡へのアクセスが要求され、多くの異なるOBJEC一方ティブは、高いNAおよび（in vivoイメージングのための）長い作動距離を有するものは高価であり、使用することができます。 上記およびここに詳述したプロトコルを越えて、この技術を用いて生成されたマイクロ流体ネットワークはまた、内皮細胞の接着および管腔形成7を誘導するために細胞接着性ペプチドポストチャネル加工で官能化することができます。また、劣化したチャネルに先立ってバルク材料9のセル分解性ペプチド配列の組み込みは、ヒドロゲルへと貫通細胞遊走の研究のために可能性があります。 図2及び図 3~7に示されているように、ヒドロゲル内の微小流体ネットワークの連続的な流動化のために、ヒドロゲルは、より大きな流体装置又はハウジング内に光重合することができます。 血管性または血管新生自己集合8-12を介した血管網の発生がVAを誘導するために直接的なアプローチを提供します比較的大きなヒドロゲルボリューム全体にscularization。このアプローチは、灌流流体ネットワークをもたらすが、直接サイズ、ねじれ、密度、および全体的なネットワークアーキテクチャを制御することは困難です。この制限により、血管系における流れプロファイルとせん断速度は、実験間で異なる場合があります。また、微細加工技術13-16は、ネットワーク・アーキテクチャを直接制御を可能にするが、多くの場合、小さな、キャピラリーサイズのチャネルまたはin vivoでの血管のアーキテクチャで模倣密なネットワークの製造を生成することができないことによって制限されています。ここで説明レーザーベースのヒドロゲルの分解技術は、新たにマイクロ流体生成のために再利用されてきたが、それは同時に、密度、ねじれを再現3次元生体模倣マイクロ流体ネットワークの作成を可能にすることによって建築制御、既存の微細加工法の大きさに基づく制限の両方を克服しますサイズ範囲、および全体的なarchitecturin vivoでの血管系の電子。さらに、複数の流体ネットワークは、ネットワーク間のトランスポート7の研究を可能にする、単一のヒドロゲルで生成することができます。より密接にin vitroでの 生体内輸送過程の中で複製するように努めています組織工学アプリケーションでは、ここで概説高分解能ハイドロゲル包埋マイクロ流体ネットワークは非常に適しています。我々は、このプロトコルは、薬物スクリーニング装置として使用するためおよびインビトロ疾患モデルにおいて、より正確に模倣する組織構築物のインビボ輸送の開発に有用であろうことを予想しています。

リンパ管および心臓血管の両方からなる血管系、フォーム栄養と酸素の輸送および代謝老廃物の除去のために不可欠である高密度のネットワークを。したがって、血管新生した組織に存在する細胞は、以上の50から100ミクロン離れて容器1からなることはありません。 in vitroで の生体内の血管構造を再現する能力は、正確に操作された構築物を用いてin vivoでの輸送過程をモデル化することが重要です。 3,4および疾患モデル5,6をハイスループットスクリーニングの薬剤のための臓器・オン・チップデバイス2を開発するための最近のドライブでは、この方法は、描画された合成または天然ヒドロゲルにおけるin vivo様の輸送を再現マイクロ流体ネットワークを作成します大きな関心。これらのデバイスで使用される微細組織のバイオミミクリーを強化するために、我々は、三dimensionaを用いる画像誘導レーザベースのヒドロゲルの分解法を開発しましたL（3D）天然の血管系の画像スタックをテンプレートはPEGDAヒドロゲル7に埋め込まれた血管由来微小流体ネットワークを生成します。このプロトコルは、画像誘導、レーザーベースの劣化を経てPEGDAヒドロゲルにおける血管由来、生体模倣マイクロ流体ネットワークを製造するフェムト秒パルスレーザーを搭載した市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡の使用を概説します。 ヒドロゲルを流動化するための現在のアプローチは、内皮13-16用の事前定義されたチャネルを作成するには8-10脈管や血管新生10-12内皮細胞の自己組織化と微細加工技術の誘導が含まれます。自己組織化ネットワークは、微小血管の密度と複雑なアーキテクチャを再現しながら、彼らはしばしば、薬剤スクリーニングアプリケーションのためのモデリング輸送に問題となる可能性がin vivoでのネットワーク11,17,18、より透過性です。自己組織化ネットワークはphysiologから成り的には、関連する毛細血管サイズの船が、それらは、より大きな細動脈サイズの血管を生成する際の制限のために、バルク流体の流れとの統合が困難な場合があります。これらのネットワークの集合体の上に直接制御がないため、最終的なアーキテクチャは、繰り返し同じ流体の流れおよび輸送特性とのネットワークを生成することが困難になる、サンプル間で変化し得ます。 3D、反復ジオメトリと明確に定義されたアーキテクチャを有するヒドロゲル埋め込み微小流体ネットワークを生成するために、微細加工技術の数は、モジュールアセンブリ13、犠牲材料16、ダイレクトライトアセンブリ14と、全方位印刷15の3Dプリントなど、開発されてきました。これらの方法は、微小流体アーキテクチャ、したがって流体の流れと輸送特性を適用し、繰り返し多くの構築物を横切って製造することができます。これらのアプローチの主要な制限は、しかしながら、作成することができないことであるmicrof毛管サイズの特徴、4〜10μmの19とluidicネットワーク。ほとんどの微細加工技術は、多くの場合、直径13,16に150から650ミクロンまでの範囲の特徴に限定されています。いくつかの既存の技術には、直接書き込みアセンブリ14のために10〜300μmで、広い直径範囲にわたってチャンネルを階層的ネットワークを生成することが可能であり、かつ全方位印刷15 18へ600μmのは、それらは、密なネットワークまたはを生成する能力が制限されています単一の構築物7内に近接した複数のマイクロ流体ネットワークを生成します。 これらの制限のいくつかを克服するために、我々は、生体模倣の反復可能な製造を可能にする画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解技術、in vivoでの微小血管系のアーキテクチャを再現階層型マイクロ流体ネットワークを開発しました。これを行うには、80 MHzで動作する790 nmで、140フェムト秒（fs）は、パルスレーザは、ラスタスキャンiはin vivoでの血管系の画像で定義されたように、n、ヒドロゲル内の3D位置を希望します。私たちは、水が20を拡張したように、分解プロセスは、水のレーザ誘起光学破壊、結果として得られるプラズマ形成、水のその後の急速な熱弾性膨張、およびヒドロゲルの局所的劣化を介して動作することを推測しています。この機構は、タンパク質ベースのヒドロゲル21-24のレーザーベースの分解から若干異なります。低多断面を有するPEGDAとは異なり、タンパク質は、しばしば大規模な多断面を有し、したがって、多光子吸収によって誘起される化学破断23を介して分解されます。画像誘導微小流体ネットワークを生成するために、レーザシャッタは、微小流体アーキテクチャを定義する関心9の領域のモザイクから成り画像誘導仮想マスクによって制御されます。このアプローチを用いて、3D血管由来のバイオミメティックマイクロ流体を製造する能力が実証されています局所的に分解中に送達されるエネルギーの量を変化させることによりヒドロゲルの多孔性を制御するために、 インビボでの脈管構造の緻密で蛇行アーキテクチャを再現ICネットワーク。また、近接（15ミクロン）に絡み合う二つの独立したマイクロ流体ネットワークを生成することができたが、直接7を接続したことがありません。我々はまた、内皮細胞の接着および管腔形成7を促進するために、インテグリン連結ペプチド配列、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン（RGDS）でポスト分解官能を通じてレーザー分解マイクロチャンネルを内皮化する能力を実証しました。 このプロトコルでは、PEGDAヒドロゲルにおける複雑なマイクロ流体ネットワークの世代は、多くの大学のキャンパスでアクセス可能な市販の顕微鏡を用いて画像誘導、レーザーベースの分解を経由して可能となります。分解プロセスは、デジタル、仮想マスクによって案内されるように、このファブリカション技術は、多種多様な用途での使用を可能にする、マイクロ流体ネットワークの創造的なデザインのために適しています。私たちは、ここで説明する方法は、バイオミメティック器官とモデリングの薬物輸送2における重要な生物学的輸送プロセスを複製することができる人間のオンチップデバイスを設計する際に最も有利になることを期待しています。この製造技術はまた、癌転移5,6及び血液脳関門モデル25を含む、 インビトロでの疾患モデルの生成のために関心のものであってもよいです。レーザーベースのヒドロゲルの分解は、以前に神経突起伸長21-23の誘導のためのトラックを作成するために使用されているように、この技術の画像誘導延長は、ユーザー定義の3D空間配置内のセルを配置するために、高度な組織工学戦略において有用であることが証明できました。

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>named &quot;programming software&quot; in protocol; refer to source 9 for details on algorithm</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td><td>NIH</td><td>version 1.51a</td><td>named &quot;image processing software&quot; in protocol</td></tr><tr><td>LSM 780 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>named &quot;laser-scanning confocal microscope&quot; in protocol; for laser-based hydrogel degradation</td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>release version 6.0</td><td>named &quot;microscope software&quot; in protocol; for use on Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>named &quot;microscope macro&quot; in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen)</td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>for use on Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>named &quot;high-powered pulsed laser&quot; in protocol</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine (TEOA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 &amp;micro;m PES Membrane</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>synthesized in house</td><td></td><td>refer to source 33 for synthesis methods; store under argon</td></tr><tr><td>Eosin Y disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood</td></tr><tr><td>3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>backing for handling of double coated tape</td></tr><tr><td>Model SC Plotter (adhesive cutter)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes</td></tr><tr><td>60 mm Petri Dish with 20 mm Hole</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>High Intensity Illuminator (white light source)</td><td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>Power Meter</td><td>Newport</td><td>1916-R</td><td>detect power at 524 nm when using white light source</td></tr><tr><td>Slim Profile Wand Detector</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td><td>for use with power meter</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods</td></tr><tr><td>TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round</td><td>synthesized in house</td><td></td><td>refer to source 7 for methods</td></tr><tr><td>Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel</td></tr><tr><td>1 mL Syringe, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Syring Filter, 0.2 &amp;micro;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI&lt;sup&gt;0.4&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>microfluidic devices that can be used to house hydrogels</td></tr></tbody></table>

image-guided, laser-based fabrication of vascular-derived microfluidic networks

この詳細なプロトコールは、PEGDAヒドロゲルに埋め込まれた血管由来のマイクロ流体ネットワークの製造のための画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解の実装の概要を説明します。ここでは、画像誘導レーザ制御を可能にする仮想のマスクの作成について説明します。マイクロ流体ネットワークの製造及び圧力ヘッド駆動流に適したmicromolded PEGDAハイドロゲルの光重合;フェムト秒パルスのTiとペアになって、市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡のセットアップと使用：ヒドロゲルの分解を誘導するSレーザー;蛍光種および共焦点顕微鏡を使用して製造、マイクロ流体ネットワークのイメージング。これらは複雑な数が含まれているマイクロ流体製造目的のための市販の顕微鏡を使用する際の重要なステップであるなどのプロトコルの多くは、顕微鏡ソフトウェアおよび顕微鏡マクロの適切な設定方法や実装に焦点を当てています。このtechniquの画像誘導成分eは、それによって創造的なマイクロ流体設計のため、事実上任意の構成の複雑なマイクロ流体システムの製造を可能にする、3D画像スタックまたはユーザーが生成した3Dモデルの実装を可能にします。組織工学における予想される影響で、このプロトコルで概説された方法は、臓器と人間のオンチップデバイスのための高度なバイオミメティックmicrotissue構築物の製造に役立つ可能性があります。 in vivoでの血管系の複雑なアーキテクチャ、屈曲度、サイズ、および密度を模倣することにより、本質的な生物学的輸送プロセスは、薬物動態及び疾患のより正確なin vitroでのモデリングにつながる、これらの構築物に複製することができます。

3D、血管由来のマイクロ流体ネットワークを生成するために、画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解の実装を実証するために、我々は27、ナイフエッジの走査顕微鏡（KESM）26を介して取得されたマウスの脳血管系の3D画像スタックを利用しました。上記のように、より大きな微小血管データセットの選択された3次元領域が、画像誘導微小流体ネットワークを形成するための仮想のマスクのシリーズに変換しました。製造後、得られた微小流体ネットワークは、FITC標識、2000 kDaのデキストランの溶液で灌流し、共焦点顕微鏡を介して画像化しました。ネットワークアーキテクチャ（ 図1AおよびC）を定義して作製微小流体ネットワーク（ 図1BおよびD）は、Z-突起（ 図1AおよびB）と3Dレンダリングを生成するために使用されたインビボでの脈管構造（ 図1CのイメージスタックとD </strong&gt;）。画像の比較は、画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解はサイズ、蛇行、およびin vivoでの血管系の複雑な構造を再現3Dバイオミメティックマイクロ流体ネットワークの製造を可能に示しています。技術は、直径の広い範囲を含むネットワークの製造に適しています。 図1内に、直径が3.3から28.8ミクロンの範囲のチャネルが生成しました。 図1Bの左上にあると、図1Dの左の隅に、より大きな長方形の構造がネットワークに流れを導入するための入口チャネルであることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> 図1：マイクロ流体ネットワークを血管由来。マウス脳血管系（AとC）の画像スタックから派生した仮想一連のマスクは、ファブリカに使用されました画像誘導、レーザーベースの劣化を経てPEGDAハイドロゲル（BおよびD）に埋め込まれたテ3Dバイオミメティックマイクロ流体ネットワーク。マイクロ流体ネットワークは、2000 kDaのFITC標識デキストランで灌流し、共焦点顕微鏡を経由して画像化しました。 Z-突起（A及びB）及び2つのネットワークの3Dレンダリング（C及びD）は密度、組織、およびインビボで脈管構造の全体的なアーキテクチャを再現微小流体ネットワークを生成する能力を示します。矢印（D）は 、デキストランを紹介するために作成した長方形の入口をマーク。スケールバーは50μmで表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 我々は、流体Fを開始するために、二つの方法、圧力ヘッド、シリンジポンプを実装していますこれらの埋め込まれたマイクロ流体ネットワークにおける低いです。例えば、30〜30μmとすることにより、矩形チャンネルは圧力ヘッド7を介して駆動流体の流れで、micromolded PEGDAハイドロゲル（ 図2A）に2つの井戸を接続するために作製しました。マイクロチャネルを通って、右のウェルに流れを誘導された圧力水頭、よく左に生成されます。 図2A、テトラメチルローダミン（TRITC）の初期のフロントは標識では、70 kDaのデキストランは、タイムラプス顕微鏡を使用して、チャネルを通って移動が観察されました。その後、 図2（b）に、10μmの直径蛍光ポリスチレン球は、右のウェルに、チャネルを介して、よく左から流れました。入口でよくmicromolded内に存在する流体の体積によって制御された流れの持続時間、および入口との間に発生する静水圧勾配によって制御される流量ととよく出口、micromoldedヒドロゲル内の圧力ヘッド駆動流は、簡単な方法を提供し、流れのためにありますduction、外部ハウジングまたはシリンジポンプを必要としません。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> 図2：Micromolded PEGDAヒドロゲル中の圧力ヘッド駆動流。 PEGDAは、埋め込まれたマイクロチャネルによって接続された2つのウェルを含有するヒドロゲルを形成するmicromoldedました。圧力ヘッドは、1つのウェルから30μmで30による長方形のチャネルを介してTRITC標識、70 kDaのデキストラン（A1-A3）の流れと10μmのポリスチレン球（B1〜B3）を開始するためにも左で生成されましたその他。スケールバーは50μmで表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 代替的に、マイクロ流体ネットワーク内で一定の流体の流れを生成するために、シリンジポンプ駆動F低は、シリンジポンプとのインタフェースのための入口および出口ポートと二マイクロ流体デバイスの内部にヒドロゲルを光重合することによって開始することができます。 図3Aに、市販の、予め製作マイクロ流体デバイスは、デバイス7の幅を横切って光重合ヒドロゲルの1 mmのバンドで示されています。レーザーベースの分解は、ヒドロゲル自立のために、ここで説明したのと同じプロトコルを使用して、収容されたヒドロゲル中のマイクロ流体チャネルとのネットワークを作製するために実装されました。シリンジポンプで生成流は、20ミクロンの直径の円筒形チャネルは、マイクロ流体デバイス内に収容されたヒドロゲルで作製された、図3Bに見ることができます。 5μL/ sの流量が印加されると、球は視野を移動に対しストリーキングによって証明されるように、この20ミクロンの直径のチャネルでは、個々の2ミクロン蛍光ポリスチレン球を容易に、流体流なし（ 図3B1）が解決されます（ 図3B2 &lt;/強いです&gt;）。この同じアプローチは、周囲のヒドロゲル（ 図3C）にネットワークおよび拡散を介しTRITC標識した、65kDaのデキストランの流れを監視するために、2D、血管由来のネットワークを介して流れを誘導するために使用しました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> 図3：マイクロ流体ハウジング内PEGDAヒドロゲル重合中のシリンジポンプ駆動流。市販の、予め製作マイクロ流体装置（A）17×3.8のx 0.53ミリ（x、y、z）は、マイクロチャネルの家で示される光重合1×3.8のx 0.53ミリ（X、Y、Z）PEGDAヒドロゲルと黒い矢印。 20μmの直径の円筒形チャネルは、ヒドロゲルを介して分解された、および2ミクロンのポリスチレン球は、デバイス（B）を介してポンプ輸送しました。球は明らかに、流体の流れ（B1）せずに解決されていますが、5μL/ sの流量でスジとして表示されます（B2）。別の収容されたハイドロゲルでは、2Dの血管由来のネットワークを作製したとTRITC標識、65 kDaのデキストランは、ネットワーク（C）を介してポンピングしました。タイムラプス顕微鏡は、それがチャンネルを満たし、周囲のヒドロゲル中に拡散として蛍光デキストランをモニターするために使用しました。 （B）及び（C）の白矢印は流体の流れの方向を示しています。 （C）におけるキャリブレーションバーは、蛍光デキストランの強度を示します。スケールバーは、（B1）及び（B2）及び（C）が50μmで20ミクロンを表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

image-guided-laser-based-fabrication-vascular-derived-microfluidic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K ビュー.  University of Delaware. This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

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Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

生物工学

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

マイクロ流体工学に基づく血管新生ヒト微小腫瘍モデルの準備

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

著者スポットライト:トランスレーショナルがん研究のモデルとしてのヒト血管新生微小腫瘍の作成 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

がん研究

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, structures, phenotypes, and performance depending on each specific perfused tissue. The field of tissue engineering, which aims to repair or replace damaged or missing body tissues, relies on controlled angiogenesis to create a proper vascularization within the engineered tissues. Without a vascular system, thick engineered constructs cannot be sufficiently nourished, which may result in cell death, poor engraftment, and ultimately failure. Thus, understanding and controlling the behavior of engineered blood vessels is an outstanding challenge in the field. This work presents a high-throughput system that allows for the creation of organized and repeatable vessel networks for studying vessel behavior in a 3D scaffold environment. This two-step seeding protocol shows that vessels within the system react to the scaffold topography, presenting distinctive sprouting behaviors depending on the compartment geometry in which the vessels reside. The obtained results and understanding from this high throughput system can be applied in order to inform better 3D bioprinted scaffold construct designs, wherein fabrication of various 3D geometries cannot be rapidly assessed when using 3D printing as the basis for cellularized biological environments. Furthermore, the understanding from this high throughput system may be utilized for the improvement of rapid drug screening, the rapid development of co-cultures models, and the investigation of mechanical stimuli on blood vessel formation to deepen the knowledge of the vascular system.

Engineered tissues heavily rely on proper vascular networks to provide vital nutrients and gases and remove metabolic waste. In this work, a stepwise seeding protocol of endothelial cells and support cells creates highly organized vascular networks in a high-throughput platform for studying developing vessel behavior in a controlled 3D environment.

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

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マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術

微細と3D微小血管の組立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム