Name: rescue and characterization of recombinant virus from a new world zika virus infectious clone
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
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著者らは、クローン由来ウイルスの特徴づけを支援してくれたKristen Bullard-Feibelman、Milena Veselinovic、ClaudiaRückertに感謝したいと思います。この研究は、NIHのAI114675（BJG）およびAI067380（GDE）の下での国立アレルギーおよび感染症研究所の助成によって部分的に支持された。

感染性クローンプラスミドの形質転換および回収<ol><li> いくつかの改変を加えた市販の形質転換プロトコール（ 例えば 、NEB 5分形質転換プロトコル）を用いて両方のプラスミド（別々に）を形質転換する。どちらのプラスミドもアンピシリン耐性をコードする遺伝子を含んでいるため、選択のためにアンピシリンまたはカルベニシリンを使用する。より安定であるので、カルベニシリンが好ましい。 <ol><li> -80°Cの冷凍庫から細胞を取り出し（材料表を参照）、氷上で5〜10分間解凍する。 （LB-carb）と呼ばれるPrewarm lysogeny broth（LB）（10g / LのNaClおよび25μg/ mLのカルベニシリンを含む）プレートおよびカタボライト抑制を有するブロス（抗生物質を含まないSOC-細胞とともに）37℃。 </li><li> 1μLのプラスミドDNA中100μg〜10ngをコンピテント細胞50μLを含むチューブに加える;チューブを軽く叩いて軽く混ぜる。 </li><li>チューブを氷上で5分間インキュベートする。 </li><li> 42℃30秒間の熱ショックチューブ水浴中で。熱ショックの直後に2分間氷に戻す。 </li><li> 950μLの室温SOCを各チューブにピペットで分注し、ピペットで混合します。 100μLの細菌混合物をLB-炭プレート上に広げ、37℃で一晩インキュベートする（約12-14時間）。 </li></ol></li><li> 12〜14時間のインキュベーション後に37℃のインキュベーターからプレートを取り除きます。コロニーを（約8〜9時間）増殖させ続けることができるように、プレートを室温の暗い引き出しに置きます。 </li><li> 5 mLのTerrificブロス（TB、25μg/ mLのカルベニシリンを含む、TB-carbと呼ばれる）を使用して、細菌シェーカー（およそ14〜16時間）中30℃で一晩各プラスミドについて5〜10個の小さなコロニーを増殖させます。 注：小さなコロニーは、プラスミドが無傷であることを示す指標です。欠失、再編成または突然変異（本明細書では不安定性事象と呼ばれる）を含むプラスミドを有するコロニーは、より速く増殖し、したがってより大きくなる。したがって、プレート上で最小のコロニーを選択しようとする必要があります。存在する最大のコロニーを選択する。いくつかの中位のコロニーもまた完全性のために選択することができる。使用される温度が低いほど、細胞が繁殖する確率が低下する（OD 600が0.6-0.8を超える）。ほとんどの研究者が一晩成長するので、より多くの制御と過成長の可能性を減らすことができます。 </li><li>液体培養物の濁度（約OD 600が0.6〜0.8）をチェックする。 4℃で濁ったチューブを置き、他のチューブを長く濁らせる。 注：プラスミドの不安定性事象が発生する可能性があるため、バクテリアを推奨値を超えるOD 600値まで増殖させないでください。 </li><li>市販のプラスミドミニプレップキット（材料表を参照）を用いてバクテリアからプラスミドDNAを抽出する。予め加熱した（加熱ブロック中70℃まで）溶出緩衝液15μLで溶出する。溶出緩衝液をカラム上で5分間インキュベートしてから遠心分離にかける。 注：4℃でこのスターター培養物を少なくとも1mL保存してください。次のステップでさらに使用します。 </li><li>培養中にプラスミドの不安定性事象が発生したかどうかを評価するために、回収したプラスミド10μLを消化する。 注：pIをSalI / NheIで、p2をBamHI / HindIIIで37℃で1時間消化します。ゲル電気泳動による消化後の正しいバンドの存在を確認し（ 図2a ）、ステップ2に進みます。ローリングサークル増幅（RCA）によりプラスミドDNAを調製する場合、ミニプレップ溶出液の一部を鋳型として確保します。 </li></ol>ライゲーションのための十分なプラスミドDNAの調製注：ライゲーションおよびその後のエレクトロポレーションには、maxiprepまたはRCAのいずれかを介して生成されなければならない十分な量のプラスミドDNAが必要です。マキシプレップは伝統的に使用されているアプローチですが、RCAはバクテリアを必要としないという利点を提供し、不安定な事象を引き起こす可能性のある細菌中のプラスミド誘発毒性の可能性を排除します。 <ol><li><strong&gt;次のmaxiprep手順を実行します。 <ol><li>前のセクションで正しい制限酵素消化パターンを示した各プラスミドについて、1LのTB-Carb（25μg/ mLカルベニシリン）ブロスに500μLのスターター培養液を加え、30℃で一晩振とうする（約14-16時間、およそ0.6〜0.8のOD 600 ）。 注：このOD 600値以上で培養液を増殖させないでください。これにより、プラスミド内で不安定な事象が生じる可能性がある。 </li><li>バクテリアを採取し、製造業者のプロトコールに従ってマキシプレップを行う（材料表参照）。 </li></ol></li><li> 手順1.6で保存したミニプレップを使用して、RCA手順について以下を実行します。 <ol><li> 1μLのプラスミドDNAを50μLのサンプルバッファーを含むチューブに移す。 </li><li>試料を95℃で3分間熱変性させ、使用するまで4℃でインキュベートする。 </li><li>商業的増幅を準備するプレミックス（ 材料表を参照）。氷上にセットしたチューブに50μLの反応バッファーと2μLの酵素ミックスを混合する。 注意：増幅プレミックスは、使用準備が整うまで氷上に置かなければなりません。必要な数の増幅反応のための十分な試薬を組み合わせることにより、マスターミックスを調製することが便利である。未使用のプレミックスはすべて破棄する必要があります。 </li><li>調製した増幅プレミックス50μLを変性サンプルに移す。 </li><li>反応管を30℃で18時間インキュベートする。 </li><li>チューブを65℃で10分間インキュベートし、φ29DNAポリメラーゼを不活性化する。 </li><li>使用準備が整うまで反応チューブを4°Cまたは-20°Cで保存する。 注：この時点で、両方の方法で調製したプラスミドDNAを定量する必要があり（260 nmでの吸光度を使用）、ZIKVゲノムは完全にSangerで配列決定して、不安定な事象（欠失および再構成） </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>プライマー名</td><td>シーケンス（5 &#39;〜3&#39;） </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1。 </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 632For。 </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKVは692Revを保存しました。 </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV保存1313Rev。 </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV保存された1201For。 </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV保存された1663For。 </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKVは2008年に保存されました。 </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKVは2350Revを保存しました。 </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV保存された2605For。 </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKVは3499Revを保存しました。 </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV保存3961Rev。 </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV保存4132For。 </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKVは4561Revを保存しました。 </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV保存4665For。 </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV保存5189Rev。 </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV保存5219用。 </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV保存された6086Rev。 </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKVは6119のために保存されています。 </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV保存された6721Rev。 </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV保存6769For。 </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKVは7209Revを保存しました。 </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV節約7343For。 </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV 8243用に保存されています。 </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev。 </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKVは9133Forを保存しました。 </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev。 </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKVは9686用に保存されています。 </td><td> GATGATAGGTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKVは10321Revを保存しました。 </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV保存された10455For。 </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV保存された10621Rev。 </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> 表1：cDNAクローンを配列決定するためのプライマー。プラスミドは、記載されたプライマーを用いて完全に配列決定することができる。 「保存された」インディ（indi）としてマークされたプライマーそれらがZIKVのすべての遺伝子型を配列決定/増幅する可能性が高いことを示す。 「PRVABC59」と命名されたプライマーはこの株に特異的であるが、他のアジアの遺伝子型株および場合によっては他の遺伝子型についても機能し得る。 インビトロで転写されたRNAの調製<ol><li> マキシプレップまたはRCA調製DNAの消化反応を設定する。 <ol><li> p1消化のために、10x反応バッファー、3μLのApaLI、3μLのBamHI-HF、3μLのrSAPまたはCIP、および3.3μgのp1DNAを混合する。 100μLにddH 2 Oを加える。 </li><li> p2消化のために、10×反応バッファー、3μLのApaLI、3μLのEcoRI-HF、および13.3μgのp2 DNAを混合する。 100μLにddH 2 Oを加える。 </li><li> 37℃で1〜2時間インキュベートする。 </li><li>市販のゲルとPCRクリーンアップキット（材料表を参照）を使用して精製する。加熱ブロック中で70℃に予熱した30μLの溶出緩衝液で溶出する（カラムを回転させる前に5分間）。 注：後でゲルに1μLを流してください。 </li></ol></li><li> ライゲーション反応を準備する。 <ol><li> 10μLの10×T4 DNAライゲーション反応バッファー、3μLのT4 DNAリガーゼ（400U /μL）、29μLの精製したp1、および29μLの精製したp2を合わせる。 100μLにddH 2 Oを加える。 </li><li>室温で2時間又は16℃で一晩インキュベートする。 </li><li>市販のゲルとPCRクリーンアップキット（材料表を参照）を使用して精製する。加熱ブロック（スピンする前に5分間インキュベートカラム）中で70℃に予熱した溶出緩衝液10μLで溶出する。 注：後でゲルに1μLを流してください。 </li></ol></li><li>消化されていないプラスミド、消化されたプラスミド、およびアガロースゲル上のライゲーションを実行する。連結産物は消化されたプラスミド単独よりも高い分子量バンド（約11kb）を有するべきであり、連結が成功したことを示している（ 図2b ）。</li><li> T7 インビトロ転写反応をセットアップする。 <ol><li> 2μLの2倍ARCA / NTPミックス、2μLのT7 RNAポリメラーゼミックス、および8μLの精製ライゲーション反応液を最終容量20μLに合わせて組み合わせます。 注記：ミックスに含まれるARCAは、排他的に正しい方向に組み込まれたキャップアナログです。標準キャップ類縁体は、転写物の約50％のみが正しい向きでキャップを有することができる。 </li><li> 37℃で4時間インキュベートする。 </li><li> UV分光光度計でRNA濃度を測定する。必要に応じて、RNA転写物の長さを確認するために変性アガロースゲルを流す。 </li></ol></li></ol> 4.エレクトロポレーションによる感染性ウイルスの救出<ol><li>回収すべき構築物当たり1細胞のT182フラスコ（T150とT182との間の許容可能なもの、DMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）中で増殖させたもの）を調製する。モックトランスフェクションコントロールとして1 T182を含める。 Cellsは70〜80％のコンフルエンシーで使用する必要があります。 </li><li>細胞が準備ができたら、37℃に加熱した水槽にDMEM + 15％FBS + 10 mM HEPESを12 mL /反応させます。 </li><li>標準プロトコールを用いてトリプシン処理によって細胞を分離し、トリプシンを不活性化するために10％FBSを含む培地中の細胞を回収する; 4℃で5分間150 xgで細胞を遠心分離する。 </li><li>細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、細胞を150 xgで5分間4℃でペレット化します。この手順を2回繰り返し、合計3回洗浄します。 </li><li> 200μLのRPMI 1640 + 10 mM HEPES（無菌）/サンプル数で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液200μLを滅菌チューブに移す。細胞は〜0.5×10 7細胞/ mLでなければなりません。 </li><li>ステップ3.4で生成した20μLの水（偽陰性対照）または20μLのRNA（好ましくは5〜10μg）を細胞の各セットに加える。チューブをフリックして軽く混合し、チューブの内容物を2mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移す。 </li><li> electrを設定する0Vと950μF（約625V / cm、20msの時定数）のオメガ（抵抗値）を170V LVに変換します。使用可能な場合は、0または∞のいずれかの最低設定値に抵抗を設定します。 </li><li>一度パルスし、ステップ4.2で温めたDMEM + 15％FBS + 10mM HEPES600μLを直ちに添加する。すべての細胞を除去するために、キュベットの内部を徹底的にすすぐ。 10mLの予熱した培地を含むT75組織培養フラスコに細胞を加える。キュベットに含まれているドロッパーを使用して、キュベットから追加のメディアを取り除きます。滅菌状態を維持するように注意してください。 </li><li>スワールフラスコを用いて培地と細胞を混合し、37℃のインキュベーターに入れます。 </li><li>翌日に細胞生存率を確認し、50〜75％の細胞死が観察されるまで毎日行う。細胞死は、模擬電気穿孔対照と比較することによって観察される。 注：ZIKV細胞変性効果（CPE）はVero細胞ではっきりしており、細胞を切り離して培養液中に浮遊させる。我々は持っています収穫に理想的であるとして8-10日の範囲を観察した。 </li><li>コニカルチューブで上清を回収し、4℃で10分間、&gt; 3000 xgで細胞破片を除去するために遠心分離する。 </li><li>清澄化した上清を新しいチューブに移し、20％FBS（100％ストック）の最終濃度で補充する。さらに、凍結している間（1Mの滅菌ストックから）のウイルス感染性を保存するための緩衝剤として最終濃度10mMの滅菌HEPESを添加する。 </li><li>ボルテックスでウイルスを混合し、アリコートをスクリューキャップのバイアルに入れます。将来の使用のために-80℃で保管してください。 </li></ol> 5.回収されたウイルスの滴定<ol><li>滴定の前日に、適切な数のVero細胞の6または12ウェルプレートに播種する。 </li><li>冷凍庫からウイルスを除去し、チューブまたは96ウェルプレート中のDMEM + 2％FBS中で連続的に10倍希釈する。 注：回収されたクローンの期待される力価は、1×10 6〜5×10 7 PFU / mLです。 </li><li> 200 oを追加各希釈液400μLを12ウェルプレートまたは6ウェルプレートのウェルにそれぞれ2回ずつ加える。 </li><li>プレートを37℃のインキュベーターに置き、15分ごとに揺り動かし、合計で約1-1.5時間の吸着期間をおきます。 </li><li>ウイルス接種物を除去し、各ウェルに1mLの（12ウェル）または2mL（6ウェル）DMEM-Tragacanthオーバーレイを加える。 注：ここでは、アガロース、寒天、メチルセルロースまたは他のオーバーレイ培地を使用することが可能です。 </li><li> 5日間37℃インキュベーターで細胞をインキュベートする。適切なプラーク形成の時間は、使用されるオーバーレイによって異なる。 </li><li>細胞を固定するには、インキュベーターからプレートを取り出し、オーバーレイを静かに消毒剤に移す。 </li><li>十分に20％エタノール/0.1%クリスタルバイオレット（CV）を各ウェルに加えて、混合して覆い、渦巻き状に混合する。 注：他の多くの固定剤が存在し、ここで使用することができます。さらに、アガロースまたは寒天オーバレイを使用する場合、ニュートラルレッドと組み合わせて第2オーバーレイを使用して、固定せずにプラークを視覚化することができる。 20％エタノールは、以前の研究でエンベロープウイルスを不活性化するのに効果的である;エンベロープを持たないウイルスにはこの量を使用しないでください。 </li><li>プレートを室温で30〜60分間インキュベートする（クラスIIバイオセーフティーキャビネット内）。 CV（地方条例に従って）を捨て、プレートを水道水で洗う。 </li><li>プレートを乾燥させ、プラークを手動で数える。 注記：参照番号20は、プラークアッセイを実施するためのさらなる参照として使用することができる。 </li></ol>

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(93), e52065 (2014).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone.">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching.">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse model and in mosquitoes. 
Due to the presence of cryptic bacterial promoters in flavivirus genomes3, full-length flavivirus clones are difficult to work with, commonly resulting in mutations, insertions, deletions or rearrangements in plasmids. We sought to alleviate these concerns by separating the ZIKV genome into two plasmids, disrupting the toxic sequences that are present in the viral NS1 gene. This resulted in a more stable system that is also amenable to incorporating changes. Using this clone system, we have introduced several point mutations in the ZIKV genome and inserted foreign sequences in the 3' UTR (data not shown). This system also provides an ideal starting point for studying genetic determinants of pathogenesis, construction of vaccine candidates and development of reporter viruses. Additionally, the clone-derived virus has proven to be an important tool for studying virus evolution22.
The methods described here can also be applied to new two-plasmid clone systems for other ZIKV strains or other flaviviruses, with some modifications. An important consideration for creating new virus clone systems using this approach is identifying a naturally occurring restriction enzyme site in the viral genome near the envelope-NS1 gene junction. If a suitable site cannot be found, then it is possible to generate one artificially via PCRmutagenesis. Alternatively, we have successfully rescued infectious virus by using Gibson assembly, if overlapping segments can be generated via restriction digestion (data not shown). Furthermore, it is necessary to include either a restriction enzyme cleavage site or a ribozyme sequence immediately downstream of the viral genome to ensure an authentic 3'UTR. 
By using a two-plasmid approach, we found that a stable and relatively straightforward cDNA clone system for ZIKV could be developed. The infectious virus recovered from the clone possessed wild-type characteristics in vitro and in vivo. Additionally, this approach can be adapted for any flavivirus, facilitating reverse genetics approaches for other relevant viruses.

Zikaウイルス（ZIKV; Family Flaviviridae ： Flavivirus属）は、2013-14年にブラジルに到着した蚊媒介性フラビウイルスであり、以後、アメリカ全土に広がった熱性疾患の大規模な発生に関連しています1 。さらに、ZIKVは、成人のギラン・バレー症候群や胎児や新生児の小頭症などの重篤な疾患の結果と関連している2 。西半球で急速に普及する前はZIKVについてほとんど知られていなかった。これには分子ツールの欠如が含まれており、したがって機構的研究が妨げられている。感染性cDNAクローンなどのウイルスのための分子ツールは、ワクチンおよび抗ウイルス治療の開発を容易にし、差別的ウイルス病原性、免疫応答およびウイルスの進化に関連するウイルス遺伝因子の評価を可能にする。 フラビウイルスの感染性クローンは、crのため細菌中で非常に不安定であることが知られているそれらのゲノムに存在する恒温性原核生物プロモーター3 。この問題を改善するためにいくつかのアプローチが用いられてきた。ゲノムを複数のプラスミド6に分割すること、低コピー数のベクター（細菌人工染色体を含む） 7,8およびウイルスゲノム9にイントロンを挿入することを含む、ウイルスゲノム9の上流にタンデムリピートの挿入を含む。 ZIKVについては、変更のない1つの全長システムが記載されている。しかし、このクローンは細胞培養およびマウスにおいて弱毒化されているようであった10 。他のグループは、イントロンをZIKVゲノムに組み込んで、インビトロで感染性ウイルス11の産生のために哺乳類細胞でスプライシングされ得る細菌中の不安定な配列の破壊を可能にする、 12 。さらに、感染性サブゲノム - アンプリコンと命名されたPCRベースのシステムは、ZIKV 13の原型MR766株を救済するために首尾よく使用されている。ここに記載されているアプローチは外来配列を必要とせず、以前は黄熱病6 、デング14,15および西ナイルウイルス16で成功裡に使用されている複数のプラスミドを使用することによって、不安定性の高い領域でゲノムを破壊する。さらに、ウイルスゲノム末端でのD型肝炎リボザイム配列の付加は、線状化部位の追加を必要とせずに本物の3 &#39;末端の作製を容易にする。さらに、両方のプラスミドは、低コピー数ベクター（pACYC177、1細胞あたり約15コピー）で構築され、残留毒性を軽減する17 。回収されたウイルスは、哺乳動物および昆虫の両方から誘導された様々な細胞型を含む8細胞株におけるインビトロ増殖曲線における親ウイルスであり 、マウスにおいて同一の病原性プロファイルおよび蚊における感染、播種および感染率を示した18 。 本明細書では、感染性クローンプラスミドを増殖させ、インビトロで全長ウイルスRNA（ウイルスゲノム）を生成し 、細胞培養で感染性ウイルスを回収する方法を記載するプロトコルを詳述する。まず、バクテリアにおけるプラスミドの増殖またはローリングサークル増幅（RCA）を用いた無細菌増幅について説明する。次に、2つのプラスミドがどのように消化され、続いて完全な長さのウイルスを生成するために一緒に連結されるかを示す。最後に、転写されたRNAの産生およびその後のVero細胞への電気穿孔、続いて回収されたウイルスの滴定（ 図1 ）について説明する。説明されたアプローチは迅速であり、fo1〜2週間で感染性ウイルス株を回収する。

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin, Disodium Salt</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 Amplification Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1,000 units/ml</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400,000units/mL</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 High Throughput Electroporation System</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>Other machines are acceptable.</td></tr><tr><td>LB Broth with agar (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>Can be homemade as well.</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>Can be homemade as well.</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>Culture Tubes</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>T182 flasks</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Powder</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Denatured</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Oligos</td><td>IDT</td><td>see table 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>other methods are acceptable.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>other methods are acceptable.</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>other methods are acceptable.</td></tr><tr><td>Class II Biosafety Cabinet</td><td>Varies</td><td>N/A</td><td>This is necessary for live-virus work.</td></tr></tbody></table>

rescue and characterization of recombinant virus from a new world zika virus infectious clone

感染性cDNAクローンは、ウイルスの遺伝子操作を可能にし、したがって、ワクチン、病原性、複製、伝達およびウイルスの進化に関する作業を容易にする。ここでは、アメリカで爆発的な流行を引き起こしているZikaウイルス（ZIKV）の感染クローンの構築について説明します。フラビウイルス由来のプラスミドでよく見られる細菌への毒性を防ぐために、我々はNS1遺伝子のゲノムを分離し、突然変異を伴わずに正常に回収できなかった完全長構築物よりも安定な2プラスミドシステムを作製した。 2つの断片を連結する消化およびライゲーションの後、全長ウイルスRNAを、T7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって生成することができる。転写されたRNAの細胞への電気穿孔の後、同様のインビトロでの増殖速度およびインビボでの病原性および感染表現型をマウスおよび蚊でそれぞれ示したウイルスが回収された。

ここに記載されたプロトコルは、感染性クローン由来Zikaウイルスの回収を可能にする。非常に不安定な全長バージョン（データは示されていない）と比較して、2プラスミドの感染性クローンシステムを操作することは、慎重に行う場合には容易である。 2つの別個の断片の消化およびライゲーションの後、T7ポリメラーゼによるインビトロ転写を用いてキャップされたRNAを生成し、次いでこれをVero細胞に電気穿孔する（ 図1 ）。正しいプラスミド配列は、ミニプレップ（ 図2a ）に続くプロキシとしての制限消化およびRCAまたはマキシプレップを用いた大規模DNA産生後のサンガー配列決定を用いてモニターすることができる。配列決定によるクローンの確認の後、感染性ウイルスの回収は消化、ライゲーション、 インビトロ転写および最後にエレクトロポレーションのみを必要とする。これらのステップは1日で実行できます。正しいダイジェストアガロースゲル電気泳動（ 図2b ）によってモニタリングすることができ、必要に応じてトラブルシューティングを行うことができます。 図3に示すように、感染クローン由来のウイルスは、いくつかの細胞株においてin vitroで親分離株と同様のレベルに複製され、cDNAから回収されたウイルスが一次分離株と同様に複製することが示唆される。さらに、 Aedes aegypti蚊のマウスにおける生存率または感染率、播種率および感染率において、感染性クローン由来ウイルスと親分離株との間に有意差は観察されなかった（ 図4 ）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55857/55857fig1.jpg" /> 図1：2プラスミドcDNAクローンからのZIKVレスキューワークフロー。ZIKV株PRVABC59のゲノムを、pACYC177プラスミド骨格に2つの別個の断片でクローニングした。次いで、2つのプラスミドを消化し、T4DNAリガーゼで連結した。 インビトロ転写後、Vero細胞へのエレクトロポレーションにより、キャップされた感染性RNAが生成された。 （図21を参照）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55857/55857fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55857/55857fig2.jpg" /> 図2：cDNAクローンの消化およびライゲーションをモニターするためのゲル電気泳動。 （ A ）遺伝子安定性を評価するためのミニプレップ由来プラスミドの初期制限消化。 （ B ）2プラスミドクローン系からの感染性ウイルスの回収中の消化およびライゲーション生成物の例。 <a<html> href = &quot;https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55857/55857fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55857/55857fig3.jpg" /> 図3：クローン由来ウイルスのインビトロ増殖速度。プラークアッセイによって、ヒト（SH-SY5Y、JarおよびNTERA2 cI.D1）、蚊（C6 / 36、Aag2）および非ヒト霊長類（Vero）細胞株に対する野生型PRVABC59および感染性クローン誘導ウイルスの増殖動態を評価した。 n = 3エラーバーは平均からの標準偏差を表す。 （図21を参照）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55857/55857fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 55857fig4.jpg &quot;/&gt; 図4：マウスおよび蚊におけるクローン由来ウイルスのin vivo特性。 （ A ）4週齢の雄および雌インターフェロンα、βおよびγ受容体ノックアウトAG129マウスに、1,000 PFUのPRVABC59または感染性クローン由来ウイルスを腹腔内接種し、生存期間（n = 11）を監視した。 Aedes aegyptiの蚊にZIKVを含む感染性の血粉を与え、14日後に解剖した。 （ B ）プラークアッセイを使用して、感染性ウイルスの蚊体（感染）、脚（播種）または唾液分泌（感染）を評価した。速度は、試験された総蚊のパーセントとして提示される（図21参照）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55857/55857fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

このプロトコールは、2プラスミドの感染性cDNAクローンからの感染性Zikaウイルスの回収を記載している。

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K ビュー.  Colorado State University. このプロトコールは、2プラスミドの感染性cDNAクローンからの感染性Zikaウイルスの回収を記載している。 

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly and additional brain abnormalities. However, the mechanism underlying the pathogenesis of ZIKV in the developing brain remains unclear. Intracerebral surgical methods are frequently used in neuroscience research to address questions about both normal and abnormal brain development and brain function. This protocol utilizes classical surgical techniques and describes methods that allow one to model ZIKV-associated human neurological disease in the mouse nervous system. While direct brain inoculation does not model the normal mode of virus transmission, the method allows investigators to ask targeted questions concerning the consequence after ZIKV infection of the developing brain. This protocol describes embryonic, neonatal, and adult stages of intraventricular inoculation of ZIKV. Once mastered, this method can become a straightforward and reproducible technique that only takes a few hours to perform.

Here we describe a method for establishing a model of Zika virus-induced microcephaly in mouse. This protocol includes methods for embryonic, neonatal, and adult-stage intracerebral inoculation of the Zika virus.

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

神経科学

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

ジカウイルス複製阻害剤をスクリーニングする高スループット抗ウイルスアッセイ

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

要約

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プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

ジカウイルス感染細胞培養系と

ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

脳内注入戦略を使用してジカウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析

ジカウイルス複製阻害剤をスクリーニングする高スループット抗ウイルスアッセイ

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

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プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

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ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

ジカウイルス複製阻害剤をスクリーニングする高スループット抗ウイルスアッセイ

ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

脳内注入戦略を使用してジカウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析