Name: zika virus infectious cell culture system and the in vitro prophylactic effect of interferons
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
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We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

注：作業の流れの模式的な概要を図1に示されています。 1.細胞<ol><li>ジカウイルスの産生およびウイルス複製サイクルの分析のためのVero細胞を使用してください。 </li><li>完全な10％ウシ胎児血清（FBS）を含む増殖培地、2mMのL-グルタミン、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100単位/ ml）、および10mM HEPESを準備します。 </li><li> 5％CO 2で37℃で指定の完全増殖培地で培養Vero細胞。 </li></ol> 2.ジカウイルスの生産<ol><li> T-75フラスコ中の0.25％トリプシンを用いて80％の細胞密度でVero細胞を採取し、細胞を数えます。 <ol><li> T-75培養フラスコから培地を吸引し、2mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。 </li><li> 0.25％トリプシンの2ミリリットルを加え、37℃で5分間フラスコをインキュベートします。 </li><li>トリプシンを不活性化するために、増殖培地を含む血清の8ミリリットルを追加します。上下SUSにピペット保留細胞を15mlチューブに細胞を移すと。 </li><li>細胞の10μLを削除し、0.4％トリパンブルーの同量と混合。細胞計数チャンバースライドにプレミックスをロードし、生存細胞は自動細胞カウンターを用いてカウントし得ます。 </li></ol></li><li> T-160フラスコに30ミリリットルボリューム7万個の細胞の合計をシード。 </li><li>翌日、フラスコ当たり10ミリリットルの無血清培地中でジカウイルス接種物（0.1 MOI 0.01）感染症の適切な多重度を準備します。 </li><li> T-160フラスコから使用済み培地を外し、新たに調製したウイルス接種（10ミリリットル）を追加します。 </li><li> 4-6時間、5％CO 2で37℃で接種したフラスコをインキュベートします。静かにすべての時間で横向きにフラスコを傾けることによって、接種物を広げます。 </li><li>インキュベーションの終了時に、各フラスコのために暖かい血清添加増殖培地（30ml）で接種材料を交換してください。その後、次の96時間のためにウイルス培養を続けます。 </li><li>での進行を確認します位相差顕微鏡を使用し、40Xおよび200X倍率での必要に応じた画像（ 図2）を取る細胞単層にウイルスプラークの出現を観察することによりフェクション。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> 図2：様々な倍率のVero細胞の単層上ジカウイルスによって形成されたプラーク明視野画像は48 HPIでZikaウイルスプラークを示します。単分子膜上の丸い細胞病巣の存在に注意してください。 （スケールバー= 50μm）は<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="8"><li>収穫細胞培養上清を96時間の時点で、細胞破片を除去し、4℃で10分間、300×gで上清を遠心。 </li><li>慎重にペレット化破片や転送トンを乱すことなく上清を除去し15ミリリットルチューブO。 24,000×gで超遠心分離（オプション）は、ウイルス粒子を濃縮するために行うことができます。 </li><li> -80℃で複数のアリコート中のウイルス培養上清を保管してください。 </li></ol> 3.プラークアッセイによってジカウイルスの力価を測定<ol><li> 12ウェルプレートを使用して、2ミリリットルの体積でウェル当たり1×10 5細胞でシードナイーブVero細胞。 </li><li>翌日、無血清培地を使用して、T-160フラスコから採取したウイルス培養上清の10倍連続希釈液を準備します。各ウェルから使用済み培地を取り出して、三重にVero細胞上に準備された接種物の400μlを添加します。 </li><li> 37で接種したフラスコをインキュベート 4-6時間、5％CO 2とC°。優しくごとに1時間で横向きプレートを傾けることによって接種材料を広げます。 </li><li>インキュベーションの終わりに、血清添加培地（ウェル当たり2ml）で接種材料を交換してください。 </li><li> 48時間後の接種では、位相CONTRを用いてウイルス増殖巣を数えますAST顕微鏡。 1ml当たりのプラーク形成単位（P​​FU）のようなウイルス力価を計算します。プラークアッセイのために、図3を参照してください。 </li><li>修正プラークの明確な可視化のために20％エタノール中で調製した4％ホルムアルデヒドで細胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液を染色します。 </li></ol> 4. Zikaウイルスゲノム複製アッセイ<ol><li> 12ウェルプレートを使用して、2ミリリットルの容量でウェル当たり1×10 5細胞でシードナイーブVero細胞。三重で無血清培地を用いて、低および高力価の、次の日、ウイルス接種物（400μL/ウェル0.01および0.1のMOI）を準備します。モック感染のために、無血清培地（400μL/ウェル）のみを使用します。 </li><li> 、手順3.4から3.2を繰り返します。 </li><li> 48および96時間の時点で、RNAおよび免疫細胞化学（ICC）のためのサンプルを収集。 <ol><li>収穫RNAサンプルについては、各ウェルに直接溶解溶液の400μlを添加し、溶解物を収集し、メディアを削除します。 </li><li> ICCのために、メディアおよびトンを削除鶏は、各ウェルに1mlのメタノールを添加することにより細胞を固定し、4℃で30分間プレートをインキュベートします。 </li><li>細胞溶解物から、製造者の指示に従ってRNA単離キットを用いて全RNAを単離します。分光光度計を用いてRNAを定量化します。 </li></ol></li><li>回収RNAからZIKVゲノムコンテンツを決定するために、二段階逆転写定量的PCR（RT-qPCRの）を実行します。 <ol><li> RNAを逆転写するために、最初の0.2ミリリットルチューブ内で単離されたRNAの5μgの、dNTPの1μL（10 mM）の、および1μlのランダムヘキサマー（250 ngの）から成る13μlの反応ミックスを設定します。 65℃で5分間チューブをインキュベートした後、1分間氷の上に置きます。続いて、逆転写酵素を1μl、5×鎖合成バッファー4μlの、0.1 Mジチオスレイトールの1μlを、反応ミックスにRNase阻害剤の1μlを添加します。 50℃、inactivで60分間、続いて25℃でさらに5分間チューブをインキュベート15分間70℃に加熱することにより反応を食べました。 </li><li> 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39;：DNAポリメラーゼおよびジカウイルスのための特定の10mM1μlの個々のプライマーについて[ジカウイルスパン-遺伝子型プライマーを（含む2倍の緑色の色素スーパーミックス12.5μlの得られたcDNAの1μLを使用して定量PCRを実行します; REV：5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;）、ジカウイルスアジア遺伝子型PRVABC59株プライマー（5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; REV：5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;）]、またはC型肝炎ウイルス（JFH RTQ F：5 「CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R：5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;）、またはのための細胞のハウスキーピング遺伝子GAPDH（5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3&#39;; REV：5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3 &#39;）、25μlの反応体積です。 </li><li>リアルタイムPCRシステムでは30秒15秒、60°C（40サイクル）の実行条件95°Cを用いてPCRを行います。 </li><li> Zを正規化するために、サイクル閾値（Ct）値に基づいて、GAPDH発現レベルを使用ウイルスゲノムの測定IKA。 GAPDHのそれと比較しZikaゲノムのデルタCT（のΔCt）値を計算し、2 のΔCt値を得ます。そして、指示された時点で、感染及び非感染細胞との間の正規化されたZikaゲノムコンテンツの比率を取ることによって、倍率変化を計算します。 ZIKVゲノムの複製の結果については、 図4を参照してください。 </li></ol></li><li>メタノール固定した細胞を使用してICCを実行します。 <ol><li> （PBS中0.1％のTriton-X 100、3％ヤギ血清、3％BSA）1×PBSで固定した細胞を3回洗浄し、ICCブロッキング緩衝液でブロックします。 </li><li>ブロッキング緩衝液中で100と4℃で一晩インキュベート：1の希釈でマウスモノクローナル抗のdsRNA抗体J2（1μg/ ml）を使用してください。 </li><li> 1×PBSで細胞を洗浄し、1で二次抗体ヤギ抗マウスIgG-594（1μg/ ml）を追加しますブロッキングバッファー1,000希釈し、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>ヘキスト染料を使用して、核のために1×PBSおよび染色で細胞を洗浄し、100Xの倍率で蛍光顕微鏡（ 図4）を用いて細胞を観察します。 </li></ol></li></ol> 5.ジカウイルス感染に対するサイトカインライブラリをスクリーニング<ol><li> 12ウェルプレートを使用してあたり1×10 5個の細胞をナイーブVero細胞を播種します。細胞は（6時間後に播種）添付されると、生物学的重複で指示された濃度（2ミリリットル容量/ウェル）で各サイトカインを追加します。車両（PBS）単独の対照を含めます。 </li><li> 12時間後処理では、Zikaウイルス感染（ウェル当たり400μlの0.1のMOI）を行います。感染症（モック）なしの陰性対照ウェルを含めます。 </li><li> 4時間後の感染では、サイトカイン処理されたメディア（2ミリリットル）とのウイルス接種を交換してください。追加の44時間、37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 48時間の感染後に、位相差顕微鏡を用いてウイルスプラークをカウントし、40倍の倍率（ 図5）で感染させた細胞の代表的な画像を取得します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report.">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li><li>Lucey, D. R., Gostin, L. 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The authors have nothing to disclose.

ここでは、in vitroでジカウイルスを培養するための合理化されたプロトコルが提示されます。含む、ウイルス培養を拡大するための最適なエンドポイントを識別し、力価を測定し、ゲノムの複製を定量化する重要なステップを提供しました。ジカウイルスは、感染性物質の処理中に、生物学的安全手順が厳密に従うべきであり、人間の病原体である、そう。サル腎臓細胞株、ベロは、様々なウイルス学的アッセイを実証するために使用しました。 Zikaウイルス複製の動態は、様々な組織や種の細胞で異なる場合があります。先に説明したように15の追加の細胞株を使用することができます。ジカウイルスは、感染した胎児3の脳組織から単離された皮質神経前駆細胞14に感染することが示されています。このように、神経細胞にZIKV感染の病態生理を評価するには、追加の細胞特異的な洞察を提供することができます。アフリカやアジアの遺伝子型の神経毒性表現型の違いを調べることができますこの感染培養系を使用して。ここに記載のウイルス製造手順は、非ヒト霊長類またはげっ歯類モデル系におけるin vivo病原性の研究に向けて高力価ウイルスを生成するために有用であろう。 本研究ではVero細胞の使用に限定され、一方、ヒトおよび蚊由来の高力価産生細胞株を試験することができます。 CPEは、3日目に、細胞のわずか10〜30％で観察された場合、ウイルス生産の間、感染細胞を1に分割することができる：4密度培養は、さらなる4~5日間継続することができます。 7 日目の終わりには、完全なCPEを観察することができます。 ZIKVパン-遺伝子型と株特異的プライマーの効率を比較し、両方が低く、高力価のウイルス感染細胞にZikaウイルスゲノムを定量化する中で敏感であることを決定しました。さらに、本研究では、抗体に基づくプローブは、感染した細胞を同定するために検証されます。このdsRNA特異的な抗体に成功RECOジカウイルス感染細胞における細胞質ウイルスゲノムをgnized。これらの最適化された試薬は、翻訳、ゲノムの複製、アセンブリおよびビリオンの形態形成などのウイルス複製の様々な段階を分析するための有用なリソースとなります。 このインビトロ感染細胞培養系は、ジカウイルス特異的サブゲノムレプリコンを使用して、将来の研究および相補的DNA（cDNA）クローンから生成された感染性ウイルスに適用可能です。 Zikaウイルスの感染性cDNAクローンの開発は、遺伝的および分子生物学的手法を組み合わせることにより、NS1、およびNS4Bを含むウイルス遺伝子の機能研究を加速していきます。蛍光または発光ベースのレポーター遺伝子は、さらに、高含有量スクリーニングアッセイで細胞培養系を使用して製造するのに貴重なツールになるでタグ付けジカウイルスの確立。 両方のI型およびII型IFNは、抗Zikaウイルス活性を示しました。 IFN-α、IFN-βおよびIFN-γは、さらにEVすることができますジカウイルス感染症と関連疾患の予防、後露光、予防、および治療などの臨床現場でaluated。ジカウイルスについて陽性妊婦を含む高リスク群では、治療の最初の行としてインターフェロンで処理することができます。インターフェロンα治療は、妊婦18,19のために安全であることが示されています。 要約すると、Zikaウイルス増殖の様々な側面を研究するために使用することができる感染細胞培養系を記載し、概説されています。ここで説明されたプロトコルおよび試薬は、ジカウイルスおよび神経学的研究コミュニティを研究する人のための重要な資源です。

ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、貧しい妊娠1,4を成果に関連した重要なヒト病原体です。 ZIKVは、デング熱、西ナイル、セントルイス脳炎ウイルスなどの神経学的欠陥を引き起こす可能性が医学的に関連するフラビウイルスのセットに属します。ウイルス伝播の主なモードに加えて、性行為も5,6報告されている、蚊ベクターネッタイシマカによるものである、と。 ZIKVが原因蚊ベクトルの拡大地理的分布と先天性欠損症との強い相関関係に世界の主要な健康問題となっています。 ZIKVが最初Zika林におけるセンチネルアカゲザルから1947年に単離された、ウガンダ、最初の人間の場合は1952 7,8で報告されました。発熱、発疹、頭痛、結膜炎、および筋肉/関節痛などの軽度の症状を示すZIKVに感染する個人。感染した妊婦は胎児1にZIKVを送信することができます。 ZIKV感染はまた、ギラ ​​ン・バレー症候群、末梢神経自己免疫脱髄障害9に関連しています。 Zikaウイルスゲノムは、長さが約10.8キロベースであるプラスセンス一本鎖RNA分子から成ります。ゲノムの構造は、タンパク質コード領域に隣接する非コード領域（NCR）と、5&#39;NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3&#39;NCRとして編成されています6。単一のポリタンパク質（3419 AA）はコポリマーおよび翻訳後10より小さなペプチドに切断されている翻訳されています。 5&#39;NCRと3&#39;NCR RNAステム - ループ構造の両方は、ウイルスゲノムの翻訳および複製の開始に重要な役割を果たしています。ゲノムの構造部品はキャプシド、膜およびエンベロープタンパク質で構成されています。非構造タンパク質は、ゲノム複製のために重要です。 現在、Zikaウイルス株は、3つの主要な遺伝子型に分類されます。西アフリカ、東アフリカ、そしてアジア6,10-13。それは、後にさらに12を進化させ西アフリカとアジア、に東アフリカ系統普及ことが提案されています。アジアの遺伝子型は、アメリカの現在の集団発生の原因です。ジカウイルスは、蚊及び哺乳動物細胞の両方において培養することができます。一次皮膚線維芽細胞、未熟樹状細胞、皮質神経前駆細胞、およびベロ細胞がZikaウイルス感染10,14,15を受けやすいです。両方のI型およびII型インターフェロンは、皮膚線維芽細胞15でZIKV成長を抑制することが示されています。この研究の目的は、哺乳動物細胞培養系におけるアジア遺伝子型ZIKAウイルス株PRVABC59の産生およびアッセイのための段階的な詳細なプロトコルを提供し、薬剤開発プラットフォームとしてこの感染培養系の有用性を実証することです。このリソースは大幅にさらに私を解明するZikaウイルスおよび神経学的研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めていますウイルスの病原性のウイルスの病原性と進化のtsのメカニズム。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Countess &amp;ndash; Automated Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess-cell counting&amp;nbsp; chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&amp;nbsp;</td><td>English &amp;amp; Scientific Consulting Kft.</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cell Line&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>Zika viral strain PRVABC59</td><td>Centers for Disease Control and Prevention (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 alpha&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interferon alpha A&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>Interferon beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI</td><td>Nikon</td><td>Visit Nikon for Request</td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus infectious cell culture system and the in vitro prophylactic effect of interferons

ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、眼の欠陥、および成長障害などの胎児の発育異常にリンクされている新興病原体です。 ZIKVは、 フラビウイルス科のRNAウイルスです。 ZIKVは主に蚊によって送信されるだけでなく、胎児の垂直感染への母体だけでなく、性的接触によって広げることができます。現在までに、ウイルスに感染したものを保護するために利用可能な信頼性の高い治療法やワクチンのオプションがありません。再現性のある、効果的なジカウイルス感染細胞培養系の開発はZIKV複製だけでなく、薬物およびワクチン開発の分子メカニズムを研究するために重要です。この点で、ウイルス産生および増殖の分析のために哺乳動物細胞に基づくインビトロジカウイルス培養系内を記述するプロトコルはここで報告されます。ウイルス力価を測定するための細胞単層およびプラークアッセイにジカウイルスによってプラークの形成の詳細が提示されています。ウイルスゲノムの複製動態二本鎖RNAゲノムreplicatory中間体が決定されます。この培養プラットフォームはZikaウイルス増殖の強力な阻害剤として、インターフェロン-α（IFN-α）、IFN-βおよびIFN-γの識別結果としてのサイトカインの小さなセットのライブラリーに対してスクリーニングするために利用されました。要約すると、in vitroでの感染Zikaウイルス培養系と様々なウイルス学的ア ​​ッセイが大きく、さらにウイルスの病原性とウイルスの病原性の進化のメカニズムの解明に研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めているこの研究で実証されています。抗ウイルスIFN-αは、さらに感染した妊婦を含む高リスク集団におけるジカウイルス感染症の予防、露光後、予防、および治療の選択肢として評価することができます。

Zikaウイルス株（PRVABC59; GenBank登録番号KU501215）アジア遺伝子型のは、この研究12で使用しました。 80％コンフルエントでVero細胞をデノボ Zikaウイルス感染を調べるために使用しました。ウイルス産生およびその後のウイルス学的特徴付けのために、初期継代（P3）ジカウイルスを用いました。ウイルスプラークは、感染の二日目に観察されました。最初に感染した細胞から放出さZikaウイルス子孫は、単層培養（ 図2）上に表示斑の形成をもたらし、隣接するセルに分散させることができます。 Zikaウイルス感染の細胞変性効果（CPE）は、このような細胞ならびに溶解性の細胞死の丸めや剥離などの形態学的変化によって特徴付けられます。 ウイルス力価を測定するために、T-160フラスコから回収したウイルスを含有する無細胞上清を、10-FOLに供しましたD段階希釈し、12ウェルプレートフォーマットでVero細胞の単層に添加した （ 図3）。 48時間後、接種の時点は、二次感染から生じるプラークをカウント避けるために、エンドポイントとして使用しました。 30-100プラークを有するウェルを正確力価を得るために、計数のために選択しました。 RT-qPCRのアッセイは、ジカウイルスのゲノムの複製を推定するために利用されました。高度に保存されたZIKV NS5領域に特異的な汎遺伝子型プライマー対は3,16が含まれていました。汎遺伝子型プライマー（プライマーの配列は、プロトコルセクション4.4.2に記載されている）のゲノム上の位置に基づいてZikaウイルス株のPRVABC59特異的プライマーをも試験しました。プライマー対の両方が、感染した細胞（ 図4）からZikaウイルスゲノムの増幅に感度の同様のレベルを示しました。陰性対照として、C型肝炎ウイルス特異的プライマーはまた、17を試験しました。重要なINCRZIKVウイルスゲノムコンテンツに容易に低MOIは堅牢ウイルス感染を示唆し、感染細胞の高い（ 図4）の両方で48および96時間の時点の間で観察されました。フラビウイルスゲノムの複製の間に、二本鎖（ds）RNA replicatory中間体は、センスおよびアンチセンスゲノムRNAとの間の塩基対の形成によって生成されます。特異的に認識するdsRNAのための抗体プローブは、ウイルス感染細胞（ 図4）を検出しました。ウイルスdsRNAは、ゲノムの複製コンパートメントを示唆する細胞質に局在していました。免疫細胞化学染色は、48および96時間の時点の間に、ウイルス感染した細胞の拡大を明らかにしました。 感染ジカウイルス培養系を使用して、サイトカインの小さなライブラリーを抗ウイルス活性（ 図5）を決定するためにスクリーニングしました。細胞を、12時間、種々のサイトカインで前処理した後、ジカウイルスを感染させました。タイプI I<html> nterferon、IFN-αは、試験した用量[10国際単位（IU）、100 IU 1,000 IU]の広い範囲にジカウイルスに対して強力な抗ウイルス活性を示しました。 IFN-βは、同様に強力な阻害効果を示しました。 II型IFN-γは、抗Zikaウイルス活性を示しました。 TNF-αのサイトカイン、IL-1及びIL-6は、指示された薬物濃度でZIKVを阻害しませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig1.jpg" /> 図1：。 ジカウイルス産生およびアッセイのワークフローの概要ウイルス産生のためには、ZIKVは、T-160組織培養フラスコ中でVero細胞に接種されます。 48または96 HPIで、無細胞ウイルス上清を回収して、下流の分析のために-80℃で保存しました。ウイルス力価は、限界希釈アッセイによって測定されます。ジカウイルス接種物は、その後、ウイル​​ス複製の動態を研究し、薬剤化合物をスクリーニングするために使用されます。href = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig3.jpg" /> 図3：。 ジカウイルス産生を測定するためのプラークアッセイナイーブVero細胞をウイルス力価を測定するために使用しました。明視野画像は、種々の希釈（スケールバー=50μm）をでウイルスプラークの密度を示しています。注：1：100希釈の画像を正確にカウントすることができる明確なプラークを示し<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig4.jpg" /> 図4： ジカウイルスの複製を評価するためのアッセイ。 </strong&gt;（A）のグラフは、RT-qPCRにより測定さジカウイルスゲノムの内容を示しています。汎遺伝子型（ZIKV GEN）とPRVABC59-株（ZIKV UNI）プライマーの両方が同等の感度と特異性を示しました。予想されるように、C型肝炎ウイルス（HCV）プライマーは、任意の産物を増幅しませんでした。 （B）のグラフは、感染していないモック対照のそれに比べて低いと高力価感染した細胞中で示された時点でZikaウイルスの増殖速度を示します。平均値と標準偏差が与えられています。 （C）は、ウイルスの複製を調査するための免疫細胞化学分析。ジカウイルス感染細胞を特異的dsRNAを抗体で染色しました。 96 HPIで細胞のほとんどが感染しているのに対し、48 HPIで、感染した細胞は、いくつかのクラスタです。ヘキスト染色は、核の可視化（スケールバー= 50ミクロン）のために使用しました。 BF：明視野像。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig5.jpg" /> 図5： インターフェロンは強力な抗Zikaウイルス活性を実証するには、（A）のグラフは、ビヒクル対照と比較し、様々なサイトカインによりZikaウイルスの増殖の調節を示します。平均値と標準偏差をバ​​ーグラフに示されています。インターフェロンは、ジカウイルス複製（p値&lt;0.05）の統計的に有意な阻害を示しました。 （BおよびC）を有するまたはサイトカイン治療なしジカウイルス感染細胞の位相差画像。感染した細胞によって形成されたウイルスプラークは、病巣として見ることができます。インターフェロン処理したウェルは、ウイルスプラークを持っていないことに注意してください。 ZIKV感染なしのモックコントロールは、陰性対照として含まれています。 （スケールバー=50μm）を<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig5large.jpg" target="_blank">大きく表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のバージョン。

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Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

20.7K ビュー.  Cedars-Sinai Medical Center. Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

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Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

発生生物学

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

免疫・感染学

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

神経科学

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

ジカウイルス複製阻害剤をスクリーニングする高スループット抗ウイルスアッセイ

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture plate wells embedded with electrodes. The technology can be used to monitor the consequences of Zika virus (ZIKV) infection and adherent cell replication in real time, as this virus is highly cytopathogenic. It is a straightforward assay that does not require the use of labels or invasive methods and has the benefit of providing real-time data. The kinetics of ZIKV infection are highly dependent on the employed cell line, virus strain, and multiplicity of infection (MOI), which cannot be easily studied with conventional endpoint assays. Furthermore, the CEI assay can also be used for the evaluation and characterization of antiviral compounds, which can also have dynamic inhibitory properties over the course of infection. This methods article gives a detailed explanation of the practical execution of the CEI assay and its potential applications in ZIKV research and antiviral research in general.

Here, we demonstrate the use of cell-based electrical impedance (CEI) as a very easy and straightforward method to study Zika virus infection and replication in human cells in real time. Furthermore, the CEI assay is useful for the evaluation of antiviral compounds.

ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

Source: Contreras, D. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54767">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

ジカウイルス増殖の強力な阻害剤としてのインターフェロンをスクリーニングするためのIn vitroアッセイ

1. Screening Cytokine Library against Zika Virus Infection

	Seed naive Vero cells at 1 x 105 cells per well using a 12-well plate. Once the cells are ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫療法

免疫原性とワクチン開発

Zika Virus Infection of Fetal Neural Stem Cells

Source: McGrath, E. L., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56917">Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a procedure to infect human fetal neural stem cells with Zika virus. The infected cells can be used for further studies.

Source: McGrath, E. L., et al., Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis. J. Vis. Exp. (2018)
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ジカウイルス感染細胞培養系と

要約

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ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカウイルス感染症をモデル化

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

ジカウイルス複製阻害剤をスクリーニングする高スループット抗ウイルスアッセイ

ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム

ジカウイルス増殖の強力な阻害剤としてのインターフェロンをスクリーニングするためのIn vitroアッセイ

Zika Virus Infection of Fetal Neural Stem Cells

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