Name: techniques to induce and quantify cellular senescence
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

この研究は、米国立衛生研究所の学内研究プログラム、アメリカ国立老化研究所によってサポートされていました。著者らはまた、批判的に原稿を読み取るための老化とKotb Abdelmohsenに関する多くの有用な議論のためにマイリアム・ゴロスプとKotb Abdelmohsenに感謝したいです。我々はまた、批判的に原稿を読み取るため、特にダグラス・ドルズン私たちの研究室のメンバーに感謝します。

著者は、開示することは何もありません。

ここでは、ヒト二倍体線維芽細胞を使用して複製し、DNA損傷誘発性老化のための方法を記載しています。加えて、種々の老化関連タンパク質のタンパク質およびmRNAレベルを定量するための技術が含まれ、ならびにSA-β-galのため及びDNA損傷マーカーγ-H2AXの染色します。多くの注意点は、インビボ 20 に老化を特徴付けるために存在するが、これらのプロトコルは、広く、in vitroおよびin vivoの両方老化表現型を評価するために使用することができます。他の細胞は、それらが老化細胞でない場合でも、老化マーカーを発現することができます。例えば、そのような破骨細胞およびマクロファージのような細胞は、β-gal活性32,33のより高いレベルを有します。また、多くの癌細胞は、P16のINK4A 34をアップレギュレートされています。細胞は、DNA損傷（ 例えば、γ-H2AXフォーカス）を蓄積し、老化することができません。 SASP要因もによってアップレギュレートすることができます種々の正常な生理学的や老化細胞が関与してもしなくてもよい病的状態。したがって、複数老化マーカーは、in vivoでの老化を評価する場合は特に、使用されるべきです。 老化細胞は、4 20年以上前に正常な老化の組織で増加することが判明したものの、それは我々が完全に老化細胞は、正常組織の恒常性の両方におよび病理学的条件において果たす役割の茄多を鑑賞していることを今だけです。 p16 INK4A陽性老化細胞を排除するためのマウスモデルの最近の雇用は、研究者より明確にする許可し、正確な組織や臓器35、36、37で老化細胞の役割を高く評価しています。これらのモデルは、老化細胞は、年齢に関連した病理、腫瘍形成の多数に寄与することを明らかにし、マウスの寿命35きました&lt;/ SUP&gt;、36、37。これらの最近の発見および生理学における老化細胞の重要性の検証を考えると、時間はこれらの特定の細胞の詳細な研究のために熟しています。例えば、治療的に老化細胞を除去するため、または老化を遅らせるための戦略を用いた研究はhealthspanと寿命試験の両方のために有益であり得ます。 最近、私たちの研究室では、メトホルミン、一般的に2型糖尿病を治療するために使用される薬剤、細胞の老化38が減少しました。メトホルミンは、現在、抗加齢療法として提案し、抗癌特性39、40を有しているとして、それはこの薬、または他の老化介入は、細胞老化を調節することによって、健康アウトカムに影響を与えるかどうかを探るために、将来的には興味深いだろう。 我々はここで議論するプロトコルは、広く一般的とされています老化表現型を評価するためのテクニックをccepted。 in vitroで増殖させた細胞のためには、（ 図1および2を参照）、細胞が老化していることを確実にするために平らな形態に紡錘状の細胞の変化を監視することが重要です。細胞は、SA-β-galで又は本明細書に記載の他のマーカーについて陽性でない場合は、（複製老化の場合）またはDNA損傷誘導性の老化後に増加した時に高い細胞のPDLで老化を評価します。また、これらのプロトコルは、異なる細胞タイプに合わせて最適化する必要があるかもしれません。 SASPタンパク質レベルを評価するために、ELISAまたはタンパク質アレイにおける高いバックグラウンドレベルの原因となりますよう、細胞培地から血清を除去することが重要です。実験を設計するとき、それは同時に複数のマーカーを評価するための理想的ではないかもしれないしたがって、これを覚えておきます。 SA-β-galでの染色、ここで説明したように、それは細胞の固定を必要とするという事実によって制限されています。加えて、細胞コンフルエンスはSA-β-gal活性に影響を与えることが示されています。プロトコルは、41、42、43、フローサイトメトリーを用いて生細胞におけるこのマーカーの定量化を可能にβ-gal活性のための蛍光基質を用いて、SA-β-gal活性を評価するために開発されてきました。 SA-β-gal活性はまた、化学発光法44を用いて、細胞溶解物中で測定することができます。また、γ-H2AXはまた、フローサイトメトリーまたは細胞溶解物45の免疫ブロット法を含む様々な他の方法を用いて測定することができます。 SAHF形成は細胞株依存性であり、主に癌遺伝子誘導性の老化20、30、46に関連していることに留意すべきです。したがって、SAHFは、すべての老化のモデルには存在しないかもしれません。の有用性マウスモデルにおける老化マーカーとしてSAHFもSAHFは一般マウス老化細胞30、46、47で観察されていないという事実によって制限され得ます。ここで、H3K9Me2に対する抗体を使用したが、SAHFの他の分子マーカーはmacroH2A、高移動度グループA（HMGA）タンパク質、およびトリメチルリジン9のヒストンH3（のH3K9me3）と結合したHP1タンパク質を含む、使用することができます。また、クロマチン免疫沈降アッセイは、ヒストンマークまたはE2F標的遺伝子への結合タンパク質クロマチンの関連を評価するために使用することができます。 一つは、マーカーの異質性と、これらのマーカーは、老化細胞でのみ発現されていないという事実を含め、老化を特徴付けるに様々な制限があることに注意する必要があります。複数（一般的に、2から3）マーカーは、ここに記載されていないマーカーを含む、老化を評価するために使用されるべきです。例えば、DNA-瘢痕、テロメア損傷、および/またはDNA損傷シグナルも定量化することができます。また、老化および、特に、SASP表現型として、最近老化11、12、13誘導特定のストレッサ又は損傷の影響を受けることが示されており、各実験パラダイムにおいて、複数のマーカーを評価することが重要です。

半世紀以上前に、ヘイフリックらは、培養液中で増殖する方法を非形質転換細胞述べたが、時間が1しか有限期間のため。ヒト線維芽細胞の長期培養は、細胞が増殖を停止させました。しかし、彼らは代謝的に活性であったが、これは細胞の老化と呼ばれていました。老化は、腫瘍形成を阻害するために有益であることができるが、老化2、3で発生再生能力の損失に寄与すると考えられているとしても、有害であることができます。老化細胞は、4歳の人間と胚発生、創傷治癒、組織修復、および年齢に関連した炎症2を含む生物学的プロセスの数に関与しているとして、組織に蓄積することが示されています。 培養中の細胞の継続的な継代は、リンクされている複製老化を誘導し、テロメア損耗とゲノム不安定性へ。 DNA損傷および癌遺伝子を含む種々の細胞ストレスも、老化3を引き起こす可能性があります。テロメア損耗以外の要因による老化は、多くの場合、ストレス誘導や早期老化と呼ばれ、一般のp16 INK4A / RB経路5に依存しています。増殖し、非形質転換細胞は、典型的には、形状のスピンドルに見えるが、老化細胞は、平坦な、大型形態および増加老化関連βガラクトシダーゼ活性（SA-β-GAL）（ 図1および2）を含む特定の特性を有するものとして同定することができます。老化細胞はまた、γ-H2AX（ 図3）6、及び、潜在的に、老化関連ヘテロ病巣（SAHF）（ 図4）7を含む、DNA損傷マーカーを蓄積します。老化細胞は、Pを含む細胞周期調節因子の高いレベルを持っています<html> 16（P16 INK4A）および/またはp21およびp53の（ 図5）8、9。また、最近のデータは、老化細胞は、炎症性サイトカインおよびケモカインの数を分泌することによって、非自律的な効果を有し得ることを示した老化関連分泌表現型（SASP）10と呼ばれます。このSASP現象は、一般に、細胞型への細胞タイプによって異なる場合があるが、それはインターロイキン6（IL-6）の増加によって実証される、IL-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、増殖 - 調整された癌遺伝子α（GRO-α）、およびGRO-β、とりわけ（ 図6）。老化を誘導する特定のストレスまたは損傷はまた、分泌表現型11、12、13に影響を与え得ます。 SASPは、ELISA法またはサイトカイン/タンパク質アレイを用いて、分泌タンパク質のレベルを測定することによって検出することができますS = &quot;外部参照&quot;&gt; 10、14。転写後機構がSASPタンパク質レベル11、15、16、17を調節することができるが、mRNAレベルの変化はまた、多くの場合に検出することができます。これらの変更は、一般的に、より敏感とタンパク質レベルの測定より定量化するのが容易です。他の老化マーカーはまた、永続的なDNA損傷核フォーカス、老化（DNA-SCARS）18補強クロマチン変化と呼ばれるDNAセグメント、および様々な他のマーカー3、19、20を含め、評価することができます。 ここでは、SA-β-Galを、γ-H2AX、SAHF、およびタンパク質および老化のmRNAを含む、培養中の細胞に老化を誘導し、また老化のいくつかのマーカーを測定するための一般的な技術を記述しますNCE関連分子。

<table><tbody><tr><td>16% Tris-glycine gels</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol ChCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Cell lifters</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>Cell scraper</td></tr><tr><td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td><td>Pierce</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>MP01306</td><td>stock 5 mg/mL in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>GAPDH antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32233</td><td>1:1,000 - 5,000 dilution</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Human IL-6 Quantikine ELISA assay</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-8 Quantikine ELISA assay</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-dimethylformamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 monoclonal antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>p21 monoclonal antibody</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>1:750 dilution</td></tr><tr><td>p53 monoclonal antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>1:500 dilution clone DO-1</td></tr><tr><td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9719</td><td>1:2,000 dilution</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;POWER&lt;/em&gt; SYBR-green PCR master mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Pre-stained molecular weight markers</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Senescence &amp;beta;-Galactosidase Staining Kit</td><td>Cell Signaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques to induce and quantify cellular senescence

細胞ストレスやダメージを受けて、増殖細胞は、細胞の老化と呼ばれる長期的な細胞周期停止の状態を開始し、特定のプログラムを、誘導することができます。老化細胞の蓄積は、生物加齢とし、in vitroでの継続的な培養を介して行われます。老化細胞は、胚発生、組織修復及び再生、腫瘍抑制、および老化を含む多くの生物学的プロセスに影響を与えます。老化細胞の顕著な特徴としては、増加した老化関連βガラクトシダーゼ活性（SA-β-GAL）が、これらに限定されません。 p16 INK4A、p53及びp21レベル。 γ-H2AXを含むDNA損傷のより高いレベル、。老化関連ヘテロクロマチン病巣（SAHF）の形成。及び老化関連分泌表現型（SASP）、炎症性サイトカインおよびシグナル伝達分子の数の分泌によって特徴付けられる現象の取得。ここでは、我々は両方の複製のためのプロトコルを記述し、培養細胞におけるDNA損傷誘発性老化。加えて、我々は、SA-β-galを、γ-H2AXおよびSAHF染色を含むいくつかの老化関連マーカーを使用して老化表現型を監視するため、および細胞周期調節およびSASP因子のタンパク質およびmRNAレベルを定量するための技術を強調する。これらの方法には様々なモデルや組織における老化の評価に適用することができます。

図2から6は、SA-β-gal染色からの代表的結果を示します。 γ-H2AXとSAHFのための染色; p16 INK4A、P21、およびp53のタンパク質レベルの評価;そしてmRNAおよび老化関連分子のタンパク質レベル。増加したSA-β-gal染色は、複製およびDNA損傷誘導性の老化で生じます。また、老化で起こる形態学的変化を観察。細胞が増殖し、線維芽細胞のスピンドル外観に比べ拡大して平坦になります。この実験的パラダイムのために、細胞を染色し、RNA /タンパク質は、IR曝露後7 Dを単離しました。より堅牢な結果は、IR暴露（ すなわち 10 d）の後に長く待つことによって発生する可能性があります。条件は各条件と実験のセットアップのために決定する必要があります。これらの結果は、代表的なものであると老化は、他の方法を用いて誘導されたときに、これらのマーカーも検出することができます。 図6は、遺伝子名が記載されているとCXCL1（GROα）、CXCL2（GROβ）、及びCSF2（GM-CSF）に対応しています。 SASP因子のいくつかのmRNAレベルのアップレギュレーション、全てではないが、WI-38細胞におけるIR誘導性の老化後に観察されました。 CDKN1A（P21をコードする）およびCDKN2A（P16 INK4Aのをコードする）を含む他の老化関連mRNAは、アップレギュレートされました。他のmRNA（EDN1とANKRD1）も含まれており、以前に15老化細胞において高いことが示されています。プライマーは、 表1に列挙されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55533/55533fig1.jpg" /> 図1：増殖し老化線維芽細胞。増殖の概略図（左）および老化（右）線維芽細胞。老化誘導物質の例には、あなたがたに示されていますLLOWボックス。老化は、示されたマーカーの高いレベルと関連しています。 SA-β-galを、老化関連βガラクトシダーゼ活性。 SASP、老化関連分泌表現型。 SAHF、老化関連ヘテロ病巣。 DDR、DNA損傷応答。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55533/55533fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55533/55533fig2.jpg" /> 図2.形態的特性と老化細胞の増加SA-β-gal活性。 WI-38細胞、 &quot;若い&quot;（PDL 27）、複製老化（PDL 40）、又は電離放射線（IR）に曝露されたもの、SA-β-gal活性について染色した増殖のいずれか。 IMR-90細胞を、いずれかの増殖 &quot;若い&quot;（PDL 30）、複製老化（PDL 52）、又は電離放射線（IR）に曝露されたもの、STAがありましたSA-β-gal活性のためのINED。セクション1 - 2複製およびDNA損傷誘導老化を誘導説明し、第3節は、SA-β-galでの染色を説明します。細胞は、IR後7 Dを染色しました。コン、コントロール。 =50μmのスケールバー。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55533/55533fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55533/55533fig3.jpg" /> 図3は、老化細胞でγ-H2AXフォーカスを増加します。 WI-38細胞、のいずれかで増殖する &quot;若い&quot;（PDL 30）または複製老化（PDL 53）は、固定および抗γ-H2AX抗体およびDAPIで染色しました。老化細胞におけるγ-H2AX病巣の数の増加に注意してください。画像は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。 Z-切片を採取し、最大強度投影は、すべてdetecを可視化するために単一の平面画像を得るために使用されましたテーブルの巣。 =20μmのスケールバー。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55533/55533fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55533/55533fig4.jpg" /> 図老化細胞におけるSAHF 4.蛍光染色。 （A）増殖中WI-38細胞（PDL 27）は、未処理又は電離放射線（IR）に曝露しました。 10日後、細胞をSAHF（IRで処理した細胞で密集/点状DAPI染色に注意）（B）IDH4は、デキサメタゾンの存在下で増殖した（増殖）または老化を誘導するためにチャコール処理FBS中の（可視化するためにDAPIで染色しました老化）。 10日後、細胞をH3K9Me2及びDAPIに対する抗体で染色しました。画像は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。 Z-切片を採取し、最大強度投影は、単一の平面を得るために使用しました。画像。老化細胞は、点状DAPI染色を有するのに対し、（A）及び（B）中の増殖細胞は、拡散DAPI染色を有します。 H3K9Me2染色はより堅牢であり、老化細胞におけるDAPI染色焦点と共局在一方、（B）において、対照細胞は、H3K9Me2ための拡散、非常に軽い染色を有します。 =20μmのスケールバー。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55533/55533fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55533/55533fig5.jpg" /> 老化関連タンパク質の図5.定量。電離放射線の10 Gyの（IR）に曝露したまたはIMR-90細胞（ - ）タンパク質は、増殖 &quot;若い&quot;（PDL 30）IMR-90細胞のいずれかから単離しました。培地は48時間毎に交換し、細胞は、IR後7 Dを溶解しました。サンプルはアンチのp16 INK4Aの antiboで免疫ブロット、SDS-PAGEにより分析しました死ぬ、そして抗p21およびその後、抗p53抗体で再プローブしました。 GAPDHをタンパク質ローディング対照として用いました。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55533/55533fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55533/55533fig6.jpg" /> 老化関連mRNAおよびSASPタンパク質の図6定量。 （ - ）電離放射線（IR）の10Gyのに曝露したまたはWI-38細胞（A）RNAのいずれか増殖&quot;若い&quot;（PDL 27又は34）WI-38細胞から単離しました。培地は48時間毎に交換し、RNAの単離は、IR後7日間行いました。 RT-QPCRは、表1に列挙された遺伝子特異的プライマーを用いて示さ老化関連mRNAのレベルを定量するために使用しました。 18Sのレベルは正規化のために使用しました。ヒストグラムは、平均正規化されたTを表します5つの独立した実験からO未処理±SEM。 （B）WI-38細胞（PDL 26）は、IRの10 Gyのに曝露しました。 10 D後、培地を無血清培地に交換した（第7節参照）。 24時間後、馴化培地を回収し、IL-6、IL-8、GROαレベルはELISAアッセイを用いて定量しました。ヒストグラムは、3回の実験からの平均±SEMを表しています。 *スチューデントのt検定によりP &lt;0.05および*** P &lt;0.001。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55533/55533fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 人間のプライマー </td><td> 前方に </td><td> 逆 </td></tr><tr><td> 18S </td><td> CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTCG </td><td> CCAATGGATCCTCGTTAAAGGATTT </td></tr><tr><td> ANKRD1 </td><td> AGT AGA GGA ACT GGT CACTGG </td><td> TGG GCT AGA AGT GTCTTC AGA T </td></tr><tr><td> CDKN1A（P21） </td><td> GAC ACCACT GGA GGG TGA CT </td><td> CAGGTC CAC ATG GTC TTC CT </td></tr><tr><td> CDKN2A（P16） </td><td> CCAACGCACCGAATAGTTACG </td><td> GCGCTGCCCATCATCATG </td></tr><tr><td> CSF2（GM-CSF） </td><td> GGCCCCTTGACCATGATG </td><td> TCTGGGTTGCACAGGAAGTTT </td></tr><tr><td> CXCL1 </td><td> GAAAGCTTGCCTCAATCCTG </td><td> CACCAGTGAGCTTCCTCCTC </td></tr><tr><td> CXCL2 </td><td> AACTGCGCTGCCAGTGCT </td><td> CCCATTCTTGAGTGTGGCTA </td></tr><tr><td> EDN1 </td><td> CAGのCAGTCTタグGCG CTG AG </td><td> ACTCTT TAT CCA TCA GGG ACG AG </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> CCGGGAACGAAAGAGAAGCT </td><td> GCGCTTGTGGAGAAGGAGTT </td></tr><tr><td> IL-7 </td><td> CTCCAGTTGCGGTCATCATG </td><td> GAGGAAGTCCAAAGATATACCTAAAAGAA </tD&gt; </tr><tr><td> IL8 </td><td> CTTTCCACCCCAAATTTATCAAAG </td><td> CAGACAGAGCTCTCTTCCATCAGA </td></tr></tbody></table> 表1： 老化関連するmRNAのためのRT-qPCRのプライマー。 RT-qPCRのは、SYBRグリーンの技術を使用するためのフォワードおよびリバースプライマーが示されています。

Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

細胞老化、細胞周期停止の不可逆的な状態は、様々な細胞ストレスによって誘導することができます。ここでは、老化のマーカーを評価するために、細胞の老化や方法を誘導するためにプロトコルを記述します。

誘導および定量化細胞老化するテクニック

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

techniques-to-induce-and-quantify-cellular-senescence

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

33.0K ビュー.  National Institute on Aging, National Institutes of Health. 細胞老化、細胞周期停止の不可逆的な状態は、様々な細胞ストレスによって誘導することができます。ここでは、老化のマーカーを評価するために、細胞の老化や方法を誘導するためにプロトコルを記述します。 

ビデオ: Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in drug screening, toxicology, and clinical assays, and is increasingly used in regenerative medicine. However, the traditional cell culture methodology   essentially consisting of the immersion of a large population of cells in a homogeneous fluid medium and on a homogeneous flat substrate   has become increasingly limiting both from a fundamental and practical perspective. Microfabrication technologies have enabled researchers to design, with micrometer control, the biochemical composition and topology of the substrate, and the medium composition, as well as the neighboring cell type in the surrounding cellular microenvironment. Additionally, microtechnology is conceptually well-suited for the development of fast, low-cost in vitro systems that allow for high-throughput culturing and analysis of cells under large numbers of conditions. In this interview, Albert Folch explains these limitations, how they can be overcome with soft lithography and microfluidics, and describes some relevant examples of research in his lab and future directions.

バイオMEMSと細胞生物学：展望と応用

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

生物学

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

発生生物学

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. Several cellular mechanisms, such as telomere shortening and abnormal expression of mitogenic oncogenes, have been shown to cause senescence. Senescence is not restricted to normal cells; cancer cells have also been reported to senesce.
	Chemotherapeutical drugs have been shown to induce senescence in cancer cells. However, it remains controversial whether senescence prevents or promotes tumorigenesis. As it might eventually be patient-specific, a rapid and sensitive method to assess senescence in cancer cell will soon be required.
	To this end, the standard &beta;-galactosidase assay, the currently used method, presents major drawbacks: it is time consuming and not sensitive. We propose here a flow cytometry-based assay to study senescence on live cells. This assay offers the advantage of being rapid, sensitive, and can be coupled to the immunolabeling of various cellular markers.

Whether senescence prevents or promotes tumorigenesis remains controversial. Since chemotherapeutical drugs can induce cancer cells to senesce, studying senescence is essential for proposing new therapies. However, the standard and broadly used &beta;-galactosidase assay presents major drawbacks. We propose here a rapid and sensitive flow cytometry-based assay to quantify senescence.

老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

医学

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

ひと初代細胞における細胞老化の誘導性

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. Recent studies have extended the role of cellular senescence to various physiological processes, including development, wound healing, immune surveillance, and age-related tissue dysfunction. Although cell cycle arrest is a critical hallmark of cellular senescence, an increased intracellular reactive oxygen species (ROS) production has also been demonstrated to play an important role in the induction of cellular senescence. In addition, recent studies revealed that senescent cells exhibit potent paracrine activities on neighboring cells and tissues through a senescence-associated secretory phenotype (SASP). The sharp increase in interest regarding therapeutic strategies against cellular senescence emphasizes the need for a precise understanding of senescence mechanisms, including intracellular ROS and the SASP. Here, we describe protocols for quantitatively assessing intracellular ROS levels during H-Ras-induced cellular senescence using ROS-sensitive fluorescent dye and flow cytometry. In addition, we introduce sensitive techniques for the analysis of the induction of mRNA expression and secretion of SASP factors. These protocols can be applied to various cellular senescence models.

Intracellular ROS has been shown to play an important role in the induction of cellular senescence. Here, we describe a sensitive assay for quantifying ROS levels during cellular senescence. We also provide protocols for assessing the senescence-associated secretory phenotype, which reportedly contributes to various age-related dysfunctions.

癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

がん研究

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge rapidly in tumor cells as a response to damage induced by various cancer treatments. Tumor cell senescence is generally considered undesirable, as senescent cells become resistant to death and block tumor remission while exacerbating tumor malignancy and treatment resistance. Therefore, the identification of senescent tumor cells is of ongoing interest to the cancer research community. Various senescence assays exist, many based on the activity of the well-known senescence marker, senescence-associated beta-galactosidase (SA-&#946;-Gal). 
Typically, the SA-&#946;-Gal assay is performed using a chromogenic substrate (X-Gal) on fixed cells, with the slow and subjective enumeration of "blue" senescent cells by light microscopy. Improved assays using cell-permeant, fluorescent SA-&#946;-Gal substrates, including C12-FDG (green) and DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), have enabled the analysis of living cells and allowed the use of high-throughput fluorescent analysis platforms, including flow cytometers. C12-FDG is a well-documented probe for SA-&#946;-Gal, but its green fluorescent emission overlaps with intrinsic cellular autofluorescence (AF) that arises during senescence due to the accumulation of lipofuscin aggregates. By utilizing the far-red SA-&#946;-Gal probe DDAOG, green cellular autofluorescence can be used as a secondary parameter to confirm senescence, adding reliability to the assay. The remaining fluorescence channels can be used for cell viability staining or optional fluorescent immunolabeling.
Using flow cytometry, we demonstrate the use of DDAOG and lipofuscin autofluorescence as a dual-parameter assay for the identification of senescent tumor cells. Quantitation of the percentage of viable senescent cells is performed. If desired, an optional immunolabeling step may be included to evaluate cell surface antigens of interest. Identified senescent cells can also be flow cytometrically sorted and collected for downstream analysis. Collected senescent cells can be immediately lysed (e.g., for immunoassays or 'omics analysis) or further cultured.

A protocol for fluorescent, flow cytometric quantification of senescent cancer cells induced by chemotherapy drugs in cell culture or in murine tumor models is presented. Optional procedures include co-immunostaining, sample fixation to facilitate large batch or time point analysis, and the enrichment of viable senescent cells by flow cytometric sorting.

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

代謝標識および質量分析による老化および非分裂培養細胞におけるタンパク質代謝回転率の測定

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

生化学

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometry-Based Quantification of Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Source: Flor, A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64176">Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video illustrates a flow cytometry-based assay for quantifying therapy-induced senescent cancer cells with dual senescence markers. The detection and quantification of senescent cells involve using a &#946;-galactosidase substrate. The substrate is cleaved by active lysosomal &#946;-galactosidase within the senescent cells, producing a fluorescent product that, in conjunction with autofluorescent lipofuscin granules, marks the senescent cancer cells.

フローサイトメトリーによる治療誘発性老化がん細胞の定量化

1. Induction of senescence by chemotherapy drugs in cultured cancer cells
NOTE: All cell manipulation steps in this section should be performed in a ...