Name: biophysical characterization of flagellar motor functions
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
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The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&amp;M Engineering Experiment Station for funds.

1.細胞の調製<ol><li> 10mLの新鮮なTBで1：100希釈で接種続いトリプトンブロス（TB、1％ペプトン、0.5％のNaCl）にアレル15,22スティッキーFLICを運ぶ目的の株の一晩培養を成長させます。 OD 600 = 0.5になるまで振とうインキュベーター内で33℃で培養物を成長させます。 </li><li> 1,500×gで細胞をペレット5から7分と再分散ペレット積極的に濾過滅菌運動性バッファー10mL中（メガバイトを、10 mMリン酸バッファー：0.05から0.06 MのNaCl、10 -4 M EDTA、1μMメチオニン、 pHは7.0）。 </li><li>繰り返しステップ1.2をさらに2回と1 mLのMBで最終ペレットを再分散させます。 </li><li> （ - 長さ12cm、0.58ミリメートル、内径7）ポリエチレン管で接続された21〜23ゲージアダプタで2つのシリンジの間で前後〜75回通過させることにより、懸濁液を剪断。 45秒 - 30にせん断の合計時間を制限します。 </li><li> 5-7分間1500×gで剪断した細胞を遠心分離し、再分散MBの500μL - 100でペレット。 </li></ol> 2.スライドの準備<ol><li>カバースリップと顕微鏡スライドとの間に2つの両面テープを挟んで撮像チャンバーを準備します。走化性アッセイのために、MBおよび化学的刺激剤の交換を可能にする任意のマイクロ流体チャンバーを採用。 </li><li>チャンバー内に0.01％ポリ-L-リジンのソリューションを追加し、5分後に静かにMBで表面を洗い流し（80から100μL）。 </li><li>チャンバー内に細胞懸濁液40μLを追加し、ガラス面への取り付けのための十分な時間を許可（7から8分）。反対側から濾紙で溶液をウィッキングながら、チャンバの一方の側に100μLMBを追加することによって、剥がれた細胞を流出します。 </li><li>チャンバー内にラテックスビーズの15μL、ビーズに落ち着くと細胞に付着するのに十分な時間を許可 - 10を追加します（7から8分）。静かにバラバラビーズを除去するために、ステップ2.3で説明したように、MBの100μLですすいでください。ビーズ-SIの範囲を使用します良好なコントラストが利用可能である限り、実験のためのZES。 </li></ol> 3.ビーズの追跡<ol><li>顕微鏡ステージ上にサンプルを置き、モータに取り付けられたビーズのための表面をスキャンします。位相差顕微鏡が必要ではないが観測を行うために40X位相目標を使用します。また、あまりにも長い間、十分なコントラストがはっきりと暗い背景に明るいビーズを区別するために維持されているように明視野イメージングを採用しています。 </li><li>ビーズが選択されると、 図1Bに示すように、予め定められた隅にビードを配置するために横方向にステージを移動させます。同コーナーで位置ビーズは、ビーズの回転方向が正しく知られていることを確認します。理想的なビーズの軌道はほぼ円形であるが、楕円形の軌道が許容されています。 </li><li>エイリアシングに関連するエラーを回避するために、モータの二倍回転周波数よりも高いサンプリング周波数を維持します。本研究では、で回転されたモーターを使用10倍（500 Hz）であった周波数で50Hzのサンプルは、滑らかな信号を得ることができます。 </li></ol> 4.データ解析<ol><li> 23を必要に応じて、センターでは、アフィン変換と軌道におけるPMTの出力電圧と、正しい楕円率をスケールと。回転速度17を決定するために、パワースペクトル解析を使用してください。 </li><li>極角、θ（トン）= ATAN（Y（t）を/ x（t）を）決定します。モータ速度の変化を決定し、ωを算出することにより、時間を切り替えます<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14。 </li><li>モータ速度データを平滑化するためにメディアンフィルタを用います。 2回転以上のフィルタウィンドウは23,24を推奨します。 </li></ol>

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	<li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli.">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li><li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract.">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li><li>Kao, C. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor.">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

係留ビーズの追跡とモータトルクの正確な推定を容易にするために、以下の情報を見直すべきです。鞭毛細胞でこれらの測定を行う場合、剪断は重要なステップです。シャーリングにより、モータ上の粘性負荷が主にビーズによるものであり、10％の誤差16内に推定することができることを確認して、単なるスタブにべん毛フィラメントを低減します。シャーリングもしっかりと分散型偏心（&lt;ビーズ直径14）の円形軌道を見つける可能性を向上させます。不適切なせん断追跡で、粘性の薬物の計算に誤りを化合物わがままな軌道での結果、ならびに劣悪な信号対雑音比が得られます。オシロスコープの使用は、このようなデータの迅速な排除を可能にします。鞭毛フィラメントの生体力学的特性は、種に応じて変化することが予想されるので、剪断法は、おそらくTに十分な剪断を確実にするために適合させる必要があります彼目的の細菌。剪断に関連するエラーを減少させる効果的な方法は、フィラメントのタンパク質をコードする遺伝子を欠く細胞で機能することです。プローブビーズを、次いで、抗フック抗体を介してフックに直接取り付けることができます。 適切に繋がれているビーズを見つけることが困難な場合があります。視野内のほとんどのビーズが細胞体やガラスの表面に付着されるいずれかのためです。このようなビーズは容易に鮮明にすることができます。他のビーズは、（1.5&gt; - 2倍ビーズ径）振動や大きな振幅や大きな離心率と目に見えて回転して表示されます。これらは、典型的には、完全に剪断さや焦点面に傾斜した平面内で回転されていないフィラメントを鞭毛に繋留されています。このようなビーズのサンプリングは、典型的には、より高いノイズになり、粘性負荷の時間変動は、与えられたビーズサイズのためのモータトルクの過小評価になることがあります。テザービーズの小部分がランダム受けますモーション;これらは、単にブラウン回転を受けています。ビーズの割合はぼやけ表示され、簡単にフォーカスに持ち込むことはできません。これらは、適切につながれ、関心のモータでされているモータである可能性が最も高いです。 ここで説明したものなどを追跡する単一のモータの制限の中でハイスループット実験を行うことができないことです。その画像高速度カメラは、関心の大きな領域は、この点において有利であり得ます。その他の制限は、光電子増倍管の視野内に近接した回転ビーズから生じる複数の信号に関連するエラーが含まれます。最後に、2光電子増倍管のスリットに対する記録ビーズの正しい位置の決意の誤差がスイッチングダイナミクスの不正確な推定になります。 ここで説明するセットアップの利点は、長時間にわたって、リアルタイムでビーズの回転を追跡する能力が含まれます。このエラーが発生しやすい軌道の急速な排除、超高速カメラで達成することは多分難しいものを可能にします。さらに、いくつかの変更でこのセットアップは、様々な刺激に細胞をさらすように設計されたアッセイと統合することができます。 26冷却熱と組み合わされ、この技術は、熱的刺激に対する個々のモータの応答を測定するために使用することができます。最近6行われているように、光ピンセットとの統合は、機械的刺激に応答して、個々のモータのリモデリングの測定を可能にすることができます。最後に、化学的刺激に対するモータの適応は、適切な灌流チャンバーを使用して測定し、11をポンプすることができます。 既知の細菌種の大部分は、運動性および鞭毛媒介運動性は、自然の中で支配的です。ここで実証された方法は、構造的リモデリングおよびo適応性への洞察の開発を支援し続けることが期待されていますべん毛モーターF。

べん毛モーターは、らせん状の細胞外フィラメントを回転させることで泳ぐために細胞を可能にします。モーターは、鞭毛（ すなわち 、粘性負荷）の所定の長さのために生成することができるトルクの量は、遊泳速度を決定します。一方、回転方向を切り替える能力は、化学物質、走化性として知られるプロセスに応じて細胞移動を制御します。走化性及び運動性ある毒性が1-3因子 、鞭毛モーターは年4上で十分に特徴づけされています。証拠は今、モータがメカノとして作用することを示唆している-それは機械的に固体基板5,6の存在を検出します。この能力は、おそらく表面のコロニー形成および感染症5,7を誘発するのに役立ちます。その結果、モータが表面を検知し、シグナル伝達を開始させるメカニズムが有意8,9です。 べん毛モーターは容易にflagellを係留することによって研究することができますumの基板へとセルの回転を観察します。このようなテザリングは、最初の10の抗フック抗体を用いてガラス基板に大腸菌 、正常に取り付けられたフックにpolyhook変異体で働いていたシルバーとサイモン、によって達成されました。係留細胞アッセイは、化学的刺激の様々なモーター・スイッチの応答を研究する研究者を可能にしました。例えば、セガルおよび共同研究者は、化学的イオン導入ピペットを用いてテザー細胞を刺激しました。 CW バイアスの対応する変化（モータは、CWを時計回りに回す時間の割合）は、走化性ネットワーク11,12に適応の動態を測定するためにそれらを可能にしました。係留細胞アッセイは、スイッチの応答を研究する上で有効であったが、唯一の粘性負荷13の限られた範囲にわたって運動力学への洞察を提供することができました。この問題を克服するために、リュおよび共同研究者は、表面に付着した細胞上のフィラメントスタブに球状、ラテックスビーズを係留しました。ビーズがありましたその後、弱い光トラップ14で逆焦点干渉計を使用して追跡。異なるサイズのビーズと協力して、研究者は、負荷のより広い範囲に渡ってモーターを学ぶことができます。このアッセイは、後にレーザー暗視野照明と組み合わせた光電子増倍管ベースのビーズ追跡技術を開発した元とベルク、改善されました。彼らの方法は、外部の粘性抵抗が回転15,16の内部の粘性抵抗に比べて低かったこと（〜60 nm）のように小さなました係留金ナノビーズの追跡を可能にしました。これは、 大腸菌 （〜300ヘルツ）で達成可能な最大速度の測定値につながりました。 V.のalginolyticusでは、同様のビーズアッセイは、中間粘性負荷（〜700 Hz）で17で回転速度の測定を可能にしました。 （無負荷から近いストールに）粘性負荷の全体の可能な範囲での運動反応の測定を可能にすることにより、ビーズアッセイは、トンを理解するための重要な生物物理学的なツールを提供しました可トルク世代のプロセス18,19。 最近、我々は個々のモータ6に精密な機械的刺激を適用することができた光ピンセットを含むように元-Bergのアッセイを修正しました。それらは粘性負荷の変化に応じて改造 - この手法を用いて、モータの回転力発生器が動的mechanosensorsであることを示しました。メカニズムは不明のままであるが、このような負荷感知群がっ細菌への細胞の分化をトリガすることが可能です。直接的な証拠が不足しているものの、他の種におけるべん毛モーターは、また20機械受容していることもありそうです。ここでは、鞭毛フィラメント15につながラテックスビーズの回転を追跡するための光電子増倍管ベース（PMT）のアプローチを議論します。リアルタイムでかつ長期硬膜の上に単一のビーズを追跡することは比較的簡単であるため、超高速カメラで追跡と比較して、光電子増倍管、セットアップが有利です。ション。環境刺激21にべん毛モーター複合体で長時間の再構築を検討する場合に特に便利です。具体的には、大腸菌のための我々詳細プロトコルが、それらは、容易に他の種における鞭毛モーターを研究するために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1 mL Luer Slip Tip Syringe</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>Photomultiplier Tubes</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,&amp;nbsp; 0.78 ns response time&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 x 1 mm precision slits</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8 Pole LP/HP Filter</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot microscope</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used.&lt;br/&gt; https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Cube Beamsplitter</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

biophysical characterization of flagellar motor functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

光電子増倍管のセットアップは図1Aに示されています。光電子増倍管は、関心のビーズによって散乱波長範囲にわたって高い感度を有することが重要です。ここで用いられる光電子増倍管は、可視及び近赤外範囲で動作し、ハロゲン光源によって照明ビードによって散乱された光を検出することができました。最適な照明条件や電源電圧が1セットアップから別のものに変化します。この作業で使用されたセットアップのために、PMTゲイン〜4月10日から5月10日までで十分証明しました。各光電子増倍管は、光電子増倍管の前に配置3×1ミリメートルスリットを除いて覆った。スリットは、光が光電子増倍管に入ることができ、そこから細胞サンプル領域を制限し、2つのスリットは、互いに直交しています。回転ビードが正しい位置（ 図1B）に位置するとき、光電子増倍増加に入射する光の量は、ビーズが来るようにビューでその円形経路は、ビューからそれを奪うように減少します。正弦PMT電圧出力の周波数は、回転速度を示し、2つの信号の位相差は回転方向を示しています。 PMTの出力を表示するには、オシロスコープを使用することは、リアルタイムでビーズ軌道の可視化を可能にします。 代表的なモータからの時間変化するPMT信号、Y（t）とx（t）が、 図2Aに示されています。 2つのスリットの直交性は、2つの信号間の位相遅れを導入しています。信号振幅は、信号対雑音比、並びに回転の偏心に依存します。ビーズの対応する軌道は、図2Bに示されています。 崔代表モータからの測定速度のヒストグラムは-削除された株は、 図3Aに示されています</strong&gt;。削除は鞭毛モーターはスイッチと排他的に反時計回り（CCW）に回転することができないことを保証します。この特定のモータからの平均速度は60Hzであったと測定速度は1μmのビーズ25とテザーモータの以前の報告と一致しています。 図1Bに概略的に示されるように、ビーズは、まず、右下隅に配置しました。対応する角速度は、 図3B（上のパネル）に示されています。隣接左下隅にビーズを配置することは、モータ速度サインオン（下のパネル）の反転が生じました。このように、隣接するコーナーにビーズを移動するモータ回転の観察方向を変更します。この点で、対角は同一です。正確にスイッチング動態を決定するために測定中のビーズの位置を知ることが重要です。 図3Cは、2つの回転方向間に野生型モータの繰り返し遷移を示しています。 <html>データ収集ソフトウェアのカスタムコードは、コンピュータ15にデータを記録する前の作業から適合させました。 PMTの出力は、AC結合された低域が100Hzのカットオフ周波数を用いて濾過しました。リアルタイム追跡は、オシロスコープにフィルタの出力を接続することで有効になっていました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig1.jpg" /> 図1： ビーズ・トラッカーのセットアップ。 PMTベースのトラッキング設定のA）概略図。二つの直交するスリットからの相対ビーズ（黒球）のB）理想的な位置。軌道は点線で示されています。離心率eは、点線円の半径です。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55240/55240fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ove_content「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig2.jpg" /> 図2：PMT 出力します。 A）ローパスセンタリング/スケーリングした後、2光電子増倍管からの出力を濾過しました。 B）3の上にサンプリングPMTデータから得られたビーズの軌跡。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55240/55240fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig3.jpg" /> 図3： ビーズ軌跡。 A）代表的なモータのCCW-速度のみのヒストグラム。 B）右下（上部パネル）で撮像されたCCW専用モータの回転速度。左下隅（下のパネル）に位置する同一のモータの回転速度。 C） </strong&gt;の代表的な野生型モータに切り替えます。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55240/55240fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K ビュー.  Texas A&M University. Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

ビデオ: Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

生化学

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic properties are adapted for the particular function they execute in cells. Myosin 5a processively walks on F-actin to transport melanosomes and vesicles in cells. Conversely, nonmuscle myosin 2b operates as a bipolar filament containing approximately 30 molecules. It moves F-actin of opposite polarity toward the center of the filament, where the myosin molecules work asynchronously to bind actin, impart a power stroke, and dissociate before repeating the cycle. Nonmuscle myosin 2b, along with its other nonmuscle myosin 2 isoforms, has roles that include&#160;cell adhesion, cytokinesis, and tension maintenance. The mechanochemistry of myosins can be studied by performing in vitro motility assays using purified proteins. In the gliding actin filament assay, the myosins are bound to a microscope coverslip surface and translocate fluorescently labeled F-actin, which can be tracked. In the single molecule/ensemble motility assay, however, F-actin is bound to a coverslip and the movement of fluorescently labeled myosin molecules on the F-actin is observed. In this report, the purification of recombinant myosin 5a from Sf9 cells using affinity chromatography is outlined. Following this, we outline two fluorescence microscopy-based assays: the gliding actin filament assay and the inverted motility assay. From these assays, parameters such as actin translocation velocities and single molecule run lengths and velocities can be extracted using the image analysis software. These techniques can also be applied to study the movement of single filaments of the nonmuscle myosin 2 isoforms, discussed herein in the context of nonmuscle myosin 2b. This workflow represents a protocol and a set of quantitative tools that can be used to study the single molecule and ensemble dynamics of nonmuscle myosins.

Presented here is a procedure to express and purify myosin 5a followed by a discussion of its characterization, using both ensemble and single molecule in vitro fluorescence microscopy-based assays, and how these methods can be modified for the characterization of nonmuscle myosin 2b.

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

神経科学

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle contraction. To understand their force-generating mechanisms, myosin II has been investigated both at the single-molecule (SM) level and as teams of motors in vitro using biophysical methods such as optical trapping.
These studies showed that myosin force-generating behavior can differ greatly when moving from the single-molecule level in a three-bead arrangement to groups of motors working together on a rigid bead or coverslip surface in a gliding arrangement. However, these assay constructions do not permit evaluating the group dynamics of myosin within viscoelastic structural hierarchy as they would within a cell. We have developed a method using optical tweezers to investigate the mechanics of force generation by myosin ensembles interacting with multiple actin filaments.
These actomyosin bundles facilitate investigation in a hierarchical and compliant environment that captures motor communication and ensemble force output. The customizable nature of the assay allows for altering experimental conditions to understand how modifications to the myosin ensemble, actin filament bundle, or the surrounding environment result in differing force outputs.

Formation of actomyosin bundles in vitro and measuring myosin ensemble force generation using optical tweezers is presented and discussed.

光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

生物工学

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

免疫・感染学

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

生物学

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of both conventional and unconventional myosins under load with unprecedented time resolution. In particular, the possibility to probe myosin motors under constant force right after the actin-myosin bond formation, together with the high rate of the force feedback (200 kHz), has shown UFFCS to be a valuable tool to study the load dependence of fast dynamics such as the myosin working stroke. Moreover, UFFCS enables the study of how processive and non-processive myosin-actin interactions are influenced by the intensity and direction of the applied force.
By following this protocol, it will be possible to perform ultrafast force-clamp experiments on processive myosin-5 motors and on a variety of unconventional myosins. By some adjustments, the protocol could also be easily extended to the study of other classes of processive motors such as kinesins and dyneins. The protocol includes all the necessary steps, from the setup of the experimental apparatus to sample preparation, calibration procedures, data acquisition and analysis.

Presented here is a comprehensive protocol to perform ultrafast force-clamp experiments on processive myosin-5 motors, which could be easily extended to the study of other classes of processive motors. The protocol details all the necessary steps, from the setup of the experimental apparatus to sample preparation, data acquisition and analysis.

超高速フォースクランプ分光法によるミオシンのメカノ酵素的性質の解剖

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

要約

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単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査

超高速フォースクランプ分光法によるミオシンのメカノ酵素的性質の解剖

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

要約

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単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

超高速フォースクランプ分光法によるミオシンのメカノ酵素的性質の解剖

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査