The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&amp;M Engineering Experiment Station for funds.

1. Preparazione delle cellule <ol><li> Grow culture durante la notte del ceppo desiderato portando il appiccicoso flic allele 15,22 a triptone Broth (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) seguita da inoculo in diluizione 1: 100 in 10 ml TB fresco. Crescere la coltura a 33 ° C in un incubatore shaker fino OD 600 = 0.5. </li><li> Agglomerare le cellule a 1500 xg per 5 - 7 min e ri-disperdere il pellet vigorosamente in 10 mL di tampone di filtro sterilizzato motilità (MB; 10 mM tampone fosfato: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 mM metionina, pH 7,0). </li><li> Ripetere il punto 1.2 altre due volte e ri-disperdere il pellet finale in 1 ml MB. </li><li> Tosare la sospensione passando avanti e indietro ~ 75 volte tra due siringhe con 21 a 23 adattatori calibro connesso con un tubo in polietilene (7 - 12 cm di lunghezza, diametro 0,58 mm interno). Limitare il tempo totale di taglio a 30 - 45 s. </li><li> Centrifugare le cellule tranciate a 1.500 xg per 5-7 minuti e ri-disperdere lapellet in 100 - 500 ml di MB. </li></ol> 2. Far scorrere Preparazione <ol><li> Preparare una camera di imaging da sandwich due nastri adesivi doppia faccia tra una copertura antiscivolo e un vetrino da microscopio. Per i saggi di chemiotassi, impiegare qualsiasi camera di microfluidica che consente lo scambio di MB e stimolanti chimici. </li><li> Aggiungere 0,01% soluzione di poli-L-lisina nella camera e dopo 5 min risciacquare delicatamente le superfici con MB (80 - 100 l). </li><li> Aggiungere 40 ml di sospensione cellulare nella camera e consentire un tempo sufficiente per il fissaggio alla superficie di vetro (7 - 8 min). Defluire cellule scollate aggiungendo 100 microlitri MB su un lato della camera, mentre traspirante la soluzione con un filtro di carta dal lato opposto. </li><li> Aggiungere 10 - 15 ml di perle di lattice nella camera e consentire le perle tempo sufficiente per risolvere e allegare alle cellule (7-8 min). Lavare delicatamente con 100 ml di MB, come descritto al punto 2.3, per rimuovere scollarsi perline. Utilizzare un intervallo di bead-SIzes per gli esperimenti così a lungo come un buon contrasto è disponibile. </li></ol> 3. Monitoraggio Bead <ol><li> Posizionare il campione su un palco microscopio e la scansione della superficie per perline attaccate ai motori. Utilizzare un obiettivo 40X fase per fare osservazioni anche se la microscopia di fase non è necessario. In alternativa, utilizzare l&#39;imaging in campo chiaro fino a quando un sufficiente contrasto è mantenuto per distinguere chiaramente una perlina luminoso su uno sfondo scuro. </li><li> Una volta selezionato un tallone, spostare la fase lateralmente per posizionare il tallone in un angolo predeterminato, come mostrato in Figura 1B. perline posizione alla stessa corner per garantire che il senso di rotazione del tallone è correttamente noto. Il tallone traiettoria ideale è approssimativamente circolare, ma ellittica traiettorie sono ricevibili. </li><li> Mantenere la frequenza di campionamento superiore al doppio della frequenza di rotazione del motore per evitare errori associati aliasing. In questo lavoro, utilizzare un motore che ruotava a50 Hz e il campione a frequenze che erano 10 volte superiore (500 Hz), per ottenere un segnale liscia. </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Centro e scalare le tensioni di uscita PMT e corretta ellitticità nelle traiettorie con trasformazioni affini, se necessario 23. Utilizzare l&#39;analisi di potenza spettro per determinare i tassi di rotazione 17. </li><li> Determinare angoli polari, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Determinare le variazioni di velocità del motore e la commutazione nel tempo calcolando ω <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li> Impiegare un filtro mediano per lisciare i dati di velocità del motore. Una finestra di filtro più di due giri completi si raccomanda 23,24. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor.">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Al fine di facilitare tethered tallone-tracking e stima corretta del motore coppie, le seguenti informazioni dovrebbe essere rivisto. Quando si eseguono queste misure con cellule flagellate, tosatura è un passaggio fondamentale. Shearing riduce la flagellar filamento ad un semplice stub, garantendo così che il carico sul motore viscosa è prevalentemente dovuta al tallone e può essere stimato entro l&#39;errore 10% 16. Shearing migliora anche la possibilità di trovare le traiettorie circolari con eccentricità strettamente distribuiti (&lt;diametro tallone 14). Risultati tranciatura improprie in traiettorie ostinati, quali composti errori nel monitoraggio e nel calcolo delle boccate viscosi, nonché con conseguente scarsa rapporto segnale-rumore. L&#39;uso di un oscilloscopio permette una rapida eliminazione di tali dati. Dal momento che le proprietà biomeccaniche di filamenti flagellari potranno variare con specie, sarà probabilmente necessario adattare i metodi di taglio al fine di garantire un adeguato taglio in tegli batteri di interesse. Un modo efficace per ridurre gli errori associati alla tosatura è quello di lavorare con le cellule che mancano i geni che codificano le proteine ​​del filamento. perline sonda può poi essere collegato direttamente al gancio tramite anticorpi anti-gancio. Trovare un cordolo che viene opportunamente legato può essere impegnativo. Questo è perché la maggior parte perline nel campo visivo sarà o essere bloccato ai corpi cellulari o la superficie del vetro. Tali sfere possono essere facilmente portati a fuoco. Altre perle appariranno a vibrare o ruotare visibilmente con grandi ampiezze o grandi eccentricità (&gt; 1,5 - diametro 2x tallone). Questi sono tipicamente legato a flagellare filamenti che non sono stati completamente tranciati o ruotare in un piano inclinato rispetto al piano focale. Il campionamento di tali perle in genere causare rumore più elevato, e di tempo variazioni di carichi viscosi può comportare una sottostima di motori coppie per una data tallone-size. Una piccola frazione di perline frenati subirà casualemovimento; Questi sono solo in fase di rotazione browniano. Una frazione dei branelli apparirà sfocato e non possono essere portati a fuoco facilmente. Questi sono più probabilità di essere i motori che sono stati impastoiati in modo appropriato e sono i motori di interesse. Tra i limiti del monomotore monitoraggio come quello descritto qui è l&#39;incapacità di condurre esperimenti high throughput. Una telecamera ad alta velocità che immagini una regione più grande di interesse può essere vantaggioso in questo senso. Altre limitazioni sono errori associati con più segnali derivanti da perline rotanti strettamente distanziati nel campo di vista dei PMT. Infine, errori nella determinazione della corretta posizione del tallone registrato rispetto ai due fenditure fotomoltiplicatori comporterà stima imprecisa della dinamica di commutazione. Vantaggi della configurazione descritta qui includono la possibilità di monitorare la rotazione delle sfere su lunghe durate e in tempo reale. Questopermette la rapida eliminazione delle traiettorie soggette a errori, cosa che forse difficile da raggiungere con le fotocamere ultraveloci. Inoltre, con alcune modifiche questa configurazione può essere integrato con saggi intese a sottoporre le cellule ad una varietà di stimoli. Combinato con raffreddamento termoelettrico 26, la tecnica può essere utilizzata per misurare le risposte dei singoli motori a stimoli termici. Integrazione con pinzette ottiche può attivare le misurazioni di rimodellamento dei singoli motori in risposta a stimoli meccanici, come è stato fatto recentemente 6. Infine, l&#39;adattamento del motore stimolanti chimici può essere misurata con l&#39;uso di una camera di perfusione adeguata e pompe 11. La maggior parte delle specie batteriche conosciute sono mobili e flagellare mediata motilità è predominante in natura. I metodi dimostrato qui si prevede di continuare a contribuire allo sviluppo di intuizioni strutturali-rimodellamento e l&#39;adattabilità of il motore flagellare.

I motori flagellare consentono alle cellule di nuotare ruotando filamenti extracellulari elicoidali. La quantità di coppia del motore può generare per una data lunghezza del flagello (cioè, il carico viscoso) determina le velocità di nuoto. D&#39;altro canto, la capacità di cambiare la direzione di rotazione controlla migrazione delle cellule in risposta ad agenti chimici, un processo noto come chemiotassi. Chemiotassi e la motilità di essere fattori di virulenza 1-3, motori flagellare sono stati ben caratterizzati nel corso degli anni 4. Prove di montaggio ora suggerisce che il motore funge mechanosensor - rileva meccanicamente la presenza di substrati solidi 5,6. Questa capacità aiuta probabilmente a scatenare la colonizzazione della superficie e le infezioni 5,7. Di conseguenza, i meccanismi per cui il motore individua automaticamente superfici e iniziati segnalazione sono di importanza 8,9. Il motore flagellare può essere facilmente studiato da legare il flagellum ad un substrato e osservando la rotazione cellulare. Tale tethering è stato raggiunto prima da Silverman e Simon, che lavorava con un mutante polyhook in E. coli e ganci fissati con successo per substrati di vetro con anticorpi anti-gancio 10. Il test legato celle consentito ai ricercatori di studiare le risposte del motore interruttore ad una varietà di stimoli chimici. Ad esempio, Segall e collaboratori stimolati chimicamente le cellule in collegamento, con l&#39;ausilio di pipette iontoforesi. I cambiamenti corrispondenti pregiudizi CW (la frazione dei motori tempo di rotazione in senso orario, CW) ha permesso loro di misurare le cinetiche di adattamento della rete chemiotassi 11,12. Mentre il test delle cellule legato è stato efficace nello studio delle risposte degli interruttori, è stato solo in grado di offrire intuizioni meccanica del motore su una gamma limitata di carichi viscosi 13. Per superare questo problema, Ryu e collaboratori impastoiati sferiche, sfere di lattice a filamento stub su cellule attaccate alle superfici. Le perle sono statipoi monitorati tramite interferometria back-focale con trappole ottiche deboli 14. Lavorando con perline di diverse dimensioni, i ricercatori possono studiare il motore su una gamma più ampia di carichi. Questo test è stato poi migliorato da Yuan e Berg, che ha sviluppato una tecnica di tallone-tracking fotomoltiplicatore a base combinata con illuminazione laser in campo scuro. Il loro metodo attivato il monitoraggio di nanobeads frenati d&#39;oro che erano così piccola (~ 60 nm) che le resistenze viscose esterni sono stati inferiori rispetto alle resistenze viscose interne a rotazione 15,16. Ciò ha portato alle misure delle velocità massime ottenibili in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, simili saggi di perline attivate misure dei tassi di filatura a carichi intermedi viscosi (~ 700 Hz) 17. Consentendo misurazioni di risposte motorie sull&#39;intera gamma possibile di carichi viscosi (da zero-carico quasi stallo), le perline-saggi fornito un importante strumento biofisico per comprendere il tprocesso orque generazione 18,19. Recentemente, abbiamo modificato il dosaggio Yuan-Berg per includere pinzette ottiche che ci hanno permesso di applicare stimoli meccanici precisi per singoli motori 6. Usando questa tecnica, abbiamo dimostrato che la forza-generatori che ruotano il motore sono meccanosensori dinamici - si rimodellare in risposta ai cambiamenti di carichi viscosi. È possibile che tale load sensing innesca differenziazione cellulare nei batteri brulicanti, sebbene i meccanismi rimangono poco chiari. E &#39;anche probabile che i motori flagellare in altre specie sono anche meccanosensibili 20, anche se la prova diretta è carente. Qui, si discute l&#39;approccio fotomoltiplicatore-based (PMT) per il monitoraggio della rotazione delle sfere di lattice impastoiati ai filamenti flagellari 15. Rispetto al monitoraggio con telecamere ultraveloci, il fotomoltiplicatore-setup è vantaggioso perché è relativamente semplice per tenere traccia delle singole perle in tempo reale e più a lungo durazioni. E &#39;particolarmente utile quando si studia a lungo tempo rimodellamento in complessi a motore flagellare a causa di stimoli ambientali 21. Anche se abbiamo protocolli dettaglio specifico per E. coli, che possono essere facilmente adattati per lo studio di motori flagellare in altre specie.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1 mL Luer Slip Tip Syringe</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>Photomultiplier Tubes</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,&amp;nbsp; 0.78 ns response time&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 x 1 mm precision slits</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8 Pole LP/HP Filter</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot microscope</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used.&lt;br/&gt; https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Cube Beamsplitter</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

biophysical characterization of flagellar motor functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

La configurazione fotomoltiplicatore è mostrato nella Figura 1A. È importante che i PMT hanno alte sensibilità nel range di lunghezze d&#39;onda sparse dalle perline di interesse. Le PMT impiegati qui operano nelle gamme visibile e vicino infrarosso, e sono stati in grado di rilevare la luce diffusa dalla perle illuminate da una sorgente di luce alogena. Le condizioni di luce ottimali e tensioni di alimentazione variano da una configurazione all&#39;altra. Per la configurazione utilizzata in questo lavoro, un guadagno di PMT ~ 10 aprile - 10 maggio si è rivelata adeguata. Ogni fotomoltiplicatore è stato coperto tranne una fessura 3 x 1 mm posizionato davanti al fotomoltiplicatore. Le fessure limitano regione nella cella campione da cui la luce può entrare fotomoltiplicatori, e le due fenditure sono ortogonali tra loro. Quando una perlina rotante è posizionato nella posizione corretta (Figura 1B), la quantità di luce che entra aumenti fotomoltiplicatori come il tallone vienenella vista e diminuisce come percorso circolare prende lontano dalla vista. Le frequenze delle uscite sinusoidali di tensione PMT indicano la velocità di rotazione e le differenze di fase tra i due segnali indicano il senso di rotazione. L&#39;uso di un oscilloscopio per visualizzare i risultati PMT consente la visualizzazione delle traiettorie tallone in tempo reale. I segnali PMT tempo-varianti, y (t) e x (t), da un motore rappresentante sono mostrati nella Figura 2A. L&#39;ortogonalità dei due fenditure introduce un ritardo di fase tra i due segnali. Le ampiezze dei segnali dipende dal rapporto segnale-rumore e l&#39;eccentricità di rotazione. Le corrispondenti traiettorie del tallone sono indicati nella Figura 2B. Un istogramma delle velocità misurate da un motore rappresentativo in uno Chey - ceppo soppresso è mostrato in Figura 3A </strong&gt;. La cancellazione assicura che i motori flagellare non possono cambiare e ruotare esclusivamente in senso antiorario (CCW). La velocità media di questo particolare motore era di 60 Hz e le velocità misurate sono coerenti con precedenti relazioni per motori in collegamento, con 1 micron perline 25. Il tallone è stato posizionato nell&#39;angolo inferiore destro, come visto nello schema in Figura 1B. La corrispondente velocità angolare è mostrato nella Figura 3B (pannello superiore). Posizionando il tallone verso l&#39;angolo inferiore sinistro adiacente ha provocato l&#39;inversione del segno sulle velocità del motore (pannello inferiore). Quindi, muovendo il tallone a un angolo adiacente cambierà la direzione osservata di rotazione del motore. A questo proposito, angoli diagonalmente opposti sono identici. È pertanto fondamentale conoscere la posizione del tallone durante le misurazioni per determinare correttamente le dinamiche di commutazione. Figura 3C mostra ripetuti passaggi di un motore wild-type tra i due sensi di rotazione. <html> Codici personalizzati per il software di acquisizione dati sono stati adattati dal lavoro prima di registrare i dati su un computer 15. L&#39;uscita PMT è accoppiato in AC e filtro passa-basso con frequenza di taglio di 100 Hz. il monitoraggio in tempo reale è stato attivato collegando le uscite filtrate a un oscilloscopio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig1.jpg" /> Figura 1: Impostazione Bead-tracker. A) Schema di impostazione del monitoraggio PMT-based. B) La posizione ideale del tallone (sfera nera) rispetto ai due fessure ortogonali. La traiettoria è indicata dalle linee tratteggiate. L&#39;eccentricità e è il raggio del cerchio tratteggiato. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55240/55240fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig2.jpg" /> Figura 2: PMT uscite. A) passa-basso uscite filtrato dai due fotomoltiplicatori, dopo il centraggio / ridimensionamento. B) Le traiettorie tallone ottenuti dai dati PMT, campionati più di 3 s. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55240/55240fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig3.jpg" /> Figura 3: Traiettorie tallone. A) Istogramma di velocità CCW solo di un motore rappresentativo. B) velocità di rotazione di un motore CCW solo ripreso in basso a destra (pannello superiore). velocità di rotazione dello stesso motore quando posizionati in basso a sinistra (pannello inferiore). C) </strong&gt; di commutazione in un motore rappresentante wild-type. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55240/55240fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

biophysical-characterization-of-flagellar-motor-functions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  Texas A&M University. Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

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Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Ricerca

Biochimica

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic properties are adapted for the particular function they execute in cells. Myosin 5a processively walks on F-actin to transport melanosomes and vesicles in cells. Conversely, nonmuscle myosin 2b operates as a bipolar filament containing approximately 30 molecules. It moves F-actin of opposite polarity toward the center of the filament, where the myosin molecules work asynchronously to bind actin, impart a power stroke, and dissociate before repeating the cycle. Nonmuscle myosin 2b, along with its other nonmuscle myosin 2 isoforms, has roles that include&#160;cell adhesion, cytokinesis, and tension maintenance. The mechanochemistry of myosins can be studied by performing in vitro motility assays using purified proteins. In the gliding actin filament assay, the myosins are bound to a microscope coverslip surface and translocate fluorescently labeled F-actin, which can be tracked. In the single molecule/ensemble motility assay, however, F-actin is bound to a coverslip and the movement of fluorescently labeled myosin molecules on the F-actin is observed. In this report, the purification of recombinant myosin 5a from Sf9 cells using affinity chromatography is outlined. Following this, we outline two fluorescence microscopy-based assays: the gliding actin filament assay and the inverted motility assay. From these assays, parameters such as actin translocation velocities and single molecule run lengths and velocities can be extracted using the image analysis software. These techniques can also be applied to study the movement of single filaments of the nonmuscle myosin 2 isoforms, discussed herein in the context of nonmuscle myosin 2b. This workflow represents a protocol and a set of quantitative tools that can be used to study the single molecule and ensemble dynamics of nonmuscle myosins.

Presented here is a procedure to express and purify myosin 5a followed by a discussion of its characterization, using both ensemble and single molecule in vitro fluorescence microscopy-based assays, and how these methods can be modified for the characterization of nonmuscle myosin 2b.

Adattamenti specifici della miosina dei saggi di motilità basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell&#39;analisi &quot;Cargo Mapping&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Neuroscienze

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle contraction. To understand their force-generating mechanisms, myosin II has been investigated both at the single-molecule (SM) level and as teams of motors in vitro using biophysical methods such as optical trapping.
These studies showed that myosin force-generating behavior can differ greatly when moving from the single-molecule level in a three-bead arrangement to groups of motors working together on a rigid bead or coverslip surface in a gliding arrangement. However, these assay constructions do not permit evaluating the group dynamics of myosin within viscoelastic structural hierarchy as they would within a cell. We have developed a method using optical tweezers to investigate the mechanics of force generation by myosin ensembles interacting with multiple actin filaments.
These actomyosin bundles facilitate investigation in a hierarchical and compliant environment that captures motor communication and ensemble force output. The customizable nature of the assay allows for altering experimental conditions to understand how modifications to the myosin ensemble, actin filament bundle, or the surrounding environment result in differing force outputs.

Formation of actomyosin bundles in vitro and measuring myosin ensemble force generation using optical tweezers is presented and discussed.

Sondare la meccanica dell'ensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Bioingegneria

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Immunologia e infezioni

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Biologia

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of both conventional and unconventional myosins under load with unprecedented time resolution. In particular, the possibility to probe myosin motors under constant force right after the actin-myosin bond formation, together with the high rate of the force feedback (200 kHz), has shown UFFCS to be a valuable tool to study the load dependence of fast dynamics such as the myosin working stroke. Moreover, UFFCS enables the study of how processive and non-processive myosin-actin interactions are influenced by the intensity and direction of the applied force.
By following this protocol, it will be possible to perform ultrafast force-clamp experiments on processive myosin-5 motors and on a variety of unconventional myosins. By some adjustments, the protocol could also be easily extended to the study of other classes of processive motors such as kinesins and dyneins. The protocol includes all the necessary steps, from the setup of the experimental apparatus to sample preparation, calibration procedures, data acquisition and analysis.

Presented here is a comprehensive protocol to perform ultrafast force-clamp experiments on processive myosin-5 motors, which could be easily extended to the study of other classes of processive motors. The protocol details all the necessary steps, from the setup of the experimental apparatus to sample preparation, data acquisition and analysis.

Dissezione delle proprietà meccanoenzimatiche delle miosine processive con spettroscopia ultraveloce a force-clamp

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualizzazione della motilità batterica basata su una reazione cromatica

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...