我々は、博士に感謝したいと思います。エド・キャロウェイとマーティUsrey私たちは神経細胞再構成のヘルプのための先行研究とリビーFairlessとShiyuan劉の一部として調製された組織を使用することを可能にするため。ホワイトホール財団：この作品は、NIH（EY018683 NEI）によって賄われていました。

<ol>
	<li>Cajal, S. R. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , (1911).</li><li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+functional+connectomics.">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li><li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses.">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li><li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. 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著者らは、開示することは何もありません。

神経解剖学の研究では、神経科学とconnectomicsと構造と機能の関係の最近の関心の柱が選択的ニューロン集団の詳細な形態学的特徴付けのために熱意を更新したままです。伝統的に、神経解剖学の研究では、専門家のneuroanatomistsによって定義されたニューロンの形態学的に異なるクラスにニューロンの定性的な分類に依存してきました。ニューロンを再構築し、形態学的データを抽出するための技術の進歩により、公平な方法で、形態学的に異なる神経細胞のクラスを分類するために、より洗練され、定量的なデータ分析方法を利用することが可能になりました。本研究では、ステップバイステップの方法は、1のために概説されている）を選択的にウイルス媒介逆行性標識法を用いて、個々のニューロンの数百を標識します。 2）個々のニューロンの体系的に再構成する何百もの内のニューロンの総合的なので、代表的なサンプルを形成します<html>選択人口; 3）独立したクラスタリングは、形態学的評価指標に基づいて選択的集団内のニューロンの最適なクラスタを決定するために統計的評価と分析します。これらの解析方法は、TRNニューロンの既存のデータセットに異なるクラスタリング手法を適用することによって確認され、我々は、TRNニューロンが最適3形態学的に異なる亜集団にクラスタ化された3つの独立した評価方法に基づいて実証します。 本研究で概説プロトコルの主な利点は、その柔軟性です。 G-削除された狂犬病ウイルスは、標的構造への注入、次の逆行性標識されたニューロンの数百にEGFPの発現を駆動するのに有効でした。同じ狂犬病ウイルス株は、マカクザル5、9、（改正でハッセ＆ブリッグス、）フェレット、およびげっ歯類7を含む複数種でも同様に効果的です&quot;&gt; 8があるため、修正された狂犬病ウイルスを選択的に標的構造への注射後の神経細胞のいずれかの人口の完全な樹枝状樹枝状のパターンを標識するために利用することができる。DAB /過酸化反応を行ったGFPに対する抗体染色は、これが永久的染色の原因となるためお勧めしますニューロンを標識し、（より長い露光で蛍光標識を漂白）蛍光顕微鏡の助けを借りずに、顕微鏡下で可視化される組織切片を可能にする。しかしながら、他の染色法が利用可能である、および/または所望であれば、蛍光を直接可視化することができる。測定の利点生の蛍光は、異なる蛍光分子の発現を駆動する別のウイルスがニューロンが複数のターゲットの脳構造に突出するかどうかを決定するために、例えば、組み合わせることができることである。さらに、上記の手順は、（例えば、軸索および樹状突起のために）利用可能なすべての形態学的データに適用することができますますます強固なモルフォを有効にしますニューロンの論理的な分類。狂犬病ウイルスの少量も、樹状突起に加えて、軸索の再構成のために有利である可能性がまばら逆行性標識を生成するために注入することができることに留意することも重要です。 本研究で概説分析方法のさらなる利点は、複数の異なるクラスタ化手法を利用して比較することができることです。クラスタ分析の各ステップにおいて、異なるオプションがクラスターを生成する間、ニューロンパラメータ空間における距離だけでなく、異なるアルゴリズムを計算するために利用可能です。さらに、複数の評価方法が利用可能です。代表的な結果のセクションで概説したように、後者は、最適なクラスタリングを確認する手段として特に有用です。フィールドが前方に移動すると、間違いなく、クラスタを生成するための、最適なクラスタリングを評価するための追加のアルゴリズムが利用できるようになります。一緒に、これらの分析方法はインプロしていきます神経解剖学の分野で定量的アプローチをVEのと調査結果の頑健性を高めます。 個々のラベルされたニューロンの理由により、ハンド再構成は、時間がかかり、訓練と経験を必要とし、まだ幾分主観的である神経細胞の再構成の自動化への関心の高まりがあります。コンピュータベースの自動ニューロンの再構成が依然として誤りがちであるため、電子顕微鏡ベースの神経解剖学的データがまだ人々 （実施例17を参照）によって分析します。しかし、自動化された神経細胞の再構成が近い将来に利用できるようになる可能性が高いです。自動化された神経再建は、このようにクラスタリング分析およびフィールドが技術的に前進し続けてここで説明する評価方法はさらに重要になるであろう、データ解析の端にさらに多くの精査が必要になります。

神経解剖学は、神経科学1の基盤の一つであり、「connectomics」の最近の関心は、ニューロン集団および特定のニューロン2との間の接続の形態的多様性を理解するための熱意をリニューアルしました。標識するための方法および復元ニューロンが大きく、遺伝的およびウイルス媒介回路トレースを含む最近の技術革新と改善しているニューロン集団5のより包括的な形態学的調査を可能にする、3、4に近づきます。個々のニューロンを標識の改善に加えて、定量的なデータ分析技術はまた、それは形態学的データ5、6に基づいて個別の亜集団にニューロンの独立した公正な分類を可能に浮上しています。これらの公平の技術は、よりtraditiona時に改善されています一世紀以上にわたって分野における標準をされているリットル定性的な分類方法。本研究の目的は、アウトラインステップバイステップすることで、選択的な集団内のニューロンのウイルス媒介標識の組み合わせは、これらのニューロンの包括的なサンプル、および定量的なデータ分析の大規模な再構成が持つ独立したクラスタリングに基づきます統計的評価。これらの方法を組み合わせることにより、我々は包括的サンプリングと選択的ニューロン集団内の形態学的にユニークな神経細胞の種類の公平な分類を容易にするために、神経解剖学データの収集と分析に向けた新たなアプローチを概説します。 これらの方法の一例として、我々はマカクザルの視床網様核（TRN）の単一のセクタ内のニューロンの大集団の我々の分析について説明します。これらのデータは、以前の研究7からのものです。選択的背Lateraのに突出したTRNニューロンを標識するための方法EGFP 4、8をコードする改変狂犬病ウイルスの外科的注入を使用して視床（dLGN）のリットルの膝状核が概説されている（ 具体的な材料/設備 、行2 の表を参照してください）。この修正された狂犬病ウイルスは、ウイルスのトランスシナプスの動きを排除する必須のコートタンパク質をコードする遺伝子を欠いています。ウイルスが注射部位での軸索終末に入ると、それは、感染したニューロン5、9、10の完全な樹状樹枝状全体でEGFPの発現を駆動する重要な利点を持つ伝統的な逆行性トレーサーのような役割を果たします。従って、このG欠失狂犬病ウイルスは、選択的に注入し、逆行性輸送、次のいずれかのニューロン集団に感染し、標識するために使用することができます。 特定のニューロン集団の総合的な分析を行うために、それからサンプリングすることが重要です集団内のニューロンの広い分布。ウイルス媒介性標識技術は、完全な細胞内に生成するので、「ゴルジ様」は、ウイルス注射部位における軸索を有する多くのニューロンの充填は、脳構造の完全な範囲内でのニューロンの非常に大きなサンプルを再構成することが可能です。修正された狂犬病ウイルスが感染したニューロンの多数の標識に非常に効果的であるため、また、動物あたりのニューロンの数百を再構成することが可能です。 dLGN投射TRNニューロンの総合的なサンプルを生成するために、TRN 11の視覚的なセクター全体で160ニューロンをサンプリングするための手順が概説されています。顕微鏡、カメラ、および再構成ソフトウェアを含むニューロンの再構成システムを使用して個々のニューロンを再構成する過程を説明します。また（TRN内この場合）脳構造内の個々のニューロンの位置を決定し、ウイルス注入SITを検証する方法が記載さ体積輪郭再構成を使用して（dLGN内でこの場合）構造内の電子の量と場所。形態学的データをエクスポートして、独立したクラスタが各ニューロンのために測定された形態学的評価指標に基づいて分析を実行する手順の概要は次のとおりです。クラスタリング手法には限界がありますし、利用可能な異なるクラスタリングアルゴリズムの様々なもあります。したがって、これらのオプションは、より一般的に使用されるアルゴリズムのいくつかの利点が記載されています。クラスター分析は、クラスタの一意の統計的な検証を提供していません。そのため、追加の手順が最適なクラスタリングだけでなく、クラスタ内および全体の形態学的データ間の関係を確認するために概説されています。そのTRNニューロンを確認するために、TRNデータセットのクラスタを評価するための統計的方法が記載されている10の独立した形態学的指標に基づいて、3つのユニークなクラスタにグループ化されています。 このように、選択的に標識するための手順を概説することにより、、再構築、および特定のニューロン集団から形態学的データを分析し、我々は集団内のニューロン間の形態学的差異を定量化するための方法が記載されています。マカクザルのTRNの視覚的なセクタ内の異なるニューロンタイプの前の調査結果は、別の統計的評価法で確認されています。一緒に、我々は、これらの技術は神経解剖学的データセットに広く適用することと脳を介してニューロン集団の多様性の定量的な分類を確立するのに役立ちます願っています。

<table><tbody><tr><td>SAD&amp;Delta;G-EGFP</td><td>E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute</td><td></td><td>Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core</td></tr><tr><td>Recording electrode: platinum/iridium or tungsten</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe</td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3&#039;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&amp;nbsp;</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit</td><td>Vector Laboratories</td><td>#BA-1000</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Neurolucida System&amp;nbsp;</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>Data export software</td></tr><tr><td>Microfire Camera&amp;nbsp;</td><td>Optronics</td><td></td><td>2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td></tr><tr><td>Nikon E800 Microscope</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Spreadsheet program</td></tr></tbody></table>

large-scale reconstructions and independent, unbiased clustering based on morphological metrics to classify neurons in selective populations

このプロトコルは、独立した公正なクラスタリングの使用と組み合わせニューロンの大規模な再構成を概説し、選択的ニューロン集団の間で観察された形態学的特徴の総合的な調査を作成するために分析します。これらの技術の組み合わせは、神経解剖学的データの収集と分析のための新規なアプローチを構成しています。一緒に、これらの技術は、大規模を可能にし、したがって、より包括的、選択的ニューロン集団のサンプリングと集団内の形態学的にユニークなニューロンのクラスを記述するための公平な定量的な方法を確立します。 プロトコルは、選択的ニューロンを標識するための修正された狂犬病ウイルスの使用を概説します。 G-削除された狂犬病ウイルスは、目的の標的脳構造に定位注射後の逆行性トレーサーのように機能し、神経細胞におけるEGFPの送達および発現のための車両として機能します。ニューロンの数が多いと、これを使用して感染しています技術および個々のニューロンの「ゴルジ様」完全な塗りつぶしを生産、彼らの樹状突起全体にGFPを発現します。したがって、ウイルス媒介逆行性トレーシング法は、完全な細胞内の塗りつぶしを生成することによって、従来の染料ベースの逆行トレース技術に改良を加えます。 研究下の脳領域の全領域に及ぶ個々のウェルに単離されたニューロンは、ニューロンの代表的なサンプルを得るために、再構成のために選択されます。プロトコルは、細胞体を再構築し、複数の組織切片にまたがるラベルされたニューロンの樹状突起樹枝状のパターンを完了するための手順の概要を説明します。脳構造内の各ニューロンの位置を含む形態学的データは、さらなる分析のために抽出されます。標準のプログラミング機能は、独立したクラスター分析し、形態学的指標に基づいて、クラスタの評価を行うために利用されました。クラスタ分析perfoのこれらの分析の有用性、統計的評価を確認するにはマカクザルの視床（TRN）の視床網様核に再構成された160のニューロンに行われたrmed。元のクラスター分析とここで行われる統計的評価の両方がTRNニューロンは3亜集団、ユニークな形態学的特性を持つそれぞれに分離されていることを示しています。

我々は、選択的な集団内のニューロンの大規模な再構成がdLGN 5に変更狂犬病ウイルスの注射後可能であることが以前に示されています。最近では、同じ組織はTRNの視覚的なセクターで160ニューロンを再構築するために利用された（ブラッグら 、レビューで; 図2A-B）上記の詳細な方法論的手順以下。 TRNの研究において、TRNニューロンの3つの固有のクラスタは、独立10形態学的指標のクラスタ分析に基づいて同定した：細胞体領域、細胞体の真円度、TRN内TRN、背腹位置の中心に内外の相対位置、樹状突起の数、ノードへの平均樹状距離、 第3の平均長および高次樹状突起、1次樹状突起の平均角度、総樹状樹枝状の平均位相角、およびへの角度偏差タル樹状樹枝状分岐。 TRNのニューロンは、等価的に、これらの3つのクラスター（ 図2C）に分散させました。 3つのクラスター内のニューロン全体のすべての10の形態学的評価指標の個別の統計的な比較は、元のクラスタ分析に含ま形態学的評価指標のすべてが、2つのためのクラスタ間で統計的に有意な差が得られました。このように、クラスター分析（ 図2C）とクラスタ間の形態学的評価指標の個別の統計的比較から生成された階層ツリー樹形図に基づいて、TRNのニューロンは、3つのユニークなグループに分類されます。 本研究では、具体的に別々にクラスター分析を用いて決定クラスタを評価するための統計的手法を適用したかったです。先行研究からのTRNデータセットが観察された3つのクラスタが最適であったかどうかを決定するために評価しました。独立した追加のクラスタは、すなわちPCAとGMM CLUSを分析します結は、従来のクラスタリング方法（ 図1）を確認するために行きました。 3つの重要な成果は、個別に先立ってクラスター分析を確認します。元のクラスタ分析方法は、クラスタを生成するために、「結合」機能を指定する「evalclusters」機能を使用して評価した場合、まず、クラスタの最適数は、階層ツリーの系統樹（ 図2C）に基づいて、元の結論と一致する、3でした。第二に、PCAは、形態学的指標の寄与に基づいて、ニューロンをグループ化する別の手段として、160 TRNニューロン10の形態学的指標の元のデータマトリックスで行いました。三つの遺伝子組換え微生物は、TRNニューロンは1、2、または3つのユニークなクラスターに分類したと仮定すると、生成されました。負の対数尤度（NLL）と赤池の情報量基準（AIC）は、最低が得られ、そのため最も有益な、価値観やGMMはTRN形態学的データを記述するために3つのクラスタを使用した場合、両方の値が最適であった（FigurE 3）。第三に、GMMベースのクラスタリングは、別途「evalclusters」機能を使用して評価し、最適なクラスタ数は、神経細胞全体の形態学的評価指標の統計的な比較は3つのクラスタ、PCAとGMM-に分け、階層ツリー樹形図のしたがって3.観測しましたクラスタリング、および各クラスタリング手法（リンケージとGMM）の独立した評価は、すべてのは、TRNのニューロンが最適に利用10形態学的指標に基づいて、3つのクラスタに分割されるのと同じ結果が得られました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55133/55133fig1.jpg" /> 図1： データフォーマット。 （データマトリックス内のヘッダーを含まない）クラスター分析に含める独立変数の総数に対応するニューロンおよびm = 5列の数に対応するn個の行を持つデータ例行列。 図2：160 TRNニューロンの独立したクラスタリング。シトクロムオキシダーゼ活性について染色A.左、1動物のdLGNを通じて単一の冠状断面の写真は、dLGN層を視覚化し、GFPに対してウイルス注射を可視化します。矢印は、高密度の逆行性標識されたTRNニューロンの領域を示しています。セクションの向きは以下の背腹/内側-外側（DV / ML）コンパスとスケールバーを次の中のすべてのパネルの500ミクロンを表します。第二に、左から、輪郭は、ウイルス注射（黒輪郭）を含むすべてのセクションのためにdLGN（赤）とTRN（栗色）の概要を説明します。黄色の星は、注射部位の中心を示しています。 Aのように、方向及びスケールバー。のような輪郭と注射部位、方向及びスケールバーの左、3-Dレンダリングからサード。再構築されたの場所の右、地図<html> TRNニューロンは、クラスタの割り当て（C）単一の集約TRN輪郭内（マルーン）に応じて色分けされました。 Aのように、方向及びスケールバー。 B。左、TRN内でのそれらの内側 - 外側位置に応じて冷却するために暖かい色の5復元されたTRNのニューロンとTRN（黒）とdLGN（グレー）の集合体の輪郭。オリエンテーションAでのDV / MLのコンパスによると、スケールバーは500μmで表します。右、カラーマッチングのスケールバーと同じ5 TRNニューロンの写真は100μmで表します。 C。 10の独立した形態学的指標に基づいて、160復元されたTRNニューロン間の結合距離を示すクラスター分析以下の階層ツリー樹形図。 3つのクラスタには、青、緑、赤で示されています。この図のすべての部分は、ブラッグらに含まれる数値と適合されます。 （審査中）。痩せ細った &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55133/55133fig3.jpg" /> 図3： クラスタ評価。二つの異なる基準値のプロット、負の対数尤度（赤NLL）と赤池の情報量基準1、2、または3つのクラスタを想定した3遺伝子組換え微生物から生成された（AIC、青）。 3つのクラスタを持つ遺伝子組換え微生物は、最低基準値を提供します。 補足コードファイル：Matlabの互換言語で書かれたコード例、PCAとGMMのアプローチを使用して、クラスタの評価に続いて、例えばデータ行列にクラスター分析を実行します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55133/Briggs&amp;BraggSupplementaryCodeFile.m" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

large-scale-reconstructions-independent-unbiased-clustering-based-on

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.9K ビュー.  Geisel School of Medicine at Dartmouth. このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。 

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

神経科学

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to the site of inflammation and are activated to prevent a further spreading of the invasion. This is also reflected by changes in the behavior and the morphological appearance of the immune cells. In cancerous tissue, similar morphokinetic changes have been observed in the behavior of microglial cells: intra-tumoral microglia have less complex 3-dimensional shapes, having less-branched cellular processes, and move more rapidly than those in healthy tissue. The examination of such morphokinetic properties requires complex 3D microscopy techniques, which can be extremely challenging when executed longitudinally. Therefore, the recording of a static 3D shape of a cell is much simpler, because this does not require intravital measurements and can be performed on excised tissue as well. However, it is essential to possess analysis tools that allow the fast and precise description of the 3D shapes and allows the diagnostic classification of healthy and pathogenic tissue samples based solely on static, shape-related information. Here, we present a toolkit that analyzes the discrete Fourier components of the outline of a set of 2D projections of the 3D cell surfaces via Self-Organizing Maps. The application of artificial intelligence methods allows our framework to learn about various cell shapes as it is applied to more and more tissue samples, whilst the workflow remains simple.

Here, we provide a workflow that allows the identification of healthy and pathological cells based on their 3-dimensional shape. We describe the process of using 2D projection outlines based on the 3D surfaces to train a Self-Organizing Map that will provide objective clustering of the investigated cell populations.

健康と病理の間の区別の形態に基づく細胞利用のフーリエ変換と自己組織化マップ

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

がん研究

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described here identifies the basic building blocks of this circuitry. The in-depth studies of cortical regions will ultimately provide other scientists with the circuit components needed for an understanding of how the brain acquires, processes and stores information and what goes wrong in disease, while the electrophysiological and morphological data are widely used by computational neuroscientists in the construction of model networks that explore information processing. The protocol outlined here describes how biocytin-filled cells recorded in the CA2 region of the hippocampus are recovered and then reconstructed in&#160;3D. Additionally, the protocol describes the demonstration of calcium binding protein or peptide content in recorded interneurons.

The protocol outlined here describes the immunofluorescence analysis, biocytin recovery and high-quality reconstructions of hippocampal CA2 interneurons following the intracellular electrophysiological recordings in vitro, allowing neuronal characterization and ultimately fine neuronal anatomy to be studied.

Biocytin 回復と塗りつぶされた海馬 ca 2 介在ニューロンの 3 D 再構成

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Automatic Identification of Dendritic Branches and their Orientation

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology of dendrites is essential for a better understanding of neuronal function. However, the complexity of dendritic trees, both when isolated and especially when located within neuronal networks, has not been completely understood. We developed a new computational tool, SOA (Segmentation and Orientation Analysis), which allows automatic measurement of the orientation of dendritic branches from fluorescence images of 2D neuronal cultures. SOA, written in Python, uses segmentation to distinguish dendritic branches from the image background and accumulates a database on the spatial direction of each branch. The database is then used to calculate morphological parameters such as the directional distribution of dendritic branches in a network and the prevalence of parallel dendritic branch growth. The data obtained can be used to detect structural changes in dendrites in response to neuronal activity and to biological and pharmacological stimuli.

Presented is a computational tool that allows simple and direct automatic measurement of orientations of neuronal dendritic branches from 2D fluorescence images.

樹状枝の自動同定とその向き

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...