自動シリアルセクション電子顕微鏡技術の生物学的三次元モデル画像処理の生成につながるパイプラインにおける速度制限ステップ。我々のプロトコルは、わずか数日で画像ボリュームの高密度構造を生成するためのステップバイステップのガイドラインを提供します。
3次元モデルを用いた定量的測定手法と組み合わせる。この技術により、脳以外の組織の3D構造を分析して、特定の疾患に典型的な構造的障害を特定し、診断戦略を改善する可能性があります。セグメンテーションは退屈なステップです。
悪いセグメンテーションを校正し、プロセス全体を再起動する必要がないように、可能な限り正確にする時間がかかります。ソフトウェアの設計は、時にはあまりユーザーフレンドリーではありません。したがって、セグメンテーションの開始作業を確認することが重要です。
スタックを含む顕微鏡からネイティブファイルをドラッグアンドドロップして画像スタックを開くか、スタックが開いたら画像、プロパティに移動して、メタデータからボクセルサイズが読み取られたことを確認するために、画像ウィンドウに画像スタック全体を含むフォルダをドラッグアンドドロップします。イメージをクリックして 8 ビットに変換し、8 ビットを入力して選択します。元のスタックが別のタイルとして取得されている場合は、TrakEM2 内でステッチを適用します。
必要に応じて、TrakEM2組み込み関数を使用して新しいTrakEM2プロジェクトを作成します。TrakEM2のgooeyで、テンプレートウィンドウの下にある何かを右クリックし、新しい子エリアリストを追加し、プロジェクトオブジェクトの下のフォルダにドラッグアンドドロップを選択すると、そこに1つが表示されます。ドラッグ アンド ドロップ、領域リスト、テンプレートからプロジェクト オブジェクトの下にある何かに'イメージ スタック ビューポートで、カーソルを使用して Z 空間を選択します。
エリアリストは一意のID番号とともに表示されます。上のブラシツールを選択し、マウスを使用してZスタック全体にサイトソルを充填して構造をセグメント化します。キ イラスティックで彫刻のシードとして使用されるセグメント化された質量をエクスポートします。
これを行うには、Z-Space リストのエリア リスト オブジェクトまたはビュー ポートのマスクを右クリックし、エクスポート領域リストをラベル T-I-F として選択します。さらなる再構築に必要な解像度に応じて、ダウンサンプリングによってイメージ スタックのピクセル サイズを小さくします。セグメンテーションと再構築に使用されるソフトウェアのメモリ要件を考慮してください。
Ilastik は X-Y 上で最大 500 ピクセルのスタックを処理します。オブジェクトがまだ認識可能でセグメント化できる最小サイズを考慮してください。画像の調整サイズを使用する 'コントラストを高め、セグメンテーションを助けるために、アンシャープマスクフィルタを適用して膜を鮮明にすることができます。
プロセスのフィルターのアンシャープ質量を使用して、セグメンテーションソフトウェアでのさらなる処理のためにイメージスタックを単一の画像としてエクスポートし、ファイルの「名前を付けて保存」画像シーケンスを使用してTIFF'フォーマットを選択します。メインのイラスティック・グーイで、彫刻モジュールを選択します。「新規追加」を使用してイメージスタックをロードし、シーケンスから単一の3D / 4Dボリュームを追加し、単一のファイルとして保存されたイメージスタックを含むフォルダを選択します。
以下の手順では、すべての操作とボタンがメインソフトウェアgooeyの左側にあります。前処理タブで、既にチェックされている標準オプションを使用します。明るいラインの豊富なフィルタを使用し、フィルタのスケールを 1.600 に保ちます。
この境界は後で変更できます。前処理が完了したら、ラベル付けモジュールのドロップダウン メニューで次のページを選択します。デフォルトでは、1 つのオブジェクトと 1 つの背景が存在します。
オブジェクトシードをクリックして選択し、目的の構造の上に線を描きます。次に、背景のシードを選択し、再構築するオブジェクトの外側に 1 つまたは複数の線を描画します。さて、セグメントをクリックして待ちます。
コンピュータの電源とスタックのサイズによっては、セグメンテーションに数秒から数時間かかる場合があります。完了すると、セグメントをハイライト表示する半透明のマスクが、セグメント化された構造の上に表示されます。スタックをスクロールして、セグメンテーションを確認します。
セグメント化は、関心のある構造に従っていないか、またはそこから流出しない場合、正確でない可能性があります。こぼれたセグメンテーションに背景シードを配置して、流出を修正します。オブジェクト シードを対象のオブジェクトの再構築されていないセグメントに追加します。
Ilastik によるセグメンテーションの正確な視覚的な校正は面倒かもしれませんが、エクスポートされたオブジェクトにアーティファクトが含まれていないことを確認することが不可欠です。セグメンテーションがまだ正しくない場合は、バイアスパラメータを使用して変更してみてください。デフォルトでは 0.95 です。
セグメンテーションが保守的すぎる場合は、波及を制限したり、大きくなります。もう一つの可能性は、前処理をクリックして、フィルタのサイズを変更することです。値を大きくすると、塩コショウのノイズのような効果が最小限になりますが、膜のぼやけや細部の小さな検出が困難になります。
これにより、波及が制限される可能性があります。必要なオブジェクトがすべてセグメント化されている限り、必要なだけ繰り返します。オブジェクトが終了したら、セグメントに移動し、現在のオブジェクトを保存をクリック'2つの新しいシードが表示され、新しいオブジェクトのセグメンテーションが開始されます。
「すべてのメッシュをエクスポート」をクリックしてO-B-Jファイルとしてすぐに抽象的なサーフェスメジャーを表示する TrakEM2 内の3Dで手動でセグメント化されたモデルを視覚化するには、エリアリストを右クリックして、3D'A より高い値で表示を選択すると、低解像度メッシュが生成されます。最後に、メニューファイルのエクスポートサーフェスのWaveFrontから選択して、3DメッシュをWaveFront O-B-J'としてエクスポートします。シーンメニューの下にあるオブジェクトの読み込み(Import object)をクリックして、一度に複数のオブジェクトを読み込み、ニューロモーフバッチインポートを使用してオブジェクトを読み込みます。
アクティブ化、再メッシュ、スムーズ シェーディングを使用してください。アウトライナーから対象のオブジェクトを選択し、モディファイヤのメニューで再メッシュ機能の[Octree Depth]を修正します。頂点の数を最小限に抑え、解像度と正しい形態の詳細を失うことを避けるために反復的に作業します。
オクツリー深度を変更すると、メイングーイのメッシュもそれに応じて変化します。完了したら、[適用] をクリックしてプロセスを完了します。左側のパネルのニューロ モーフ メニューに移動し、画像の重ね合わせツールのイメージ スタックの相互作用を使用して、イメージ スタックを読み込みます。
X、Y、Z のイメージ スタックの物理サイズを入力し、ソース Z.X と Y が直交平面をクリックしてスタックのパスを選択してください。これらはオプションであり、ユーザーが有効なパスを挿入した場合にのみ読み込まれます。次に、ビュー ポート上のメッシュを右クリックして選択します。
編集モードに入る場合は、Tab キーを押し、マウスの右クリックで 1 つまたは複数の頂点を選択し、最後に頂点で画像を表示するをクリックします。マイクログラフを使用した 1 つまたは複数の切断面がメッシュの上に重ねて表示されます。切断面を右クリックして選択します。
次に、コントロール Y を押し、マウスのスクロールを使用して 3D モデル上をスクロールします。これは、校正方法としても使用できます。ここに示されているのが、TrakEM2 と Ilastik を使用したセグメンテーションと再構築です。
TrakEM2グーイは、手動で赤でセグメント化されたオブジェクトで表示されます。エクスポートされたマスクは、半自動セグメンテーションの入力として使用できます。Ilastikから、マスクは手動校正のためにTrakEM2にさらにエクスポートすることができます。
マスクは、再構築された構造を明らかにするために、3D 三角形メッシュとしてエクスポートできます。この例では、このプロセスを用いて、4つのニューロン、アストロサイト、ミクログリアおよびペリサイトを再構築した。カスタマイズされたツールを使用して再構築されたモーフィロジーの 3D 解析を示します。
ここでは、焦点を合わせるイオンビーム走査電子顕微鏡データセットからの等方性画像容積である。このデータの密な再構築は、軸索、アストロサイトのプロセスと樹状突起を明らかにします。この顕微鏡写真は、シナプスやアストロサイクグリコーゲン顆粒などの定量対象の例を示しています。
その顕微鏡写真のマスクは、シナプスの周りのグリコーゲン顆粒の分布を示しています。ここに示されているグラコーゲン由来乳酸吸収モデルまたはGLAM'Hereのグラフィックビジュアライゼーションの入力と出力のグラフィックイラストは、ユーザーが焦点を当てたイオンビーム走査電子顕微鏡データセットからの緻密な再構築に取り組んでいる間、バーチャルリアリティまたはV-Rヘッドセットを着用して示されています。一部の神経突起から、没入型V-Rシーンを観察することができます。
緑色のレーザーがGLAM'peakを指しています。は、エクスポートされる 3D オブジェクトの正しいサイズを決定し、実際のサイズを反映する計測値を決定するので、主に重要です。シリアルセクションイメージング、イメージングセグメンテーション、3D構造の概念はかなり古いです。
技術的な加速を発見することは、解剖学の教科書のレビューにおけるコレクトミーの進歩につながっています。電子顕微鏡での脳研究のために開発された方法は、データを生成するあらゆる顕微鏡技術や顕微鏡技術にも一般化することができ、あらゆる種類の3Dイメージング技術は、このようなイメージングセグメンテーションおよび構築技術の恩恵を受けることができます。C-TスキャンとM-R-Iを含む。
