We would like to thank the funding from Medical Research Council and Action Medical Research, which provided MG with a clinical fellowship, GN 2339, to conduct this work.

このプロトコルは、ヒト組織の使用、保管、および処分に関する当社の機関の人間研究倫理委員会のガイドラインの倫理指針に従います。ヒト組織試料は、関連する倫理的な承認で研究目的のために同意されている死体体から切り出すことができます。サンプルはまた、関連する倫理的な承認を得て、外科手術を受けた同意患者からの組織を廃棄することができます。 皮膚の調製<ol><li>手動でメスの刃と鉗子を使用して、脂肪組織と深い真皮の薄層をオフに解剖することにより検体を準備します。このステップでは、サンプル14の間の整合性を確保することが重要です。 </li><li>標準化されたサンプルサイズ（ 例えば、1センチメートル×5cmのサンプル）に分割厚さ皮膚の得られるシートをカット。試験装置の寸法に基づいて、試料サイズを決定します。組織工学構築物はまた、試験されている場合、specimen個の大きさは、対象14の材料のために適切でなければなりません。適切な鋭利物ビンにメスの刃を処分。 </li><li>機械的な計算の完了を有効にするには、機械的試験の前と後の電子キャリパーを使用してテストされている皮膚の厚さを測定します。 </li></ol> 2.引張試験注：すべての材料試験機は、試験前に、製造元のガイドラインに従って較正されなければなりません。 <ol><li>室温（22℃）14で材料試験機（ 図2A）を使用して、一軸引張試験皮膚試料。 </li><li>すべてのサンプル（ 例えば、垂直またはインラインランガー行による（位相幾何学線は人体の地図に描かれたと真皮中のコラーゲン繊維の自然な向きを参照））14に対して同じ方向に皮膚サンプルを向けます。 </li><li> （コ2つのクランプの間に試料を固定しますmmercial治具）、98.07 Nロードセルと不動のベース板14に他に貼付1。一軸引張において試験クランプの間に生じる面積は1cmのX 4センチメートル（ 図2）でなければなりません。 注：商業用治具は、試験前の試料の不均一な把持及び損傷を回避するために利用されました。サンプルは、「指密」気密に固定されています。 </li><li>試料の乾燥を防ぐために、石油ゼリーと両側に（装置内の配置後）のサンプル領域をカバー。 </li><li>プログラムは以下のように、アクションのリストとしてソフトウェアに政権をテストする引張荷重とリラクゼーション：ゼロロード|ゼロ位置|連絡先（引張荷重）を探します| （リラクゼーション）待ちます。 </li><li>ソフトウェアプログラムでテストを開始します。 1ミリメートル/秒で29.42 Nに張力下にサンプルをロードします。皮膚の障害を引き起こさない速度と負荷を使用して（ 例えば、29.42 N 1ミリメートル/ sで）。 </li><li> 29.42 N負荷に達した後、組織を弛緩することを可能にします1.5時間、時間点はれるコンピュータソフトウェア14により制御される緩和挙動における最小の変化が存在します。 注：変位が弛緩期ではなく負荷時に一定に保持されます。 </li><li>分析部の指針に従って弾性と粘弾性特性を計算します。調査した機械的特性は、分割層皮膚成分（表皮と真皮）14の平均的特性を表すことになります。 注：定義された風袋負荷が存在しない、変形が発生しているため、これらのみのデータ点が含まれている場合には、生のデータから明らかなように。 </li></ol>軟骨の調製<ol><li>手術用メスの刃を使用して、軟骨試料から皮膚および筋膜を取り外し、15、16を鉗子。 </li><li>手術用メスの刃と鉗子を使用して、標準化されたサンプルサイズ（ 例えば、1.5 cmのブロック）に軟骨標本を分割します。すべてのサンプルについては、semicircuを使用LAR字形圧子（ 図2B）の直径および軟骨サンプルの大きさよりも少なくとも8倍の厚さを有します。この比率は、圧子を試料調製15から任意のエッジ効果の影響を受けないことを保証します。適切な鋭利物ビンにメスの刃を処分。 </li><li>機械的な計算の完了を有効にするには、機械的試験15、16前後の電子キャリパーを使用してロードされる軟骨の厚さを測定します。 </li></ol> 4.圧縮インデントのテスト<ol><li>室温で水和環境で材料試験機を用いて、軟骨サンプルを圧縮します。試料を水和していることを確認する前および圧縮試験時にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、軟骨サンプルをカバーします。 注：PBSは正確に生理的環境と一致していないが、それは材料と組織の両方がCOMにすることができます同じように15、16を比べ。 </li><li>表面は圧子に垂直であるように、軟骨サンプルを向けます。これは圧縮が一軸にすることができますし、任意のせん断荷重15を制限します。 </li><li>プログラムは以下のように、アクションのリストとしてソフトウェアに政権をテスト圧縮荷重とリラクゼーション：ゼロロード|ゼロ位置|連絡先（圧縮荷重）を探します| （リラクゼーション）待ちます。 </li><li>ソフトウェアプログラムを使用してテストを開始します。 1ミリメートル/秒15で2.94 N、16に圧縮下のサンプルをロードします。 注：これは、軟骨15の弾性及び粘弾性特性の両方を識別するのに十分な感度で非破壊的負荷であると決定されました。 </li><li> 2.94-Nの上限に達した後に、軟骨は、コンピュータソフトウエア15、16を用いて、緩和挙動における最小の変化がある時15分時点のためにリラックスすることを可能にします。 メモ： 図2C-Dは、ヒトの組織標本の圧縮および引張試験のための典型的なセットを示しています。同じプロトコルが次に分析される天然組織への生体力学的特性に一致するように、合成生体材料に適用することができます。例えば、 図2E-Fは、密接に合成材料の生体力学的特性に一致するヒト組織の圧縮および引張試験を示しています。 </li></ol>インデントと引張試験のためのヤング弾性率の5計算<ol><li>材料試験装置14〜16から、時間（秒）を含む生データを収集する変位（mm）であり、荷重（N）。 </li><li> 図3に示す式を用いて応力（MPa）とし、歪み（％）を計算します。 注：半球状の圧子は断面積で力を分割し、圧縮試験中に使用される公称（平均）ストレスではなく、ピーク応力を与えた場合。 </li><li>リニア散布図を使用します歪みに対する応力メガパスカル（y軸）（x軸）をプロットします。線形曲線フィットを決定します。線形曲線フィットは、それぞれのR値とY = MX + Bに等しいです。 注：すべてのデータポイントは、最小R値&gt; 0.98を達成するために含まれます。 m値はMPaでの張力、圧縮抵抗性または耐性（ すなわち、ヤング率）を示す、歪みを超えるストレスの弾性率に対応する傾き、です。 R値がない&gt; 0.98である場合には、線形粘弾性挙動を特徴づけるの仮定は無効です。 </li><li>変形への暴露からの流体の流れが平衡に達した粘弾性特性を特定するために、実験の終了時に機械的なテストおよび最終的ストレスレベルの最後の200秒を超える時間にわたって応力の比が算出されます。 注：時間が増加すると、応力レベルは、流体の流れのように減少（緩和する）であろうが、平衡17,18に達します。高速応力緩和応答indicatサンプル17、18内に高い応力を維持することが困難であること、ES。 </li></ol> 6.緩和特性<ol><li>リニア散布図のS（x軸）における時間に対するメガパスカル（y軸）のプロットストレス。 </li><li>緩和の速度を計算するために線形曲線フィットを決定します。線形曲線フィットは、最後の200秒のそれぞれの値とY = MX + Bに等しいです。 m値は、緩和率です。 </li><li>最小R値&gt; 0.98を得るために、すべてのデータポイントを含めます。皮膚や軟骨のための15分間の1.5時間で、最終的な応力（MPa）が、最終的な絶対緩和値です。 </li></ol>

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The authors have nothing to declare.

いくつかの引張とインデントのプロトコルは、人間の軟組織を特徴づけるために公開されています。私たちは、複数の診断や非破壊なることを目指して別の方法を、提供しています。トランスデューサは変位よりも負荷に対してより敏感であるとして、このプロトコルで機械的試験を受けているサンプルは、負荷によってではなく変位により制限されています。したがって、実験の再現は、組織や合成材料全体でより正確にすることができます。この技術を用いて、皮膚組織及び軟骨組織を分析するためのインデントプロトコルを評価するための引張プロトコルを示しました。どちらのプロトコルは、実装が簡単でシンプルであり、人間の軟組織と組織工学構築物の特徴付けのために考慮することができます。 分析に適した応力緩和曲線を得るための方法の重要なステップの一つは、サンプルが試験中に滑らないようにすることです。十分な固定がrequirですエドが、これは標本上の任意のストレスを引き起こし、圧子は、任意のせん断負荷を防止するために、表面に垂直であることを保証することに対してバランスをとらなければなりません。組成物ならびに組織の大きさや形状は、サンプル間で類似していることが重要です。軟骨のためには、反復可能な解剖プロトコルとサンプルの寸法を使用することが不可欠です。皮膚サンプルの場合は、反復のサンプルを得るために全ての皮下組織を除去することが重要です。適切な場合、すべての試料について、試料の条件は、水和、室温、および解凍工程を含む、同じであることを確認することも重要です。 提示されたプロトコルにはいくつかの制限があります。研究は、皮膚や軟骨の変形特性は、試料オリエンテーション13に依存していることを示唆しています。皮膚は、ランガーは、皮膚が自然のラインを持っていることを1861年に実証して、にまでさかのぼる19 世紀のような異方性であることが認識されました緊張、ランガー線4と呼びます。皮膚サンプルを特徴づける際にこのように、方法論バイアス4を導入することを避けるためにランガー線と平行または垂直なすべてのサンプルを向けることが重要です。軟骨はまた、異方性の特性を示し、ランガー線に相当するHultkrantz線が含まれ、そのように軟骨は、12、19に装填された方向記載異なる変形することができます。これにより、異なる方向に軟骨の検査を可能にするために、サンプルサイズを大きくすることが重要です。組織の生体力学的特性はまた、年齢や性別によって変化したように、研究は、臨床設定に有効性を維持するために、代表的な患者コホートで行われるべきです。さらに、いくつかの機械的なプロトコルは、組織は、組織が、その後の機械的試験20定常状態にあることを確実にするために繰り返し荷重を受ける前処理を提唱します。しかしPの、正確なメカニズム再調整は不明であり、一貫性と再現性の応答を生成するために必要なサイクルの正確な数は異なる研究20で変化します。研究者は、特定の生体力学的テスト20を行う理由を評価した後に前処理を含めるかどうかを検討する必要があります。 表皮、真皮、および皮下組織4：皮膚は、3つの主要な層に分け、複雑な多層材料です。 皮膚組織の機械的特性は、最近、 インビボで評価 4 で使用して評価されてきました。 しかし、引張試験のプロトコルは、切除皮膚4の皮膚の生体力学を理解するために利用することができます。このような試験は、境界条件が4に定義することができるので、応力-ひずみ関係をモデル化するために情報を提供することができます。一般的に、in vitro試験制度は、 インビボ系での使用に対し、障害のために材料を特徴づけるために、高い菌株を使用します低歪は4の範囲です 。緊張で切除した皮膚のための生体力学的な値を比較すると、MPaの4 2.9から150に至るまで、異なる研究間で大きなばらつきがあります。対象者との間に大きな違いは、天然の生物学的変化に期待されていますが、プロトコルの体制の違いはまた、これらの天然の生物学的な違いを配合することができます。より大きな負荷率がより高い剛性が得られ、流体が流出するためのより少ない時間を引き起こすとして例えば、プロトコル間の負荷率の差は、変動の原因となります。準備、切除、および皮膚組織のプロトコルを扱うには、機械的性質4に違いが生じます。このプロトコルは、皮膚組織を特徴づけるために、研究者のための代替の方法を提供し、テストの肌のために実証されました。これは、皮膚のより深い理解を可能にする、1機械試験で皮膚組織の弾性と粘弾性特性を特定する能力を含むいくつかの利点を提供し、短時間インチさらに、同じ試験を、天然皮膚と同様の生体力学的特性を有する構築物を製造するために、組織工学の置換にも適用することができます。 インデントのテストは、軟骨21の生体力学を理解するための拘束圧縮試験に比べて魅力的な選択肢を提供します。インデントは、軟骨の生理的な構造を維持する能力を有し、したがって、臨床設定のものを模倣する値を提供します。まだ下にある骨に付着しながら、インデントを使用して、軟骨をテストすることも可能です。インデントはまた、 インビボでのように軟骨の生理的なテストを行うことができます。 2軟骨表面が互いに接近するとき圧縮変形17、21を生じた後、接触領域の下水による接触「バルジ」の領域を囲む縁部は横方向に変位します。軟骨インデントは内で行わなければなりません同様の膨らみを可能にするために、軟骨サンプルよりも小さな半径でdenter。圧子のサイズはまた、不定サンプル22の一部であるかのように軟骨が反応することを確実にするために、少なくとも8倍のサンプルサイズでなければなりません。サンプル直径の半径は、試料の作成中に存在する任意のエッジ効果を排除するよりもはるかに小さい圧子を使用。また、インデントはサンプル抽出により損傷を受けた軟骨欠損をテストすることによって引き起こされる可能性実験誤差を避けることができます。インデントはまた、軟骨の小さい、薄い片が17、21をテストすることができるように、このような拘束圧縮などの深い試料調製を、必要としません。また、くぼみの非破壊的方法は、検証及び確認の研究が行われた後、それは診断ツールとしての臨床設定における潜在的な用途を有することを意味します。 ユーザーがappropのために確認する必要がありますインデントを持つ主要な仮定があります。riate結果。インデント負荷の重要な境界条件は圧子と軟骨表面（ すなわち、表面は圧子から離れて変形しないこと）23、24との間に一定の接触を必要とします。インデント負荷はまた軟骨表面と圧子との接触が圧子が表面に接触していること、すなわち （非破壊的であるが、表面を通過しないことを前提と境界条件を含み、軟骨表面が下に失敗してはなりません圧子）25から26。研究は、この境界条件は、軟骨表面25,26に適用した場合、損傷した領域を染色する墨の使用を介して確認することができることを示しています。さらに境界条件は圧子が試料の表面に垂直な軟骨を圧縮することを前提としています。圧縮の垂直配向性は重要な境界のcondですitionせん断コンポーネントを誘導し、機械的荷重を変更することができる滑りを引き起こすこともあり、繰り返し荷重を使用している場合は特に、角度で圧縮するため。この条件は設定慎重にテスト装置を介して確保することができます。 要約プロトコルは、関心の軟組織のために最適化された後、研究者が関心のある組織の動的テストを検討するために、それが有用であろう。標本の適切な周期的荷重は、ウォーキングや他の反復動作27を模倣するなど正常な生理的限界と動作を模倣する必要があります。要約すると、このレポートには、ヒト組織を評価するために、単純な機械的な試験プロトコルを示しています。これらのプロトコルを実装することは、より良い天然組織を模倣するために組織工学の構築を可能にする、組織の生体力学的特性に関する重要な情報を提供します。

患者はますます失敗や負傷者の臓器を治療するための様々な臓器移植を待っています。しかし、適切なドナー臓器の不足で、再生医療は末期臓器不全患者のための代替ソリューションを作成することを目指しています。再生医療とは、軟骨や皮膚などの軟組織を含む、組織の代用として機能するように工学材料によって、この臨床的必要性を満たすことを目指しています。損傷した組織を復元するために成功した材料を作成するには、置換材料は、1-2を交換しようとしている天然組織の特性を模倣する必要があります。外科的に移植されると、材料は、組織欠陥に解剖学的形状を提供する必要があります、したがって、材料の機械的性質は、1不可欠です。例えば、耳介軟骨を交換材料が覆う皮膚2により圧縮を防止するために適切な機械的特性を有していなければなりません。同様に、材料は、鼻の車を交換しますtilageは3呼吸時の崩壊を防ぐために適切な機械的性質を持っている必要があります。機械的特性の重要性にもかかわらず、移植のための材料を製造する場合しかし、証拠はほとんど異なるヒト組織の機械的特性を特性に焦点を当てています。 機械的試験計画は、組織の圧縮、引張、曲げ、または剪断特性を確立するために使用することができます。皮膚は高異方性、粘弾性、ほぼ非圧縮性材料4-9です。一般的に切除された皮膚は、負荷と拡張が4-9を記録している間に肌の適切な形状のストリップが両端で把持して延伸される一軸引張方法論を使用してテストされています。 すべての軟組織の主要な成分は、間隙水であるので、軟骨の機械的な応答は、組織10-11を通る流体の流れに強く関連しています。このような軟骨hと軟組織従来、圧縮試験を用いて試験されAVE。圧縮での試験のための方法が閉じ込められ、一軸、インデントが最も普及している（ 図1）と、非常に多様です。拘束圧縮の中では、軟骨サンプルは不浸透性、流体で満たされたウェルと多孔板を介してロードに配置されます。ウェルは非多孔質であるため、軟骨が垂直方向12〜13であるが、流れます。一軸圧縮では、軟骨は、12月13日 、主に放射状であることが流体の流れを強制的に、非多孔室に非多孔板を使用してロードされます。インデントは、軟骨12-13の生体力学的特性を評価するために最も頻繁に使用される方法です。それは、テストされている試料の表面よりも小さな圧子、から構成され、それは、試料上にダウンします。くぼみは、くぼみをその場で行うことができるという事実を含む圧縮の他の方法に比べて多くの利点を有する、enabli複数の生理的（ 図1）12 月13日であることをテストngの。 組織の圧縮および引張特性を理解するために、ヤング弾性率は、典型的には、試料サイズ12にかかわらず、圧縮または張力弾性抵抗を示す応力-ひずみ曲線の直線部分を分析することによって計算されます。引張および圧縮試験体制の両方が負荷や変形適用され、そのようなパラメータの両方の速度に応じて変化することができます。現在のところ、それは非常に困難解釈または異なる研究6-13からの結果を比較することができている、組織力学を評価するために、多くの異なる試験プロトコルが存在します。さらに、多くの機械的な方法は、現在の破壊に試料を試験することにより、組織の機械的特性を特性に焦点を当てます。 私たちは、人間の直接、非破壊比較を提供インデントと引張プロトコルを実証することを目指して軟組織と組織工学構築物。 我々はまだ、まだストレスに機械的なテストを制限し、圧縮と引張りヤング弾性率を取得する方法を示しています。サンプルは、一定の値に張力または圧縮のいずれかで強調され、選択された応力値に達した後、サンプルは、すべてのデータが記録されている間、リラックスさせます。この方法は、合成材料に直接適用することができるのと同じ試験、内の組織の粘弾性とリラクゼーション特性の両方をキャプチャします。我々は、インデントプロトコルを使用しています 皮膚や軟骨14-16を含むヒトの軟組織を、評価します。軟骨は、押込み試験を用いて評価され、皮膚を緊張14-16のテストを用いて評価されます。研究者は、これらのプロトコルを実装することを検討可能性があり、人間の軟部組織に似た特性を有する材料を設計することを目指して。

<table><tbody><tr><td>Digitial Vernier Calipers</td><td>Machine Mart</td><td>40218046</td><td>Digitial vernier caliper is used to measure sample thickness.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Water Bath&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>UY-12504-94</td><td>StableTemp Digital Water Bath Flask Holder used to defrost tissues samples if they are frozen.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mach-1 Material Testing Machine</td><td>Biomomentum&amp;nbsp;</td><td>V500c</td><td>Mechanical Testing Machine used to test the mechancial properties of the tissues.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scalpel Blade&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>233-5335</td><td>Scalpel blades using to cut and dissect the tissues.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>470007-554</td><td>Forceps used to dissect the tissues.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.2</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>20012019</td><td>PBS is used to hydate the tissue samples&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

biomechanical characterization of human soft tissues using indentation and tensile testing

再生医療は、損傷または罹患臓器を交換したり、復元する材料を設計することを目指しています。このような材料の機械的性質は、彼らが交換することを目指しているヒト組織を模倣する必要があります。必要な解剖学的形状を提供するために、材料は、欠陥部位に移植するとき、彼らが経験する機械的な力を維持することができなければなりません。組織工学足場の機械的特性は非常に重要であるが、操作された材料で修復を受け、多くのヒト組織は完全に生体力学的に特徴付けられていません。いくつかの圧縮および引張のプロトコルは、材料を評価するために報告されているが、大きな変動を有することが試験間の結果を比較することは困難です。さらなる研究を複雑にすることは機械的試験の多くの場合、破壊的な性質です。組織障害の理解が重要であるが、よりphysiol下弾性及び粘弾性特性の知識を持っていることも重要ですogical負荷条件。 このレポートでは、人間の軟部組織の圧縮および引張特性を評価するための最小限の破壊的なプロトコルを提供することを目的とします。この技術の例としては、皮膚の引張試験および軟骨の圧縮試験が記載されています。これらのプロトコルは、直接の機械的特性は、天然組織に類似していることを保証するために合成材料に適用することができます。プロトコルは、適切な組織工学代替物を作成することによってベンチマークを可能にする人間の天然組織の機械的特性を評価します。

図4および図 5は、インデントと引張試験を介して得られたデータの例を提供します。 図4は、ヒト軟骨押込み試験後に得られた代表的な値を示しています。 図4Aは、押込み試験後に得られた典型的なひずみ対ストレスプロットの例です。直線カーブフィットは0.98（ 図4B）の最小R値を有するまで、ヤング率を得るために、すべての値が含まれています。 m値はMPaでのヤング率の指標です。例えば、このデータには、軟骨は1.76メガパスカルの弾性率を有します。 図4Cは、軟骨の緩和特性を評価するための時間に対するストレスの典型的なプロットを示しています。緩和の速度は、最後の200秒から計算されます。同様に、緩和の速度を得るために、MPaでの直線カーブフィットのm個の値が使用されます。例えば、このデータには、軟骨の速度を有します8.78×10 -6 MPaの/ sの（ 図4D）の緩和。緩和の絶対的な最終レベルはMPaでのストレスの最終点です。たとえば、このデータセットでは、緩和の絶対的な最終レベルは0.028メガパスカル（ 図4D）であろう。 図5は、引張試験後の皮膚組織の粘弾性を評価する方法を示しています。分析は、圧縮試験に従って行われます。 図5Aは、引張試験プロトコルから得られる典型的な歪み対ストレスプロットを示しています。直線カーブフィットは0.98（ 図5B）の最小R値を有するまで引張りヤング率を得るために、すべての値が含まれています。 m値はMPaでのヤング率の指標です。例えば、このデータには、皮膚が0.62メガパスカルの弾性率を有します。 図5Cは、O緩和特性を評価するために、時間に対する圧力の典型的なプロットを示しますF肌。緩和の速度は、最後の200秒から計算されます。同様に、緩和の速度を得るために、MPaでの直線カーブフィットのm個の値が使用されます。例えば、このデータには、皮膚は、3.1×10 -5 MPaの/秒（ 図5D）の緩和速度を有します。緩和の絶対的な最終レベルはMPaでのストレスの最終点です。例えば、このデータセットにおいて、レベルが0.64メガパスカル（ 図5D）であろう。同様の分析は、次いで天然組織への生体力学的特性に合わせて圧縮及び引張試験の下で生体材料を分析するために利用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig1.jpg" /> 図1： 異なる圧縮方法を説明するための模式図です。 A.インデントのテスト。負荷は、非多孔性圧子を用いた軟骨の小さな領域に適用されます。 B.閉じ込めますD圧縮。軟骨片を通さない液体で満たされたウェルに配置されています。軟骨は、その後、多孔板を介してロードされます。ウェルは不浸透性であることから、軟骨を通る流れは、垂直方向です。 C.一軸圧縮。軟骨は、主に放射状であることが流体の流れを強制的に、非多孔室に非多孔板を使用してロードされます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig2.jpg" /> 図2： 機械的試験機のセットアップ。試験機のA.イラスト 。 B。圧縮試験分析に使用圧子の図。 C.軟骨は圧縮押込み試験を用いて分析されています。 D.皮膚組織は、引張試験で分析されています。合成生体材料のE.引張試験。 F. </stronグラム&gt;合成生体材料の圧縮試験。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig3.jpg" /> 図3： 組織または組織工学構築物の圧縮および引張機械特性を計算するために使用される式。力を計算するために使用される式（N）、応力（MPa）と、歪み（％）。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig4.jpg" /> 図4： 人間の軟骨の圧縮分析の例。 A.ストレス対ひずみ解析。 B.ラインカーブフィット式のm値はMPaでヤング弾性率です。 C.応力対時間分析は、緩和性を実証します。 D.ラインカーブフィット式のm値は、緩和速度を示しています。決勝Absolute率は、グラフ上の最後の点です。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig5.jpg" /> 図5： 人間の皮膚の引張解析の例。 A.ストレス対ひずみ解析。 B.ラインカーブフィット式のm値はMPaでヤング弾性率です。 C.応力対時間分析は、緩和性を実証します。 D.ラインカーブフィット式のm値は、緩和率に相当します。最終的な絶対速度は、グラフ上の最後の点です。

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Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

インデントと引張試験を用いたヒト軟部組織の生体力学的特性評価

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

biomechanical-characterization-human-soft-tissues-using-indentation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

31.3K ビュー.  University College London (UCL). Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

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Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle shells provides unique design principles with potentials for guiding the design of protective materials and systems in the future. Understanding the structure-property relationships for these material systems at the microscale and nanoscale where failure initiates is essential. Currently, experimental techniques such as nanoindentation, X-ray CT, and SEM provide researchers with a way to correlate the mechanical behavior with hierarchical microstructures of these material systems1-6. However, a well-defined standard procedure for specimen preparation of mineralized biomaterials is not currently available. In this study, the methods for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of A. spatula using nanoindentation, FTIR, SEM, with energy-dispersive X-ray (EDX) microanalysis, and X-ray CT are presented.

Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

This paper presents the methods used for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of Atractosteus spatula (A. spatula) using nanoindentation, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM), and X-ray computed tomography (X-ray CT). The experimental results have been used to investigate the design principles of protective biological materials.

多層魚の鱗の特性（<em&gt; Atractosteusヘラ</em&gt;）ナノインデンテーション、X線CT、FTIR、およびSEMを用いて

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

生物工学

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. brain, liver, tendon, fat, etc.) when exposed to high strain rates. This study utilized a Split-Hopkinson Pressure Bar (SHPB) to generate strain rates of 100-1,500 sec-1. The SHPB employed a striker bar consisting of a viscoelastic material (polycarbonate). A sample of the biomaterial was obtained shortly postmortem and prepared for SHPB testing. The specimen was interposed between the incident and transmitted bars, and the pneumatic components of the SHPB were activated to drive the striker bar toward the incident bar. The resulting impact generated a compressive stress wave (i.e. incident wave) that traveled through the incident bar. When the compressive stress wave reached the end of the incident bar, a portion continued forward through the sample and transmitted bar (i.e. transmitted wave) while another portion reversed through the incident bar as a tensile wave (i.e. reflected wave). These waves were measured using strain gages mounted on the incident and transmitted bars. The true stress-strain behavior of the sample was determined from equations based on wave propagation and dynamic force equilibrium. The experimental stress-strain response was three dimensional in nature because the specimen bulged. As such, the hydrostatic stress (first invariant) was used to generate the stress-strain response. In order to extract the uniaxial (one-dimensional) mechanical response of the tissue, an iterative coupled optimization was performed using experimental results and Finite Element Analysis (FEA), which contained an Internal State Variable (ISV) material model used for the tissue. The ISV material model used in the FE simulations of the experimental setup was iteratively calibrated (i.e. optimized) to the experimental data such that the experiment and FEA strain gage values and first invariant of stresses were in good agreement.

The current study prescribes a coupled experiment-finite element simulation methodology to obtain the uniaxial dynamic mechanical response of soft biomaterials (brain, liver, tendon, fat, etc.). The multiaxial experimental results that arose because of specimen bulging obtained from Split-Hopkinson Pressure Bar testing were rendered to a uniaxial true stress-strain behavior when simulated through iterative optimization of the finite element analysis of the biomaterial.

ソフトバイオマテリアルの高ひずみ速度機械的応答を評価するための結合実験、有限要素モデリング手法

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

工学

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

神経科学

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

生物学

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

早期変形性関節症の検出に対する原子間力顕微鏡の応用

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Viscoelastic Characterization of Soft Tissue-Mimicking Gelatin Phantoms using Indentation and Magnetic Resonance Elastography

Characterization of biomechanical properties of soft biological tissues is important to understand the tissue mechanics and explore the biomechanics-related mechanisms of disease, injury, and development. The mechanical testing method is the most straightforward way for tissue characterization and is considered as verification for in vivo measurement. Among the many ex vivo mechanical testing techniques, the indentation test provides a reliable way, especially for samples that are small, hard to fix, and viscoelastic such as brain tissue. Magnetic resonance elastography (MRE) is a clinically used method to measure the biomechanical properties of soft tissues. Based on shear wave propagation in soft tissues recorded using MRE, viscoelastic properties of soft tissues can be estimated in vivo based on wave equation. Here, the viscoelastic properties of gelatin phantoms with two different concentrations were measured by MRE and indentation. The protocols of phantom fabrication, testing, and modulus estimation have been presented.

This article presents a demonstration and summary of protocols of making gelatin phantoms that mimic soft tissues, and the corresponding viscoelastic characterization using indentation and magnetic resonance elastography.

インデンテーションと磁気共鳴エラストグラフィを用いた軟組織模倣ゼラチンファントムの粘弾性特性評価

Characterization of biomechanical properties of soft biological tissues is important to understand the tissue mechanics and explore the ...

Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the biological field. However, as with any other microscopic approach, methodological challenges can arise. In particular, the characteristics of the sample, sample preparation, type of instrument, and indentation probe can lead to unwanted artifacts. In this protocol, we exemplify these emerging issues on healthy as well as osteoarthritic articular cartilage explants. To this end, we first show via a step-by-step approach how to generate, grade, and visually classify ex vivo articular cartilage discs according to different stages of degeneration by means of large 2D mosaic fluorescence imaging of the whole tissue explants. The major strength of the ex vivo model is that it comprises aged, native, human cartilage that allows the investigation of osteoarthritis-related changes from early onset to progression. In addition, common pitfalls in tissue preparation, as well as the actual AFM procedure together with the subsequent data analysis, are also presented. We show how basic but crucial steps such as sample preparation and processing, topographic sample characteristics caused by advanced degeneration, and sample-tip interaction can impact data acquisition. We also subject to scrutiny the most common problems in AFM and describe, where possible, how to overcome them. Knowledge of these limitations is of the utmost importance for correct data acquisition, interpretation, and, ultimately, the embedding of findings into a broad scientific context.

We present a step-by-step approach to identify and address the most common problems associated with atomic force microscopy micro-indentations. We exemplify the emerging problems on native human articular cartilage explants characterized by various degrees of osteoarthritis-driven degeneration.

原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

<meta charset="utf8"></head><body>外植片モデルを用いた骨形成のマルチモーダル解析

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous modalities that are currently available for analysis. Here, we propose a workflow for a comprehensive evaluation of new bone formation using a relevant large animal osseous ex vivo explant. A bone defect (diameter = 3.75 mm; depth = 5.0 mm) is created in an explanted sheep femoral head and injected with a macroporous bone substitute loaded with a pro-osteogenic growth factor (bone morphogenetic protein 2 - BMP2). Subsequently, the explant is maintained in culture for a 28-day period, allowing cellular colonization and subsequent bone formation. To evaluate the quality and structure of newly mineralized tissue, the following successive methods are set up: (i) Characterization and high-resolution 3D images of the entire explant using micro-CT, followed by deep learning image analyses to enhance the discrimination of mineralized tissues; (ii) Nano-indentation to determine the mechanical properties of the newly formed tissue; (iii) Histological examinations, such as Hematoxylin/Eosin/Saffron (HES), Goldner's trichrome, and Movat's pentachrome to provide a qualitative assessment of mineralized tissue, particularly with regard to the visualization of the osteoid barrier and the presence of bone cells; (iv) Back-scattering scanning electron microscopy (SEM) mapping with internal reference to quantify the degree of mineralization and provide detailed insights into surface morphology, mineral composition, and bone-biomaterial interface; (v) Raman spectroscopy to characterize the molecular composition of the mineralized matrix and to provide insights into the persistence of BMP2 within the cement through the detection of peptide bonds. This multimodal analysis will provide an effective assessment of newly formed bone and comprehensive qualitative and quantitative insights into mineralized tissues. Through the standardization of these protocols, we aim to facilitate interstudy comparisons and improve the validity and reliability of research findings.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:骨再生研究における組織石灰化の特性評価のための高度な技術

The proposed protocol entails a global approach to assess bone formation in the context of bone regeneration using multimodal analyses. It aims to provide qualitative and quantitative information on new bone formation, enhancing the rigor and validity of basic and pre-clinical investigations.

インデントと引張試験を用いたヒト軟部組織の生体力学的特性評価

要約

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多層魚の鱗の特性（