This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

リポソームおよびプロテオリポソー​​ムの調製<ol><li>リポソーム生成<ol><li>ガラスシリンジを使用して、POPCのモル比で52.5モル脂質を得るために、丸底フラスコに（クロロホルム中、25 mg / mlで）および160μlのPOPG（クロロホルム中、25 mg / mlで）1,435μlのPOPCを追加：POPG = 9：1。 </li><li> （何の水浴を溶媒のこのボリュームのために必要とされていない）145回転の回転速度で回転蒸発器を用いて30分間、脂質を乾燥させ、次いで、室温で、一晩、少なくとも3時間、または真空デシケーターにフラスコを転送（RT）。 </li><li>穏やかに均質な、濁った懸濁液が得られるまで、フラスコを旋回することによって、50mMのHEPES pH7.4中、100mMのNaCl（以下、緩衝液Aと称する）の10mlの乾燥した脂質フィルムを水和。 注：この段階で脂質濃度は、全く損失がこれまでに発生していないはずですとして5.25 mMのことが予想されます。 </li><li>周波数Oで室温で10分間水浴中懸濁液を超音波処理40 kHzのF。解決策は、やや明確になります。 </li><li>押出機を用いて、200 nmの細孔サイズを有する膜を介して4パスで押し出しの第2サイクルに続いて、400 nmの細孔サイズを有する膜を通して懸濁液を10回通過します。 注：結果LUVをの平均直径は〜175 nmです。必要であれば、たLUVのサイズおよび均質性は、製造業者の指示に従って、動的光散乱によって確認することができます。 </li><li> 1.2節で説明したように）LUV懸濁液のリン脂質濃度を定量化します。 注：押出時の損失のため、濃度は通常約3.6 mMであるため。 </li><li>すぐに使用しない場合は、約4℃で2週間LUVを保管してください。 </li></ol></li><li>リン脂質定量 注：リン脂質再構成するために使用LUV懸濁液の濃度だけでなく、最終的に生成されたプロテオリポソー​​ムのことを決定するために、試料のアリコートはsubjeです過塩素酸による酸化にCTED。この手順は、その後、標準23と比較して比色アッセイによって定量化された無機リン酸を放出するためにリン脂質を分解します。 <ol><li>脱イオン蒸留水にリン酸ナトリウム（のNa 2 HPO 4）の40mMのストック溶液を準備します。 </li><li> 4 mMのと校正標準となるソリューションをワーキング0.4 mMのを得るために、脱イオン蒸留水で原液を希釈します。 </li><li>作業溶液を用いて、50μlの最終体積で0から80までの13×100 mm 2のガラス管中で基準nmolのリン酸ナトリウムを調製します。 </li><li> LUVおよびプロテオリポソームサンプルのそれぞれを定量化する10μLを取り、13×100ミリメートル2ガラス管中のddH 2 O40μlので希釈しました。 注：LUVをし、プロテオリポソー​​ムの脂質濃度が範囲内にあるように2.5-5μM、10μlのサンプルは、25-50ナノモル脂質のリンを含むべきです。</li><li>加熱ブロック中で145℃で1時間の標準およびサンプルや熱のそれぞれに300μlの過塩素酸を追加します。蒸発を防ぐために、チューブにビー玉を入れてください。 </li><li>チューブを室温まで冷却してみましょうとのddH 2 Oの1ミリリットルを追加</li><li> 400μlの新たに調製した12グラム/ Lのモリブデン酸アンモニウムと50グラムの各/ミックスするLアスコルビン酸ナトリウムと渦を追加します。 </li><li>チューブの上にビー玉で100℃で10分間加熱します。加熱ブロックからチューブを取り外し、それらを室温まで冷却しましょう​​。 </li><li> 797ナノメートルの波長での分光器でブランク（0 nmolのリン酸ナトリウムを含む標準試料）に対するサンプルの吸光度を測定します。 </li><li>校正標準曲線に対するサンプルのリン酸含量を決定します。 </li></ol></li><li>オプシンの再構成 注：これらは、同様に、界面活性剤の性質に依存するように、再構成のための最適な膨潤条件を決定する必要がありますLUVをの脂質組成や濃度など。 LUVをプロセス膨潤にそれらの光散乱特性を変更するとリゴーとレヴィ24とGeertsma ら 25によってレビューとして吸光度（ 図2）を測定することによってモニターすることができます。 <ol><li>ピペットLUVを800μlの（セクション1.1から、押出成形後の脂質回収率が70％であるとして、LUVをの予測濃度が3.6 mMのリン脂質である）2ミリリットルマイクロチューブに。 </li><li>バッファAの5.3μlを、10％の34.7μlを添加し（w / v）のDDMは、緩衝液Aに溶解しました</li><li>転倒混合しながら室温で3時間インキュベートします。 </li><li>一方、ポリスチレンビーズを準備します。 <ol><li>サンプルあたりのビーズの400ミリグラムを使用し、ガラスビーカー中でそれらを量ります。 </li><li>水、メタノールで二回三回洗っ一度緩衝液Aを用いて、各洗浄工程で使用するための液体を5ml、10分間ゆっくり撹拌します。 注：ポリスチレンを準備することをお勧めします一度に複数のサンプル、 例えばのためのビーズは、ビーズの6グラムで重さと液体の75ミリリットルで洗浄します。過剰のビーズは数日間冷蔵庫で保存することができます。 </li></ol></li><li>サンプルあたり、NBD-PC（クロロホルム中1 mg / mlで、9.5μlのは0.4モル％をもたらす：小胞の不安定化の最後の30分の間、スクリューキャップのガラス管（ &#39;再構成ガラス管&#39;）におけるNBD標識リン脂質を乾燥総リン脂質の）ガラス管に、窒素気流下で乾燥させ、続いて緩衝液A中の0.1％の45μL（w / v）のDDMで溶解</li><li>小胞の不安定化の3時間後、DDM可溶化タンパク質を溶解-NBD標識リン脂質を追加し、1 mlの最終容積は、 すなわち 、7 mMの、DDM（w / v）の0.36パーセントを含有するようにバッファ。 <ol><li>したがって、（0.1％DDMに溶解）NBD-PCの45μlを、0.1％のDDMとバッファAの55μlと60μlを添加（対照サンプルとして使用される）タンパク質を含まないリポソームを生成します。プロテオのための試験のために、追加しますPLE、0.1％DDMで（〜110 ngの/μlでの典型的なストック溶液から）は、タンパク質の40μlを、NBD-PCの45μlを（0.1％DDMに溶解）を、0.1％DDMとバッファAの55μlの20μlの。 注：記載されている添加の順序は次のようになります。 </li></ol></li><li>室温で端部の上に追加の時間の終わりのためのサンプルを混ぜます。 </li><li>準備されたポリスチレンビーズの80ミリグラムを追加し、転倒を室温で1時間混合したサンプルをインキュベートします。 </li><li>次ポリスチレンビーズの追加の160ミリグラムを追加し、転倒を室温でさらに2時間混合しながらインキュベートします。 </li><li>新鮮なポリスチレンビーズの160 mgのガラススクリューキャップチューブに（背後に費やされたポリスチレンビーズを残して）サンプルを移し、4℃で一晩を混ぜます。 注：サンプルを転送し、ビーズを吸い取っ回避する最も簡単な方法は、小さな正の圧力でガラス管の底に押されたパスツールピペットを使用することです。ピペットの先端がでしっかりとしたらチューブの底部は、その後、サンプルは、ビーズからの干渉を受けることなく、容易に取り出すことができます。 </li><li>翌朝は、スクランブラーゼ活性アッセイの準備のために氷の上でビーズや場所に運ぶことなく、マイクロチューブにサンプルを移します。 </li></ol></li></ol> 2.スクランブラーゼ活性アッセイ注：緩衝液Aで希釈したリポソームまたはプロテオリポソー​​ムの蛍光強度は、蛍光分光計で亜ジチオン酸を添加して経時的にモニターされます。安定した開始強度を得るために、蛍光を絶えず撹拌試料に亜ジチオン酸塩を添加する前に、少なくとも50秒（または安定した信号が得られるまで）のために記録され、その後、亜ジチオン酸塩を添加した後、少なくとも500秒間続きます。 <ol><li>ミニ撹拌棒を含むプラスチックキュベットに緩衝液Aの1950μLを加えます。 </li><li>準備されたプロテオ（リポソーム）の50μLを加え、サンプルは蛍光分光で平衡化しましょういくつかの秒間一定に撹拌しながらメートル。 </li><li> 2つの標本がマイクロチューブに亜二チオン20mgを秤量し、使用直前に114μlの氷冷0.5 Mトリスに溶解し、次の氷上に保つために一方0.5 Mバッファなしのトリス（ 例えば、1 M亜ジチオン酸の溶液を調製サンプル）。 注：亜ジチオン酸溶液は新たに調製されなければならないと調製後20分以上を使用するべきではありません。多くの測定が行われるべき場合、ジチオナイトのアリコートを、予め秤量し、使用直前に溶解させることができます。 </li><li> （励起470nmで、発光530nmで幅0.5 nmのスリット）蛍光モニタリングを開始します。 </li><li>記録蛍光（可能であればキュベットチャンバーの蓋にセプタムを使用）を開始した後、キュベット50秒に1 M亜二チオン酸溶液40μlを加え、さらに400から600秒間蛍光を記録し続けています。 </li><li>セクション3で説明したようにデータを分析します。 </li></ol> 3。データ分析<ol><li>スクランブルの速度論<ol><li>初期蛍光を定義することによって、スクランブ活性アッセイによって得られた各試料の蛍光トレースを特徴付ける、F、I、亜ジチオン酸塩を添加すること、およびエンドポイント蛍光Fは、到達する前に&gt; 400秒後。 F iは 、前の亜ジチオン酸の添加30秒の期間についての蛍光の平均値として、各サンプルについて決定されます。 </li><li> 私は 、蛍光減少の程度に対応するエンドポイントデータを決定し、R = 100•F / F。我々はオプシン含有プロテオのためにタンパク質を含まないリポソームおよびR Pのための用語のR Lを使用します。 </li></ol></li><li>機能的に再構成スクランブラーゼの分子量を測定します<ol><li>蛍光減少データは、以下の式に従って変換します。 P（≥1スクランブ）=（R P - R L）/（R 最大 -のR L）（式1） 注意：R maxは 、十分なタンパク質が試料中のすべての小胞は、少なくとも一つの機能スクランブを有するように再構成されたときに得られる最大の減少であり、pは、再構成された試料中の特定の小胞は、「スクランブ活性」される確率である場合、 すなわち 、それは、少なくとも1つの機能スクランブを有しています。 R maxは、（R maxは実験的&gt;に1mg /ミリモルのPPRとオプシンプロテオのために決定することができる）の代わりに期待100％で、一般的に82.5パーセント3であるのに対し、R Lの値は、一般的に45％3です。 R maxと&lt;100％は、小胞の亜集団は、再構成に対して不応性であることが想定されます。 R 最大 = 82.5パーセントのために、タンパク質を受け入れることができない小胞の割合は0.35です。 </li><li>次のようにポアソン統計によりp（≥1スクランブラーゼ）およびPPR（mgタンパク質/ミリモルのリン脂質）との関係を説明します。 P（≥1スクランブ）= 1 - 電子<sアップ&gt; -m = 1 - EXP（-PPR /α）（式2） 注：ここで、M =小胞あたりscramblases数およびmgタンパク質/ミリモルのリン脂質の単位でα=単一指数フィット定数。 </li><li>小胞の割合としては、（説明を参照）でも高いPPRでスクランブルに寄与しないに式を変更します。 P（≥1スクランブ）= 1 - expの（-PPR * /α）（式3） 注：PPR * = PPR /（1- f）は 、fは小胞の耐火集団であるか、この場合には、PPR * = PPR / 0.65（式4）。 注：適合定数αは単一指数関数とPPR *に対するP（≥1スクランブ）のグラフをフィッティングすることによって決定されます。オプシン（分子量41.7キロダルトン）は機能的に175 nmの直径の小胞に再構成する場合は、モノマーとして、α= 0.187ミリグラムミリモル-1（各小胞は28万リン脂質26を有しています）。スクランブラーゼ活性の小胞を得るために3を再構成のためにオプシンの二量化は、従来であれば、その後α= 0.37ミリグラムミリモル-1。 PPRはなくPPR *は、分析のために使用された場合には、対応するαの値は、0.122と0.244ミリグラムミリモル-1です。 αのためのこれらの予測値は、すべてのオプシン分子が機能的に有能であることを前提としています。分子の一部のみが、脂質をスクランブルする能力である場合、αの対応する値が大きくなります。 </li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter.">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li><li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p,+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast.">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

スクランブラーゼ活性アッセイは、オプシンは、リン脂質スクランブラーゼ活性2を持っているかを決定するために、もともと私たちを可能にしました。アッセイはまた、（私たちは、図1AにNBD-PCのために示すように、アシル鎖にNBDで標識されたようなNBD-ホスファチジルエタノールアミンなどのNBD標識化レポーター脂質、さまざまなを使用、または上で私たちは、特異性?...

光受容体ロドプシン、（参照1、例えばレビュー）プロトタイプのGタンパク質共役型受容体は、同定され、生化学的に2,3を検証するための最初のリン脂質スクランブラーゼです。 Scramblasesは、双方向、ATPに依存しない方法4-6で二層間のリン脂質の動きに、生理学的に適切なレベルの本質的に遅い速度を向上させるリン脂質トランスポーターです。彼らの行動の例としては、小胞体および構成スクランブリングは、膜の恒常性と成長のためだけでなく、グリコシル化経路5の様々なために必要とされる細菌の細胞質膜で見つけることができます。規制リン脂質スクランブリングは、それが、マクロファージ7は、「食べる・私」-signalとして作用し、タンパク質因子の産生を触媒する活性化血小板の凝血促進表面を提供する、アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリン（PS）を露出させるために必要とされます血液凝固に必要なのです。感光ディスク膜に、ロドプシンのスクランブル活性は、ATP依存性により生成される二重層の二つの膜リーフレットの間のリン脂質の不均衡を相殺することが提案されている、一方向性脂質は、ABCA4 4,8,9 10-12フリッパーゼ。 ロドプシンは、原形質膜でのPS露出のために必要2+依存性scramblasesが（参照して見直さ2、TMEM16タンパク質ファミリーのメンバーは、Caとして同定された感光体ディスクでスクランブラーゼとして報告されるまでscramblasesの生理学的重要性にもかかわらず、彼らのアイデンティティはとらえどころのないままでした13）、および細菌タンパク質FTSWは、ペプチドグリカン合成14のために必要な脂質IIスクランブとして提案されました。これらの発見は、方法論のdescribを使用して、得られたプロテオにおけるリポソーム及びスクランブ活動のデモンストレーションで精製されたタンパク質の再構成に基づいていましたここ編。他の潜在的なscramblases 15-21 -ペプチドグリカン生合成に関与MurJとAMJタンパク質、WzxEとO抗原前駆体をスクランブリングに関与し、関連するタンパク質、細菌の細胞質膜を横切ってアミノアシル化ホスファチジルを移行することが必要なMprFタンパク質、および提案されているXkr8ファミリーメンバーアポトーシス細胞の表面上にPSを露出させるためには、 - 生化学的に試験されていません。これは、スクランブ活動を識別し、特徴付けるための堅牢なアッセイの重要性を強調しています。 ここでは、精製されたオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質、大型単層小胞（LUVを）に、蛍光ベースのアッセイを使用して、得られたプロテオリポソー​​ム内のスクランブ活動のその後の分析の再構成を説明します。いくつかのよく記載されているプロトコルは、したがって、私たちはしません、オプシンの異種発現および精製のための文献で利用可能がありますこのプロトコルでそれを記述。我々は約100ngでFLAGタグ、耐熱性オプシン得ゴーレンら 3に記載されたプロトコルを使用/ 0.1％μL（w / v）のドデシルマルトシド（DDM）。 再構成は、彼らが膨潤するが溶解しないように、十分な洗剤でたLUVを処理することにより達成されます。これらの条件下では、膜タンパク質 - タンパク質 - 界面活性剤ミセルの形態で供給される - は、リポソーム内に統合し、プロテオリポソー​​ムを生じ、界面活性剤の除去時にリポソーム膜に再構成となるであろう。 （0.1％（w / v）のDDMで精製タンパク質として得られる）オプシンを再構成するために、たLUVはPOPC（1-パルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン）とPOPGの混合物（1-から調製されますパルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3- [ホスホrac-（1-グリセロール）]）とオプシンとNBD-PCを追加する前に、DDMで飽和。界面活性剤は、その後、ポリスチレンビーズとサンプルを処理することによって除去されます。 LASS = &quot;jove_contentは&quot;&gt;蛍光ベースのアッセイの基礎となる原理は、図1Bに示されています。 LUVをは対称的にNBD-PCまたは他のNBD標識蛍光リン脂質レポーター（ 図1A）の微量で再構成されています。ジチオナイトを追加することで、NBDのニトロ基のような膜非透過性ジアニオン、LUVをの外側のリーフレットにおけるNBD-PC分子がレンダリングされる非蛍光は、非蛍光アミノ基に還元されます。 NBD-PC分子もジチオンいずれも実験（&lt;10分）の時間スケールで膜を通過することができるように、これは、蛍光シグナルの50％の減少をもたらします。リポソームをスクランブで再構成されている場合は、内部リーフレットにおいてNBD-PCの分子は、それらが低減されている外部に迅速にスクランブルすることができます。これは、理想的な場合（ 図1C）における蛍光の総損失をもたらします。 エス/ ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：スクランブラーゼ活性アッセイの概略図アッセイは、蛍光NBD標識化レポーター脂質を使用しています;。 NBD-PCが示されている（A）。大型単層小胞は、NBD-PCの微量で再構成されています。再構成は、外側と内側のリーフレットに均等に分配NBD-PCで、対称的な小胞を生成します。亜ジチオン酸（S 2 O 4 2-）は 、化学的に非蛍光アミノ基とNBDのニトロ基を低減します。ジチオン酸は、負に帯電し、NBD-PCの分子と反応する膜を通過することはできません：外葉で唯一のNBD-PC分子が低減されるので、ジチオナイト（B、上）とのタンパク質を含まないリポソームの治療は、蛍光の50％の減少を引き起こします内側のリーフレットインチオプシン含有プロテオリポソーム（B、下）、 すなわち 、スクランブラーゼ活性のプロテオリポソーム、Fの100％損失の結果の亜ジチオン治療オプシンとしてluorescenceは、内側と外側のリーフレットの間NBD-PCの移動を容易にします。 （C）は、亜ジチオン酸でタンパク質を含まないリポソームとオプシン含有プロテオリポソームを処理して得られた理想化された蛍光トレースを示します。蛍光損失率は、亜ジチオン酸によるNBDの化学的還元は、スクランブリングは、化学反応の速度以上の速度で発生し、その律速であることを示す両方の場合で同じです。実際の実験から得られたトレースを図3に示す。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 我々が説明した方法は、他の精製されたタンパク質、ならびに界面活性剤22とミクロソームを抽出することにより、例えば、得られた膜タンパク質の混合物を再構成し、アッセイするために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorimeter cuvettes</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>cuvettes</td></tr><tr><td>Spectrofluorometer</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorimeter</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrosulfite technical grade, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>dithionite</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 software</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml extruder&amp;nbsp;</td><td>Northern Lipids, Inc.</td><td></td><td>Extruder</td></tr><tr><td>Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Disc support</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 &amp;micro;m, 25 mm diameter</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm membrane</td></tr><tr><td>Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 &amp;micro;m, 25 mm diameter</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm membrane</td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>glass tubes</td></tr><tr><td>Perchloric acid</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>ammonium molybdate</td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>sodium ascorbate</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbents</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>polystyrene beads</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2.0 ml Microtubes clear</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Reconstitution tubes</td></tr><tr><td>Reconstitution glass tube</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Reconstitution glass tubes</td></tr><tr><td>Zetasizer&amp;nbsp;</td><td>Malvern&amp;nbsp;</td><td></td><td>DLS</td></tr></tbody></table>

a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity

Scramblasesは、ATP非依存的に双方向膜二重層を横切ってリン脂質を移動さ。識別され、生化学的に検証された最初のスクランブラーゼはオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質でした。ロドプシンは、光の知覚の原因である網膜の桿体ディスク膜に局在するGタンパク質共役受容体です。ロドプシンのスクランブ活動、 すなわち 、そのリガンド11- シス -レチナールに依存しない、アポタンパク質オプシンは、スクランブラーゼとしても活躍。スクランブリング構成および調節リン脂質は、細胞生理学において重要な役割を果たしているが、わずか数リンscramblasesこれまでオプシン他に特定されています。ここでは、オプシンのスクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイを記載しています。オプシンは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及び蛍光NBD標識PCの微量（1-Pで構成される大単層リポソームに再構成され、almitoyl -2- {6- [7-ニトロ2-1,3ベンゾオキサジアゾール-4-イル）アミノ]ヘキサノイル} - SN -glycero -3-ホスホコリン）。スクランブラーゼ活性は、小胞の内部小葉に位置NBD-PCの分子はその蛍光が化学的に膜を通過することができない還元剤によって除去される外層にアクセスすることができる程度を測定することによって決定されます。我々が説明した方法は、一般的な適用性を有しており、他の膜タンパク質のスクランブ活動を特定し、特徴付けるために使用することができます。

我々は、蛍光ベースのアッセイを使用して、そのスクランブ活動を特徴づけるためたLUVへオプシンの再構成を説明します。私たちは、スクランブルオプシン媒介リン脂質の速度に下限を配置するとオプシンは、機能的に小胞に再構成したオリゴマー状態を決定するために、結果を分析します。 最適な再構成条件を特定す?...

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A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K ビュー.  Weill Cornell Medical College. We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin. 

ビデオ: A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

生化学

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. Alternatively, other (phospho)lipases may be physically associated with the producing organism causing a turnover of intrinsic lipids and frequently giving rise to a remodeling of the cellular membranes. Although potential (phospho)lipases can be predicted with a number of algorithms when the gene/protein sequence is available, experimental proof of the enzyme activities, substrate specificities, and potential physiological functions has frequently not been obtained. This manuscript describes the optimization of assay conditions for prospective (phospho)lipases with unknown substrate specificities and how to employ these optimized conditions in the search for the natural substrate of a respective (phospho)lipase. Using artificial chromogenic substrates, such as p-nitrophenyl derivatives, may help to detect a minor enzymatic activity for a predicted (phospho)lipase under standard conditions. Having encountered such a minor enzymatic activity, the distinct parameters of an enzyme assay can be varied in order to obtain a more efficient hydrolysis of the artificial substrate. After having determined the conditions under which an enzyme works well, a variety of potential natural substrates should be assayed for their degradation, a process that can be followed employing distinct chromatographic methods. The definition of substrate specificities for new enzymes, often provides hypotheses for a potential physiological role of these enzymes, which then can be tested experimentally. Following these guidelines, we were able to identify a phospholipase C (SMc00171) that degrades phosphatidylcholine to phosphocholine and diacylglycerol, in a crucial step for the remodeling of membranes in the bacterium Sinorhizobium meliloti upon phosphorus-limiting conditions of growth. For two predicted patatin-like phospholipases (SMc00930 and SMc01003) of the same organism, we could redefine their substrate specificities and clarify that SMc01003 is a diacylglycerol lipase.

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

生物工学

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

生物学

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

神経科学

pH Modulation Assay on Supported Lipid Bilayers to Detect Protein-Phosphoinositide Interactions

Source: Shengjuler, D., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55869">PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate protein-phosphoinositide interactions in a microfluidic pattern using the pH modulation assay, using pH-sensitive fluorescent dye tagged to phosphatidylethanolamine lipid of a supported lipid bilayer, called a microfluidic platform. The modulations in pH after protein binding to phospholipid cause fluorescence quenching.

リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

要約

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この動画の章

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合

タンパク質-ホスホイノシチド相互作用を検出するための担持脂質二重膜のpH調節アッセイ

リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

要約

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新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

タンパク質-ホスホイノシチド相互作用を検出するための担持脂質二重膜のpH調節アッセイ

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合