Name: preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
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We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

健康な男性ドナーからの末梢血を、インフォームドコンセントとセントロ・デ・InvestigaciònアンDinámicaCelular-大学自治デルエスタード・デ・モレロスの生命倫理委員会の承認を得ました。 1.単離およびヒトナイーブCD4 + T細胞の活性化<ol><li>インフォームドコンセントを通して健康なヒトのドナー由来の末梢血の2ミリリットルを採取し、滅菌PBS-EDTAの2ミリリットル（1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、2 mMのEDTA、pH7.4）で希釈しました。以前に8に記載されているように 1.077密度のショ糖溶液3mlの上にゆっくりと希釈した血液を追加します。 注：密度の違いによる遠心分離中差動移行は、赤血球を完全に沈殿させますと低密度の単核細胞の層は、上記形成します。末梢血2mlをpurificati後、約0.5×10 6のナイーブCD4 + T細胞をレンダリングします手順について。 </li><li>ノーブレークで21°C（30mmの固定角丸底チューブに使用ローター）で250×gで遠心分離を30分間は、末梢血単核細胞（PBMC）の勾配を生成します。遠心分離後、PBMCを明らかに白色リングとして観察することができます。ピペットでのPBMCを収集し、洗浄のために滅菌チューブに移します。 </li><li> 10分間、250×gでPBS-EDTA溶液で3回洗浄した後、ナイーブCD4 + T細胞の精製に進みます。選別方法または精製キットのいくつかのタイプは、この目的のために利用可能です。好ましくは、精製のために&gt; 1×10 7のPBMCを使用します。 <ol><li>磁気ビーズによるネガティブ選択によりナイーブCD4 + T細胞を精製します。抗CD45RO、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD56、CD123、抗TCRγ/δ、抗HLA-DR、及びCD235a（グリコホリンA）抗体を用いて負の選択を行います。 Fを介してCD4 + CD45RA +細胞を決定することにより、純度の割合を評価します低フローサイトメトリー。 注：必要に応じて、単球の接着を促進し、ナイーブCD4 + T細胞の精製を継続する添加培地10mlに1×10 6細胞/ mlの密度で37℃、5％CO 2で一晩のPBMCのインキュベーションに進みます。末梢血からのナイーブCD4 + T細胞の効率的な回収、精製システムに大きく依存します。 </li></ol></li><li> 5μg/ mlの抗CD3モノクローナル抗体を用いてPBSのウェルあたり250μLを添加することによって、24ウェル細胞培養プレートを準備し、37℃で少なくとも2時間インキュベートします。 注：ナイーブCD4 + T細胞からのより少ない数（ 例えば、2×10 4〜1×10 5）を使用するときに96ウェルを有するプレートを使用することができます。 </li><li> 24ウェルまたは96ウェルプレートからの抗CD3抗体希釈を削除して、滅菌1×PBSを用いて二回プレートを洗浄します。 </li><li>純度&gt; 95％のナイーブCD4 + T細胞を希釈（CD4 +ウシ胎児血清3％を補充した高度なRPMI 1640培地中で1×10 6細胞/ mlの密度にCD45RA +）が（またはRPMI血清の10％）、2mMグルタミンおよび抗生物質（1 U / mlペニシリン、1を補充しました/ mlのストレプトマイシン）。 注：ガングリオシドの局在化​​はPBMCにおいて必要とされている場合は、以下に説明するように、希釈および刺激のために同じプロトコルに従ってください。 </li><li>抗CD3コーティングしたウェルに、24ウェルプレート中の非被覆ウェル（コントロール細胞）に細胞希釈の500μlのを追加します。代わりに、96ウェルプレートのウェルに細胞希釈液100μlを追加します。 </li><li>抗CD28抗体を1μg/ mlで添加することにより、抗CD3コーティングされたウェル中のナイーブCD4 + T細胞の刺激条件を完了します。 </li><li>抗CD28抗体を添加することなく非被覆ウェル中のコントロールとして、休止CD4 + T細胞を保管してください。 37°の標準条件下で0〜72時間、休止および活性化CD4 + T細胞をインキュベートC、5％CO 2。 </li><li> 37℃でインキュベートしたナイーブCD4 + T細胞を休止中のCD69早期活性化マーカー（16時間後に活性化）またはCD25後期の活性化マーカー（48時間後に活性化）の発現をフローサイトメトリーによって評価し、活性化され、適切な活性化を確認するにはおよび抗CD3 / CD28抗体9,10の非存在下または存在下で、5％CO 2。 </li></ol> 2.安静時の付着と活性化ナイーブCD4 + T細胞<ol><li>少なくとも15分間、オートクレーブ処理、UV光露光によって12ミリメートルラウンドカバースリップを滅菌します。 </li><li>滅菌24ウェル細胞培養プレートにカバースリップを置きます。 注：以下、1×10 5細胞と培養のためには、カバーガラスに細胞の分散を防止するようになって小さなウェルを有するスライドチャンバーを使用することが好ましいです。 </li><li>被覆カバースリップポリ-L-リジン200μlで（またはスライドチャンバー）（MW 150~300キロダルトン）、0.1％（w / v）の溶液とは、rで5分間インキュベートOOM温度（RT）は、室温で少なくとも1時間除去し、乾燥しました。 </li><li>注意深く混合し、24ウェルプレートの休止及び活性化されたナイーブCD4 + T細胞を収集します。必要に応じて、ポリ-L-リジンコートしたカバースリップに1×10 5個の細胞を転送するために、新鮮な補充培地で調整した細胞をカウントします。 37°Cの 、5％CO 2で6時間の最小値のための細胞をインキュベートします。 </li></ol> 3.ナイーブCD4 + T細胞を収集し、安静時の固定および活性化<ol><li>慎重に培養した休息から培地を除去し、ナイーブCD4 + T細胞を活性化しました。 </li><li>ゆっくりRT滅菌PBS500μlのを追加します。 注：慎重に加え、ウェルからの溶液の除去は、カバーガラスからの細胞の剥離を防ぐことができます。 </li><li> PBSを捨て、完全に培地を除去するために、別の500μlのPBSを追加します。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド（FILTフィルタリングを500μlの添加により細胞を固定飼料を4℃で好ましい）または一晩（顕微鏡分析を妨害し得る微粒子を除去）し、室温で30分間インキュベートします。 注意：パラホルムアルデヒドは毒性と揮発性化合物です。人間の発癌物質であることが知られています。適切な安全プロトコルで慎重に使用してください。 </li><li>固定液を取り出して、室温でPBSで少なくとも2回以上洗います。 </li><li>次のステップに進むか、染色するまで数日間4℃で500μlのPBSでプレートウェルを維持します。 注：このプロセスの間に無菌性は、微生物の増殖を防ぐことができます。 </li></ol> 4.染色、共焦点顕微鏡によってマウントと可視化<ol><li>井戸からPBSを削除してください。冷たいブロッキングバッファー（1×PBS、0.5％標準グレードのウシ血清アルブミン、1％ウシ胎児血清のpH 7.4）500μlのを追加します。氷上で20分間インキュベートします。 </li><li>慎重にブロッキング緩衝液を除去し、一次抗体を追加（抗ガングリオシドGD3クローンR24を、GD2クローン14G2a）、PE結合抗CD25およびAPC結合抗TCRと2.5μgの/ mlにブロッキング緩衝液中に希釈したコントロールをアイソタイプ。 </li><li>氷の上または一晩4℃で2時間インキュベートします。 注：スロー軌道攪拌が望ましいです。 </li><li>慎重に抗体を外し、ゆっくりと500μlのPBSを追加します。二回繰り返します。 </li><li>二次抗体を0.1μg/ mlにブロッキング緩衝液中に希釈した（R24抗GD3、アレクサフルオロ14G2a抗GD2のための488結合またはアレクサフルオロ647結合抗IgG2aのためのFITC結合抗IgG3の）を追加します。 </li><li>振盪せずに暗所で氷上で1時間インキュベートします。 </li><li> 4.4に記載のように）PBSで3回洗浄します。サンプルの脱水を避けるために十分なPBSでウェルを保管してください。 </li><li> 0.1μgの/ mlにPBSで希釈ヘキスト333258汚れを追加します。 </li><li> RTで15分間インキュベートし、削除します。 PBSで3回洗浄します。 </li><li>ペーパータオル上でスライドを置き、マウントソリューション（PBS中50％グリセロール）又は商業取り付け溶液20μlを追加フェージングやサンプルから急冷避けるためです。 </li><li>慎重に細かいピンセットでカバースリップをピックアップしてマウントソリューションの上に置きます。細胞が接続されているカバーガラスの側面が溶液に接触していることを確認してください。マニキュアでカバーグラスをシールし、蛍光または共焦点顕微鏡を用いて分析します。 </li></ol> RNAの単離5. <ol><li>抗CD3抗体（5μg/ ml）コーティングした96ウェルプレートを準備します。刺激を完了するために、4×10 4ナイーブCD4 + T細胞/ウェルで抗CD28抗体（1μg/ ml）を補充した培養培地100μlをインキュベートします。 0〜72時間37℃でインキュベートし、5％CO 2。 </li><li>別のポスト活性化時間後にマイクロ遠心チューブに細胞を配置します。 </li><li>室温で5分間、250×gで500 PBSμlの遠心分離機を追加します。 </li><li>上清を除去し、1ミリリットルTrizol試薬を追加します。 </li><li> RTで5分間インキュベートし、-80でサンプルを維持します76;少なくとも24時間、C。必要なときにRNA単離に進みます。 注：少なくとも24時間、-80℃でサンプルを残してはRNA収量を向上させます。また、手の手袋の使用は、RNアーゼによるRNAの分解を避けるために不可欠です。 </li><li>水浴中で2分間37℃でインキュベートすることによって試料を解凍。 </li><li> 200μlのクロロホルムを加え、（ボルテックスによりRNAの積極的な混合を避けるために）30秒間手で激しく振ります。 RTで5分間インキュベートします。 </li><li> 4℃で12,000×gで遠心分離15分。 </li><li>新しいマイクロチューブに水相を回復します。 </li><li> 500μlのイソプロパノールを加え、チューブを3回転倒。 </li><li> RTで10分間インキュベートし、4℃で12,000×gで10分間遠心操作します。 </li><li>反転により上清を捨てます。 </li><li> 4℃で12,000×gでの氷冷75％エタノール及び遠心分離機10分の1ミリリットルを追加します。 </li><li>完全に上清を破棄し、開いたチューブのキャップを残してRNAペレットを乾燥させます。 しませんE：この時点でペレットがはっきりと表示されません。とにかく進みます。 </li><li>分子グレードの水20μlにペレットを再懸濁。ナノドロップを用いて260 nmおよび280 nmの吸光度を測定することにより、核酸の濃度および純度を計算します。 </li><li>任意の従来の逆転写キットを用いてmanufacturer&#39;sプロトコールに従って、cDNAの合成に慎重に進みます。 注：約0.5μgのRNAは、4×10 4ナイーブCD4 + T細胞から得られます。 cDNAは、RNAの100ngのより合成し、低RNAインプットキットを必要とすることなく、リアルタイムPCR反応で使用することができます。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

説明されたプロトコルは、少数の細胞から出発したCD4 + T細胞または他の免疫細胞（ 例えば 、のPMBC、 図5）の細胞懸濁液中のガングリオシドまたはタンパク質を局在化するために使用することができます。小さなT細胞の大きさや非接着特性のために、貧しい人々の情報や低品質の蛍光顕微鏡像結果の取得細胞が正常に付着していない場合。 それはにつながる、治療中のガングリオシドの空間的局在とダイナミクス（ 例えば、T細胞活性化を）明らかにするため、良質な共焦点顕微鏡分析と組み合わせたこのプロトコルは、このようなガングリオシドの検出のための薄層クロマトグラフィーなどの技術の使用よりも重要な利点であります生物学的に関連するデータ11,12,13の取得。また、このプロトコルは、ガングリオシド発現の評価は、CD4 + T細胞（2×10 4の数が少ないから開始でき）それは、複製または異なるアッセイ6の数を最適化するために有用です。 接着後の洗浄および抗体染色時の慎重な治療は、細胞数および完全性を維持することが重要です。そのためカバースリップへのCD4 + T細胞の弱い結合のために、慎重にソリューションを追加および削除することも非常に重要です。それ以外の場合は、細胞数と増加した蛍光破片の低下が発生することになります。共焦点顕微鏡法を介して評価した場合、ガングリオシドの免疫染色は、空間的な局在または細胞膜または細胞内区画中の他の分子との共局在化のような追加の情報を与えます。細胞内局在は、細胞内のマーカー14、15を使用する必要があります。また、新鮮で固定されていないCD4 + T細胞は、細胞表面に限定ガングリオシド発現を決定する際に、染色のために使用される必要があります。なお、CD4 + T CEの固定LLSは、透過性と細胞内染色のリスクを運ぶ、少なくとも5日間のサンプルを保存するのに役立ちます。 しかし、ガングリオシドとの間の構造的類似性のため、それを考慮に使用される抗体の特異性を取るために常にことをお勧めします。市販の抗ガングリオシドモノクローナル抗体のいくつかを使用することができ、それらのいくつかのための特異性は、ELISA、TLC など 16,17,18によってプローブされました。 先行研究は、条件6あたり2×10 4細胞/からGD3およびGD2ガングリオシドの局在化および発現に関する情報を得ることが可能であることを示しています。また、このプロトコルは、4×10 4個の細胞から遺伝子プロファイリング実験を行うようなレンチウイルス粒子6に基づくような実験をサイレンシングの最適化を可能にする機能について説明します。

CD4 + T細胞は、抗原提示細胞1による活性化の後、それらのエフェクター機能を介して、免疫応答を調整します。活性化の間に変調された細胞メカニズムの研究は、免疫機能の基本的なプロセスへの洞察を可能にします。それらは血液周辺2のセルの非常に小さな集団を表すしかし、ナイーブCD4 + T細胞の研究では、複雑になることができます。 蛍光顕微鏡を介していくつかの報告は、CD4 + T細胞の活性化に関与する異なる分子、細胞膜3に関連した主にタンパク質の局在を研究しました。ガングリオシドは、スフィンゴ糖脂質を含むシアル酸であり、それらは広く、彼らは豊富にある神経細胞で研究されているが、そのような免疫細胞のような他の細胞もまた、生物学的に関連する機能4,5でガングリオシドを発現します。我々は以前に股関節を報告しましたST8Sia 1（GD3シンターゼ）およびGM2 / GD2シンターゼシアリルトランスフェラーゼα2,8のアップレギュレーションがヒトナイーブCD4 + T細胞の活性化中tは、それは、GD2の著しい表面neoexpression及びGD3ガングリオシド6のアップレギュレーションを誘導します。免疫細胞におけるGD3、GD2およびその他のガングリオシドのさらなる研究は、免疫機能のタンパク質ベースの部分図を補完する必要があります。 一般的に、ガングリオシド発現の研究は、このような薄層クロマトグラフィー（TLC）7などの技術に基づいているが、この技術は、生物学的分析を制限し、原形質膜で、または細胞内区画にガングリオシドの空間的局在を許可していません。 本研究では、抗CD3 /抗CD28活性化後のヒトナイーブCD4 + T細胞およびPBMCにおけるGD3およびGD2ガングリオシドの抗体媒介性の同定および局在化のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルのそれの私とリンパ球の小サイズ（10マイクロメートル）を考慮すると、高品質の画像6を取得して、懸濁液中の細胞の数が少ないにガングリオシドの遺伝子及び分子の発現を分析することも可能です。

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplemented with 3% FBS</td></tr><tr><td>mouse anti human CD3 antibody</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human CD28 antibody</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD3&amp;nbsp; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD2 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a clone</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse IgG3&lt;br/&gt; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek chamber slide system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI and IX81&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

懸濁液中のナイーブCD4 + T細胞の活性化のために本明細書に記載される方法および共焦点顕微鏡分析のためにカバースリップでの付着が、プロファイリング実験その補体の発現はフローサイトメトリーのようなCD4 + T細胞の活性化に関与するガングリオシドの空間的な局在化および可視化を可能にする、西部ブロッティングまたはリアルタイムPCR。フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査を介してそれらの細胞内局在を介しガングリオシド発現の定量化は、高い親和性および特異性を有する抗ガングリオシド抗体の使用によって得ることができます。それにもかかわらず、懸濁液中の細胞の適切な取り扱いは、蛍光または共焦点顕微鏡の取得に必要な必要な接着を促進するための培養プレートの処理を含みます。本研究では、ナイーブCD4 + T細胞の活性化の際にGD3およびGD2ガングリオシドの発現とTCRと共局在を決定するためのプロトコルについて説明します。また、リアルタイムT&lt;40,000細胞を使用してIME PCR実験は、細胞の数が少ないとし、追加の低入力RNAキットを必要とせずに行うことができる遺伝子解析実験を実証し、GD3およびGM2 / GD2合成酵素遺伝子の決意に記載されています。

この原稿に記載されているプロトコルは、培養の良い品質と接着し、休止し、活性化されたヒトナイーブCD4 + T細胞（ 図1）をレンダリングします。活性化CD4 + T細胞は、休止状態（ 図1A）と比較して特徴的な増殖プロフィール（ 図1B）を示します。 CD25後期活性化マーカーは、共焦点顕微鏡（ 図1C）によって観測された72時間で効率的な活性化を評価することは有用です。 CD69マーカーは、現在、フローサイトメトリー、または顕微鏡検査によって早期活性化マーカーとして用いられています。安静時の付着及びポリ-L-リジンでコーティングしたカバースリップにナイーブCD4 + T細胞の活性化は、GD3およびTCRの発現及び局在化を研究するために有用である抗GD3および抗TCR抗体（ 図2）で二重標識によって示されました。我々は以前に報告したように、活性化は、改造を伴っています細胞表面6にGD3およびGD2ガングリオシドのる。さらに、GD3およびGM2 / GD2合成酵素の遺伝子発現の定量は、4×10 4個の細胞から実行される（ 図2及び3）。 GD2ガングリオシドとTCRの共局在のネオ発現は十分に活性化（ 図3）中のTCRクラスタリングにおけるGD2の可能な役割を実証し、共焦点顕微鏡により観察される。 図4を GD3およびGD2ガングリオシドの局在化が活性化CD4で同時に染色を示し+ T細胞。さらに、活性化されたPBMCを、抗GD3と、このプロトコルは、すべての活性化のPMBC（ 図5）において発現されることが見出されたのPMBC、特にGD2に見出される他の免疫細胞集団において使用され得ることを示す抗GD2抗体で染色しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig1.jpg" /> 図1： ナイーブCD4 + T細胞の可視化付着及び効率的な抗CD3 /抗CD28活性化の後の （A）安静時のCD4 + T細胞を、ポリ-L-リジン処理したカバースリップ上に付着した72時間後の活性化における明視野により観察されます。顕微鏡。 （B）ポリ-L-リジン処理したカバースリップ上に付着した72時間後にCD4 + T細胞を活性化しました。 72時間後、起動時の抗CD3 /抗CD28活性化CD4 + T細胞（C）CD25マーカー発現（赤色）およびヘキスト333258染色核（青色）。 =50μmのスケールバー。画像は、デジタル2倍ズーム付き60X S / 1.3油浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡により得られた。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54569/54569fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig2.jpg"/&gt; 図2： 休止中のGD3ガングリオシドとTCR染色および顕微鏡局在および72時間後の活性化にナイーブCD4 + T細胞を活性化した （A）核ヘキスト333258で染色し、（B）GD3ガングリオシド局在化と休息のCD4 + T細胞、（。 C）核とGD3ガングリオシドのマージ。ヘキスト333258で染色した（D）核を有する活性化されたCD4 + T細胞は、（E）GD3ガングリオシド局在及び（F）は、核およびGD3ガングリオシドのマージ。 （G）及び（H）は、ナイーブCD4 + T細胞を休止期にTCRとGD3ガングリオシドを示しています。 （JおよびK）が活性化されたCD4 + T細胞におけるTCRとGD3ガングリオシド染色に相当します。ナイーブCD4 + T細胞（I）の安静時におけるTCR（赤）及びGD3ガングリオシド（緑色）の局在の共焦点画像と抗CD3 / CD28は、ナイーブCD4 + T細胞を72時間後に活性化（L）を活性化。 GD3、TCRおよび核染色は、60X Sと1スタック/デジタル2倍ズームと1.3油浸対物レンズからの共焦点顕微鏡により評価しました。 （M）のグラフは、PCRは、4×10 4の倍数変化休止（REST）及び72時間後の活性化で活性化（ACT）ナイーブCD4 + T細胞として表さリアルタイムによって決定GD3合成酵素の遺伝子発現を示します。データは3つの独立したドナーからの平均±SDである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54569/54569fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig3.jpg" /> 図3： 休憩中のGD2ガングリオシドとTCR染色および顕微鏡局在化および72時間後の起動時にナイーブCD4 + T細胞を活性化しました。 </強い&gt;ヘキスト333258で染色した（A）核とCD4 + T細胞を一休みする、（B）GD2ガングリオシドのローカライズ、（C）核およびGD2ガングリオシドをマージします。ヘキスト333258で染色した（D）核を有する活性化されたCD4 + T細胞は、（E）GD2ガングリオシド局在及び（F）は、核およびGD2ガングリオシドのマージ。 （GとH）は、ナイーブCD4 + T細胞を休止期にTCRとGD2ガングリオシドを示しています。 （JおよびK）が活性化されたCD4 + T細胞におけるTCRとGD2ガングリオシド染色に相当します。共焦点TCRの画像（赤）とGD2ガングリオシド（緑）の局在化ナイーブCD4 + T細胞（I）および抗CD3 / CD28活性化されたナイーブCD4 + T細胞72時間後の活性化（L）を休んインチGD2、TCRおよび核染色をして1スタックから共焦点顕微鏡によって評価しました60X S /デジタル2倍ズームと1.3油浸対物レンズ。 （M）のグラフは、PCRは、4×10 4の倍数変化休止（REST）及び72時間後の活性化で活性化（ACT）ナイーブCD4 + T細胞として表さリアルタイムによって決定GM2 / GD2合成酵素の遺伝子発現を示します。データは3つの独立したドナーからの平均±SDである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54569/54569fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig4.jpg" /> 図4：GD3 およびGD2ガングリオシドの局在化のための抗GD3および抗GD2抗体による二重染色 （A）GD3ガングリオシド活性化CD4 + T細胞におけるR24抗GD3抗体は、細胞内および細胞膜局在を示すと同定しました。 14G2と同定した（B）GD2ガングリオシド活性化CD4 + T細胞における抗GD2抗体は、原形質膜局在を示しています。活性化CD4 + T細胞から（C）明視野顕微鏡。 GD3およびGD2汚れがデジタル2倍ズーム付き60X S / 1.3油浸対物レンズと1スタックから共焦点顕微鏡により評価した。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54569/54569fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig5.jpg" /> 図5： 活性化したPBMCにおけるGD3およびGD2ガングリオシドローカリゼーション （A）GD2ガングリオシドは、明視野顕微鏡、（B）GD2ガングリオシドの発現および（Cと抗CD3 /抗CD28後72時間活性化したPBMCオーバーレイで14G2a抗GD2抗体を用いて検出しました。 ）GD2ガングリオシドと核がマージされます。 （D）GD3 ganglios明とのR24抗GD3抗体オーバーレイで染色したIDE、（E）GD3ガングリオシド発現および（F）GD3ガングリオシドと核がマージされます。 GD3、GD2および核染色は、60X Sと1スタック/デジタル2倍ズームと1.3油浸対物レンズからの共焦点顕微鏡により評価しました。スケールバー=45μmの。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54569/54569fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

我々は、休止中のガングリオシドの膜発現と局在を決定するために顕微鏡で使用するための標準的な抗体染色プロトコルを記述し、ヒトナイーブCD4 + T細胞を活性化します。また、説明&lt;追加の低入力RNAキットを必要としない40,000個の細胞を用いたリアルタイムPCR実験です。

CD4の調製<sup&gt; +</sup&gt;顕微鏡によるGD3およびGD2ガングリオシドの膜発現の分析のためのT細胞

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

8.5K ビュー.  Universidad Autónoma del Estado de Morelos. 我々は、休止中のガングリオシドの膜発現と局在を決定するために顕微鏡で使用するための標準的な抗体染色プロトコルを記述し、ヒトナイーブCD4 + T細胞を活性化します。また、説明

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

生物学

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

免疫・感染学

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

ガングリオシドの抽出、精製、プロファイリング

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

生化学

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

アン<em&gt;体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための&gt;モデル

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

神経科学

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

Source: Fouda, A., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55199">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> J. Vis. Exp., (2017).
This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds&#39; stimulatory and inhibitory effects, respectively.

免疫調節化合物のスクリーニングのための人工リンパ球を用いた蛍光ベースのアッセイ

1. Preparation of Splenocyte Medium and Flow-cytometry Buffer

	Perform all steps under a 70% ethanol-cleaned biological hood.
	Remove 70 mL of pre-warmed ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

特殊なアッセイ

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

Source: Lu, Y., et al.&#160;<a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58087">In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated na&#239;ve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

GM-CSF産生ヘルパーT細胞をナイーブT細胞から分化するためのIn Vitro技術

Source: Lu, Y., et al.&#160;In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) ...

CD4の調製

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