免疫シナプスの出力の研究は、主に顕微鏡的方法に限定されてきた。BSLBは、フローサイトメトリー、顕微鏡、プロテオミクス、RNAシーケンシング技術など、T細胞免疫シナプスの出力を研究するために使用できるツールのレパートリーを拡大しました。そのため、BSLBは、多種多様な免疫学の質問や、T細胞出力の組成および生化学的調節の同定に使用することができる。
これには、例えば、キメラ抗原受容体、特異的シグナル伝達経路を阻害する薬物、または目的の遺伝子の遺伝子アブレーションの研究が含まれる。このプロトコルの最も重要な側面の1つは、目的のシナプス貫通粒子を追跡するために必要なタンパク質較正および多色フローサイトメトリーパネルを最適化することです。これには、タンパク質濃度、抗体濃度、および機器設定の体系的な反復が必要です。
まず、1マイクロリットルのビーズ溶液を1,000マイクロリットルのPBSで希釈します。血球計数器チャンバーを使用してビーズをカウントし、ミリリットルあたりの濃度を計算します。次に、滴定ポイントあたり500,000の最終BSLBに必要なシリカビーズの体積を計算します。
必要量のシリカビーズを滅菌1.5ミリリットルの微量遠心管に移す。シリカビーズを1ミリリットルの滅菌PBSで3回洗浄し、ビーズを遠心分離する。最終12.5モル%のニッケル含有リン脂質を含む3倍量のリポソームマスターミックスを調製する。
リポソームマスターミックスを使用して、洗浄したシリカビーズを再懸濁します。その後、総体積の半分を上下にピペッティングして穏やかに混ぜる。滅菌技術を使用して、アルゴンまたは窒素ガスをチューブに追加して空気を置換し、混合中の脂質を酸化から保護します。
4ミリモルの脂質ストックにアルゴンを加える。ストックを保管し、滅菌技術を用いて操作する。BSLBを垂直ミキサーに移動し、10RPMでの軌道混合を使用して室温で30分間混合する。
その後、ベンチトップ型小型遠心分離機で室温で15秒間遠心分離することによりビーズをスピンダウンする。BSLBs上のNTA部位を飽和させるために、100マイクロモルの硫酸ニッケルを含む5%BSAを1ミリリットル加えることにより、形成されたBSLBをブロックします。HBS-HSA緩衝液を使用して3回洗浄し、余分なブロッキング溶液を除去します。
新しいU底またはV底96ウェルプレートを取り、タンパク質の2倍段階希釈液を調製する。100マイクロリットルのHBS-HSAバッファーに500,000個のBSLBが含まれるように、調製したBSLBを容量に再懸濁する。次に、別のU底またはV底96ウェルプレートを取り、各ウェルが500,000BSBLを受け取るように100マイクロリットルのBSLB懸濁液をウェルに移します。
2 番目のプレートを室温で 300x G で 2 分間スピンダウンします。上清を捨て、100 マイクロリットルの容量のタンパク質滴定プレートから沈降した BSLB を含むプレートに移します。ピペッティング中に過剰な気泡が発生しないように、穏やかに混ぜます。アルミホイルを使用して光から保護し、室温で1,000RPMで30分間インキュベートします。
その後、HBS-HSAバッファーをプレートに添加してプレートを3回洗浄し、洗浄後の細胞を300x G.Countで室温で2分間スピンダウンします。次いで、シナプス転写アッセイ培地を用いてそれらを1ミリリットル当たり250万の終濃度に希釈する。BSLBにタンパク質ミックスをロードしたら、HBS-HSAバッファーでBSLBを2回洗浄して、過剰の結合していないタンパク質を除去します。
ウェルあたり 500, 000 BSLB を 200 マイクロリットルの HBS-HSA バッファーに再懸濁します。ウェルあたり 100 マイクロリットルの BSLB を新しい U 底 96 ウェルプレートに移して複製を作成し、ウェルあたりの BSLB の最終量が 250,000 になるようにします。BSLBを300x Gで室温で2分間スピンダウンします。
上清を捨て、次いで100マイクロリットルのT細胞懸濁液を用いてBSLBを再懸濁する。気泡の形成を防ぐために穏やかに混合する。共培養物を摂氏37度で90分間インキュベートする。
細胞を光から保護し、最初に室温で最低15分間インキュベートすることによって、共培養物を冷却する。共存培養物を室温で500x G.Discardで5分間遠心分離し、上清を捨て、室温で共培養物を室温でカルシウムおよびマグネシウムイオンフリーの2%BSA PBSに再懸濁してブロッキングする。細胞を氷の上に45分間置き、光から保護します。
染色バッファーとして氷冷0.22マイクロメートルろ過した2%BSAおよびPBSを用いて抗体マスターミックスを調製する。このマスターミックスは余分なブロッキングを提供します。共培養物を500x Gで5分間、摂氏4度回転させます。
上清を廃棄し、次いでマルチチャンネルピペットを使用して、最適化された抗体濃度を含む染色マスターミックス中の細胞を再懸濁する。アイソタイプ標識された細胞およびBSLBs、蛍光および非蛍光BSLB、ならびに単独で染色された細胞およびBSLBsが含まれる。ボリュームの半分を上下にピペッティングして優しく混ぜます。
氷上で30分間インキュベートし、光から保護します。細胞とBSLBを氷冷2%BSA PBSを用いて2回洗浄する。500x Gで4°Cで5分間スピンダウンします。
遠心分離後、ウェルの底に沈降した共培養物を確認する。その後、洗浄した共培養物を100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、直ちに取得する。側面散乱ライトの対数スケールと、側面散乱ライトと前方散乱ライトの飛行時間パラメータをアクティブにします。
MESF規格を取得して、薄暗い集団と最も明るい母集団の両方が装置の線形範囲に入るようにします。次に、補正サンプルを取得し、補正を計算し、補正行列を実験に適用します。各定量チャネルについて、合計 20, 000 個の MESF 標準を取得して保存します。
FACSシース液または類似のMESFビーズの再懸濁には、蛍光色素を破壊する塩やアルコールが含まれており、蛍光ピークが広くなり、誤差が大きいため、使用しないでください。ハイスループットサンプラーを使用した集録の場合は、機器集録を標準に設定し、サンプル集録を80マイクロリットルに設定します。毎秒2〜3マイクロリットルのサンプル流量、50マイクロリットルでのサンプル混合量、毎秒150マイクロリットルのサンプル混合、および3〜5ウェルあたりの混合。
サンプルあたり最低 10,000 個の単一 BSLB を取得します。最後に、FCS ファイルをエクスポートします。扁桃B細胞およびヘルパーT細胞の表面上のICAM-1の定量的フローサイトメトリー測定の一例をここに示す。
代表的な画像は、ヒトパラチン扁桃腺から単離された単一のCXCR5 B細胞および濾胞ヘルパーT細胞を分析するためのゲーティング戦略を説明する。このシーケンシャルゲーティング戦略は、連続集録ウィンドウ内の単一のライブイベントを識別します。このダブレットを、集団の関連するアイソタイプで標識したFMO対照およびFMO対照と比較したICAM−1の細胞表面発現を、ここに示す。
MESF集団のオーバーレイされたヒストグラムにおける異なる標準MESF集団からのMFIのゲーティングおよび測定がここに示されている。値は、5 つの MESF 母集団のそれぞれの MFI を表します。ここでは、MESF 集団に対する cMFI に対する MESF の線形回帰を示します。
この傾きは、TFH中の扁桃B細胞の表面上のICAM-1のFCMデータから細胞に結合したMESFを抽出する。絶対分子密度への変換は、これらの単純な数学的操作に従います。代表的な画像は、組換え単量体ICAM−1 12ヒスチジンの密度の増加で再構成されたBSLBsのフローサイトメトリー分析を示す。
測定濃度に対するICAM-1参照濃度の回帰分析をここに示す。傾きは、細胞の密度を達成するためにタンパク質の標的濃度を計算するために使用されます。フロー図は、T細胞をBSLBsと共培養するための重要なステップを示し、フローサイトメトリーによる粒子移動のその後の測定においてモデル膜を再構成する。
連続取得ウィンドウ内で単一のBSLBと細胞を識別するためのゲーティング戦略をここに示します。このプロトコルの最も重要な側面の1つは、結果の再現性を維持するために、タンパク質または脂質ストックを変更するたびに、新しいキャリブレーション分析を実行する必要があることです。異なるT細胞サブセットによって分泌される新しい有効分子を発見するために、BSLBsは、トランスクリプトームおよびプロテオーム分析に供されるように蛍光活性化細胞ソーティングによってさらに単離され得る。
オックスフォード大学の同僚は、この技術を使用して、新しい受容体 - リガンド相互作用を研究および実証し、T細胞免疫シナプスの出力に対する遺伝的アブレーションの影響を研究しました。
