Name: characterizing multiscale mechanical properties of brain tissue using atomic force microscopy, impact indentation, and rheometry
Uploaded: 2016-09-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
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We acknowledge support of this work by the National Multiple Sclerosis Society and Simons Center for the Social Brain. BQ acknowledges support from the U.S. National Defense Science &amp; Engineering Graduate Fellowship program.

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The authors have nothing to disclose.

本論文で各技術は、脳組織の機械的性質の異なる側面を測定します。クリープコンプライアンスと応力緩和弾性率は時間に依存する機械的特性の尺度です。貯蔵弾性率および損失弾性率は、速度に依存する機械的特性を表します。インパクトインデントも速度に依存する機械的特性を測定したが、エネルギー散逸のコンテキストインチ組織の機械的特性を特徴づけるとき、両方のAFM対応インデントおよびレオロジーは、通常の方法を使用しています。前述のように時間に依存する材料特性を提供することに加えて、種々の実験パラメータは、細胞および組織の弾性率4、さらに周波数依存特性24を測定するために使用することができるので、AFM対応インデントは特に有用です。しかし、実験のデータと設計の正確な解釈は準拠して、水和した組織のために挑戦することができます。レオメトリー対策が適切一括ながら組織、AFM-有効インデントの絆は、細胞の微小環境に関連するマイクロスケールのボリュームを検査します。インパクトのインデントは、材料が焦点衝撃による外傷性脳損傷を研究するような用途において有用である濃厚、動的衝撃荷重の文脈に変形する方法を具体的に定量化する手段を提供します。各手法の結果を直接比較することはできませんしながら、以下に説明するように、インパクトのインデントを介して測定エネルギー散逸特性は、レオロジーを介して測定せん断損失弾性率と同じ傾向をたどります。 本明細書に示さ脳組織のAFM対応のインデントでは、クリープコンプライアンスと力の緩和を使用して粘弾性特性を測定しました。そのため、AFMプローブの小規模のため、この技術は、それぞれ、脳梁および皮質（ 図の白と灰白質領域としての脳の解剖学的に異なる領域の機械的特性を測定することができます。4 </stronグラム&gt;）。磁気ねじれサイトメトリー、光ピンセット、およびマイクロレオロジーのような - - 生体試料のマイクロ機械的特性を測定するための他の技術が存在するが、これらの技術はうまく半透明内の光の比較的強い散乱に一部起因した組織サンプルに使用されていません組織。 我々は、このように測定された脳組織の粘弾性挙動が以前エルキン・モリソン26で結果を報告と定性的に類似していることを見出しました。緩和弾性率の測定値の大きさが一致していないが、これは、実験条件の違いによる可能性があります。エルキン＆モリソンは、当社の直径20μmの球に比べて、直径250μmのフラットパンチを使用しています。我々はマウスから得られた脳組織の測定を実施しながら、さらに、エルキン＆モリソンは、ラットの脳組織上で測定を行います。これらの違い、両方の技術のMEASにもかかわらず、脳梁の白質が前頭面における皮質の灰白質よりも低い緩和弾性率を示すことが、より具体的に脳組織内の異種の機械的特性をured、または。 我々がクリープコンプライアンスを計算し、要求されたステップ負荷またはステップのくぼみに応じて緩和弾性率を強制しながら、それぞれ、実験的に作用する荷重とインデントが理想的（瞬時）ステップ関数ではないことに注意することが重要です。ロードおよびくぼみは、短い時間スケール（&lt;1秒）の上に適用され、これらの荷重履歴を測定し、クリープと弛緩反応7,25に影響を与えることができます。クリープコンプライアンス弾性率のわずかな過大評価で適用されるステップ負荷結果を想定しながら具体的に、過小評価緩和弾性率のわずかに適用されるステップインデント結果を仮定。実際と計算された弾性率との間に不一致がランプ速度として減少しますかかる荷重とインデントの増加。 負荷の緩和を行う上で重要なステップは、（ すなわち 、設定値は、加えられた力に直接関係のフォトダイオード電圧に相当）が維持力の適切な大きさを選択します。クリープコンプライアンスのセットポイント力が選択されな​​ければならないように：（1）応答が押し込み深さで容易に測定可能な変化を生じさせるのに十分な大きさです。 （2）設定値の力を維持するのに必要な押し込み深さをAFMカンチレバーのベースの垂直位置を調節するAFMの圧電アクチュエータの範囲の外にドリフトするほど大きくならないように十分に小さいです。提示されたプロトコルでは、我々は我々の実験のためによく働いた5 nNの、の設定値の力を示唆しています。 AFMピエゾが原因で動き、その制限された範囲（ 図4A、挿入図を参照）、その力を維持することができない場合には、その値を下げることができます。この実験的な問題はencountではありませんフィードバックループを介して、安定した計算された押し込み深さを維持する力緩和実験でered。 nanoNewton（NN）規模の部隊とミクロンスケールの深さでの準静的AFM対応インデントとは対照的に、インパクトのインデントは、MN-規模部隊の濃縮動的負荷を適用し、ミリスケールに近づい深さまで試料の変形応答を測定します。我々は以前、心臓や肝臓9,11,12の挙動を定量化するために、衝撃のインデントを使用し、それらの器官からの組織のための負荷速度でのエネルギー散逸応答の同様の依存性を観察しています。 インパクトのインデントはミクロンからミリメートルまでのプローブ半径を収容することができます。さらに、衝撃押込み実験は、水和した組織21の機械的な特徴付けを可能にする完全に浸漬した環境で行うことができます。このような脳組織として非常に準拠したサンプルをテストする場合、インプortant考慮事項が考慮されなければなりません。まず、材料への最大測定深度は約1mm、器具自体の長さスケールで設定された制限です。任意の更なる振り子の変位が物理的に振り子と固定磁性板の上部に位置する電磁コイルとの間の衝突によって停止されます。脳組織の場合、これは正常に約5mm /秒にも適用することができる最高の衝撃速度を制限します。衝突速度 ​​が注文ミリメートル/秒であるが、対応するひずみエネルギー密度が原因でプローブ半径11の小さな寸法に、弾道条件に近づくkJの/ m 3で、程度であることに注意してください。器具は、プローブと組織表面との接触を検出するための第二に、潜在的に困難になることができます。試料ステージは、プローブに向かうように振り子が移動する試料によって押し戻されると、接触が検出されます。しかし、のために非常にcomplianプローブがサンプルに浸透しつつトンのサンプルは、振り子が検出可能に偏向されない場合があります。 この問題に対処するために、我々は、試料ステージバック振り子を駆動するための接触時に大きな勢いが存在することになるように移動する速度を増加させることができます。サンプルはまた、適切な接触点を検出するエラーを最小限に抑えるために、できるだけ平坦であるべきです。最後に、振り子の上部に電磁電流が第1の衝突事故後の浸透のための駆動力を供給し続けることに衝撃荷重が、真のインパルス負荷ではないことに注意してください。その結果、クリープは、エネルギー散逸特性の解析を複雑にする、より高い負荷条件下で特に起こり得ます。この技術のさらなる研究は、顕微鏡を介して組織サンプル表面の視覚化を体温での研究を可能にするように温度制御を導入すること、を含む、衝撃応答からクリープ応答を切り離す含むことができます液晶セルとの互換性電子。 レオメトリーは、マクロスケールレベルでの粘弾性固体の周波数依存の機械的特性を測定します。せん断弾性率成分、貯蔵G &#39;及び損失G」は 、典型的には、機器、プローブジオメトリ、及び試料13に応じて、10〜100ラジアン/秒に0.001ラジアン/秒にわたる範囲の周波数で測定することができる。正確な測定のために、振幅スイープは、材料の線形弾性範囲を決定する前に、周波数掃引に行われるべきである。これは、G &#39;およびG&#39; &#39; は 14,27一定に保たれるひずみの範囲で周波数のために選択されたせん断ひずみ。掃引は、十分なトルクが測定中に達成されるような線形粘弾性限界（典型的には1~2％のせん断ひずみ）内で可能な限り高くあるべきである。測定時のトルクが常に確実にするために、製造業者によって提供される許容範囲内にあるべきです対雑音比ufficient信号。 さらに、使用レオメトリープローブは、トルクを最大にするために、できるだけ大きくなければならないが、完全に13サンプルとオーバーレイしなければなりません。試料を調製する際に、組織接触は、プレート間で行われたときの応力勾配を最小限に抑えるために、できるだけ平らにスライスされるべきです。接触がサンプルで作られた場合、組織は、そのインターフェイスでのスリップを最小限に抑えるために、その上に任意の水滴を持つべきではありません。これは組織構造13を劣化させるようしかし、組織はまた、前または測定中に乾燥させてはいけません。組織が完全に両プレート間の接触後にメディアで水和する必要があります。接着剤、防水紙やすりもスリップ28を最小化するためにプレートに取り付けられてもよいです。さらに、軸方向の圧縮は、脳組織29のG &#39;の大きさを変化させることが示されています。レオロジーサンプルは典型的に（約5 mm）の薄膜であるため、高さの小さな変化は、（500〜μm）は大きな圧縮株（ 例えば 、〜10％）、および剪断弾性率で、したがって重要な変化を生成することができます。サンプルは粘弾性であるとしてさらに、物質が原因の測定値に影響を与える可能性が軸方向圧縮28に応力緩和を受けます。このように、繰り返し測定は、同様に動作し、軸方向ひずみで行われるべきであり、サンプルは、測定前に（ 例えば、5〜10分）をリラックスさせるべきです。これらの現象に関連したエラーは、技術の限界です。レオのその他の制限は、多くの場合、組織サンプル13で真実ではない材料が均質で等方性であるという仮定が含まれます。さらに、温度は、それがGに影響するように、生理学的条件下で維持されるべきでべき乗則behaを変更することなく、適度とG &#39;&#39;とG &quot;22。脳組織において特異的に、温度上昇は、両方のGを減少させることが示されています[このように時間-温度重ね合わせプリンシパル22,30を以下の周波数でvior、。我々のデータは、G &#39;およびG&#39; &#39;の同様の大きさだけでなく、両方のG&#39;とG &quot;に弱いパワー則周波数依存性を観察したブタの脳内の以前の研究22,27、とよく一致しています。 算出された比率のtanδ= G &quot;/ G &#39;（ 図6）は、レオメトリー衝撃くぼみの間の比較の基礎を提供する。衝撃インデントでは、脳組織のエネルギー消費容量を大きく負荷率とともに増加することを見出した。レオメトリーを使用して、我々はことを発見しました周波数が増加すると、tanδはまた、換言すれば、材料は、より高い周波数でより多く電力を消費した。増加した。また、衝撃押込測定は直接弾性率を定量化していないが、直接侵入深さXの最大減少increasinとグラム弾性率。 一緒に、この論文に記載された方法は、マイクロ、メソ、およびマクロの長さスケールでの脳組織の機械的特性評価を可能にし、異なる負荷率で。本明細書に提示される方法は、生物学的組織および操作ヒドロゲルの両方を含むコンプライアント材料の数を使用することができます。脳組織のマルチスケール粘弾性特性の深い理解では、我々は脳の機械的応答を模倣するように設計設計資料をより良くすることができます。これらの組織模擬材料は、機械的損傷、保護戦略のエンジニアリングの予測を容易にすることができます。さらに、脳の材料特性が良く、特にそのような自閉症および多発性硬化症などの神経疾患の文脈において、中枢神経系における細胞の増殖および接続性を理解するために、インビトロおよびインビボ研究におけるバイオインスパイアード材料を設計することができます。

生物学的器官を含むほとんどの軟組織石灰化した骨または工学材料と比較して機械的及び構造的に複雑な、低剛性であり、非線形および時間依存の変形を示します。体内の他の組織と比較して、脳組織は1Paで数百程度の弾性率をEと、格段に準拠しています。脳組織は、異なるとの構造的不均一性を示し、また、機能的に異なるグレーと白質領域を互いにかみ合っ。脳組織の力学を理解することは、傷害の間に脳の応答を模倣する材料と計算モデルの設計に役立つ機械的損傷の予測を容易にし、保護戦略の設計を可能にします。さらに、このような情報は、組織再生のための設計目標を考慮するために使用することができ、より良好な多発性硬化症や自閉症などの疾患と関連している脳組織の構造的変化を理解します。 HERE、我々はメソ、ミクロで、脳組織を含む機械的に準拠した組織の粘弾性特性を特徴づけるために利用可能ないくつかの実験的アプローチ、およびマクロスケールを説明し、実証します。 マイクロスケールで、我々はクリープコンプライアンスを行い、原子間力顕微鏡（AFM）対応のインデントを使用して緩和実験を強制します。典型的に、AFM対応くぼみは、試料2-4の弾性率（または瞬間剛性）を推定するために使用されます。しかし、同一の器具はまた特性5-10（タイムまたはレートに依存）マイクロ粘弾性を測定することができます。 図1に示すこれらの実験の原理は、時間の経過とともに、脳組織内にプローブを片持ちAFMをインデント力や押し込み深さの特定の大きさを維持し、それぞれ押し込み深さと力の対応する変化を測定することです。これらのデータを用いて、クリープCOMPを算出することができますそれぞれliance J Cと緩和弾性率G R、。 メソスケールで、我々は振り子ベースのインストルメントナノインデンターを使用して、組織構造と水和レベルを維持する流体に浸漬条件における衝撃インデントの実験を行いました。実験は、 図2に示されている。振り子が組織と接触するように揺動するように、振動振り子が組織内に静止するまでの変位を時間の関数として記録されているプローブ。プローブの結果として生じる減衰高調波振動運動から、我々は、組織11,12の（エネルギー散逸率に関する）の最大侵入深さx MAX、エネルギー散逸能力K、及び散逸品質係数Qを算出することができます。 マクロスケールで、我々は、周波数依存のせん断弾性率を定量化するために、平行平板レオメーターを使用しました。組織の貯蔵弾性率G &#39;及び損失弾性率G &quot;を 、と呼ばれるレオメトリーのこのタイプでは、高調波角度歪みを適用する（剪断歪みに対応する）既知の振幅と周波数で及びreactionalトルクを測定（及びせん断応力に対応します） 図3に示すように、測定されたトルクの結果として得られる振幅と位相遅れおよびシステムの幾何学的な変数から、我々は興味13,14の印加周波数で&quot;G &#39;及びGを計算することができます。

<table><tbody><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratoried</td><td></td><td>perscription drug</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>AnaSed Injections</td><td></td><td>perscription drug</td></tr><tr><td>Vibratome (Vibrating blade microtome)</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A Medium</td><td>Gibco</td><td>A1247501</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-independent neural medium for adult tissue</td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO</td><td>Asylum Research</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish Heater</td><td>Asylum Research</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>AFM Probe, 0.03 N/m, 10&amp;nbsp;&amp;micro;m radius borosilicate sphere</td><td>Novascan</td><td>PT.GS</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>mussel-derived bioadhesive</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>alternate suppliers can be used</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide, 1 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59223C</td><td>alternate suppliers can be used</td></tr><tr><td>Instrumented Indenter, NanoTest Vantage</td><td>Micro Materials Ltd.</td><td>-</td><td>probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1&amp;nbsp;mm diameter, 4-5&amp;nbsp;mm length)</td></tr><tr><td>NanoTest Liquid Cell</td><td>Micro Materials Ltd.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Parallel Plate Rheometer MCR501</td><td>Anton-Parr</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PP25&amp;nbsp;</td><td>Anton-Parr</td><td>-</td><td>25 mm diameter flat measurement plate</td></tr><tr><td>Adhesive Sandpaper</td><td>McMaster-Carr</td><td>4184A48</td><td>alternate suppliers can be used</td></tr><tr><td>Loctite 4013 Instant Adhesive</td><td>Henkel</td><td>20268</td><td>alternate suppliers can be used</td></tr></tbody></table>

characterizing multiscale mechanical properties of brain tissue using atomic force microscopy, impact indentation, and rheometry

機械的な模擬または組織再生研究のためかどうか、脳の性質に触発された材料を設計エンジニアには、脳組織自体がよく、様々な長さと時間スケールで特徴づけされなければなりません。多くの生物学的組織のように、脳組織は、複雑な階層構造を示します。しかし、大部分の他の組織とは対照的に、脳はPaで数百のオーダーのヤング弾性率をEと、非常に低い機械的剛性のものである。この低剛性は、キーの機械的特性の実験的特性評価に課題を提示することができます。ここでは、異なる長さスケールおよび負荷速度で、例えば、脳組織などの水和、コンプライアントの生物学的材料の弾性および粘弾性特性を測定するように適応されているいくつかの機械的特性評価技術を実証します。マイクロスケールで、我々は原子間力顕微鏡対応のインデントを使用して、クリープコンプライアンスと力緩和実験を行います。 mesosでCALEは、我々は振り子ベースのインストルメント圧子を使用して、衝撃インデント実験を行います。マクロスケールで、我々は周波数に依存するせん断弾性率を定量化するために平行プレートレオメトリーを行っています。また、それぞれの方法に伴う課題や制限について説明します。一緒にこれらの技術は、より良い脳の構造を理解するために、バイオ風の材料を操作するために使用することができます脳組織の徹底的な機械的特性評価を可能にします。

図4は 、それぞれ適用された力あるいは押し込み深さ（ 図4A、D）、与えられた、クリープコンプライアンスのための時間応答（ 図4B、E）対代表インデントと力を示し、リラクゼーション実験を強制します。これらのデータおよびシステムの幾何学的形状を使用して、クリープコンプライアンスJの C（t）と緩和弾性率G R（t）を強制することは、脳の異なる領域（ 図4C、F）について計算することができます。以前の研究は、脳23の異なる領域の弾性率の差を示しているが、粘弾性特性は、所与の組織切片内の地域間変動を示していないマウスの脳組織切片のためにこのようにして測定しました。 インパクトのインデントは、空間的および時間的にconcentraの高速で組織の機械的特性を測定しますテッド・ロード。これらの実験の結果は、組織が外傷や手術に伴う意図的な変形に応じてエネルギーを消費する方法についての情報を提供します。衝撃押込みプローブの減衰振動運動（ 図2B）は、最大浸透深さx MAX（ 図5A）、エネルギー散逸能力K（ 図5B）と組織のエネルギー散逸率Q（ 図5C）を計算するための情報を提供します。侵入深さが強く、組織の弾性率と相関変形抵抗を測定する：硬い組織が与えられた衝突速度や衝突エネルギーより小さい侵入深さを示します。エネルギー散逸能力組織は、最初の衝撃サイクルの間に衝撃エネルギーを散逸する程度の単位のない尺度です。散逸品質係数の測定サイクル数Iからの振動の前に発生しますMPACTは著しく減衰される - これは、時間の単位で表されていないが、これは、エネルギー散逸の速度に直接関係します。これら三つの衝撃応答パラメータは、組織の速度に依存する特性を研究するための手段を提供する、別の衝撃速度で定量することができます。 図6は、0.1ラジアン/秒から50ラジアン/秒までの範囲の周波数に対してマクロスケールのG &#39;とG &quot;を示している。貯蔵弾性率がほぼ低周波数での損失弾性率よりも大きい大きさのオーダーである。しかし、貯蔵弾性率および損失弾性率との比を周波数が増加するにつれて減少する。これは、貯蔵弾性率は、弾性特性を説明し、損失弾性率は材料の粘性損失を説明するので、弾性特性は、脳組織の挙動を支配することを示している。十分に高い負荷周波数で、貯蔵弾性率および損失弾性率を同一視し、点を示すれます材料は、（ すなわち 、粘性特性はサンプルの挙動を支配する）流れ始めます。本明細書に示されるように測定された脳組織の場合には、計測器の物理的な限界は、私たちは、より高い周波数での材料特性を測定することはできません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig1.jpg" /> AFM対応のクリープコンプライアンスの 図1. イラストや緩和実験を強制します。（A）AFM-有効インデントは自由端に取り付けられたマイクロスケール半径にナノの球状ビーズで柔軟なカンチレバーを用いて行われます。 （B）インデントの間、カンチレバーのたわみは、レーザを用いて測定されるカンチレバーの端からフォトダイオードへ反射されます。 （C）フォース緩和実験は、一定の印加深さにカンチレバーをインデントによって行われ、一方のresと力崩壊時間にPECTが測定されます。 （D）クリープコンプライアンスは一定の印加力でカンチレバーの変更押し込み深さを測定します。 （C）及び（D）は、5つの領域（緑のテキスト）に分割されている：試料表面のAFMプローブ（1）アプローチ、（2）試料と接触し、設定値のインデント/力まで上昇、（3）設定値のインデント/力の維持、（4）ランプダウンと試料表面からのAFMプローブの（5）後退。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54201/54201fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig2.jpg" /> インパクトのインデント実験の 図2. イラスト。インパクトのインデントの（A）の回路図、完全に水和条件で実験を行う能力を示します。 （B）Repres<html>マウス脳切片および対応する速度プロファイルから収集し、時間の関数としてentativeプローブ変位プロファイル。主な測定変位と示されているエネルギー散逸を定量化するために使用され算出された速度パラメータを設定します。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54201/54201fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig3.jpg" /> 平行板レオメーター実験の図3.イラスト。平行板レオメーター実験と適用された振動剪断ひずみに関連した定義の（A）の回路図。 （B）代表は、時間の関数としてのひずみと結果のストレスを適用しました。せん断貯蔵弾性率G &#39;及びせん断損失弾性率G &quot;は歪み振幅を介して計算されます54201 / 54201eq12.jpg &quot;/&gt;、トルク振幅T &#39;0、位相遅れ<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54201/54201eq13.jpg" /> 、探針と試料の半径R、およびサンプルの高さh。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54201/54201fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig4.jpg" /> 図クリープコンプライアンスから4.代表的なデータとリラクゼーション実験を強制します。（A、B）は、 図1中の生データからは、関心領域は、加えられた力は押し込み深さながら、（A）一定のまま時間としてクリープコンプライアンスのために定義されています（B）測定されます。 （A）の挿入図は、AFMピエゾができませんでした失敗した実験からのデータを示しています加えられた力と、（B）の挿入図を維持するためには、（B）に示す成功実験のデータと定性的に類似している対応する凹み応答を示しています。加えられた力からのデータを、測定インデント、およびプローブの幾何学の知識と（C）は 、クリープコンプライアンスJ cの （t）が計算されます。時間に対する力を測定しながら（D、E）は 、力緩和は、押し込み深さ（E）、（D）が一定に保持されます。これらのデータを使用して（F）は 、力の緩和弾性率G R（t）を計算することができます。クリープコンプライアンスと強制緩和実験は、このような脳梁（赤）および皮質（青）などの脳の解剖学的に別個の領域、に行うことができます。 （C、F）のデータは、n = 5匹のマウスからの測定値の平均である。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54201/54201fig4large.jpg" target="_blank">CLICください</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをk個。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig5.jpg" /> 図衝撃押込み実験から5の代表的なデータ、最大浸透深さx MAX、エネルギー散逸能力K、およびマウス脳組織の損失品質係数Qは、異なる衝撃速度で得られた生変位プロファイルから計算されます。データは。平均値±標準偏差として表された（n =ポイント当たり18反復測定）されている<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54201/54201fig5large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54201/54201fig6.jpg" /> レオメトリー実験から図6の代表的なデータ。ストレージG &#39;と損失G &#39;&#39;豚の脳の冠状切片からの弾性率。量のtanδは、貯蔵弾性率に対する損失の比として計算されます。データは。平均値±標準偏差として表された（n =ポイント当たり4反復測定）されている<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54201/54201fig6large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

characterizing-multiscale-mechanical-properties-brain-tissue-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K ビュー.  Massachusetts Institute of Technology. We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

ビデオ: Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

生物工学

Quantitative Hardness Measurement by Instrumented AFM-indentation

In this work, a combination of amplitude-modulated non-contact atomic force microscopy and atomic force spectroscopy is applied for instrumented hardness measurements on an Au(111) surface with atomistic resolution of single plasticity events. A careful experimental procedure is described that includes the force sensor selection, its calibration, the calibration of the cantilever deflection detection system, and the minimization of instrumental drift for accurate and reproducible force-distance measurements. Also, a method for the data analysis is presented that allows the extraction of force-penetration curves from recorded force-distance curves. A typical curve displays a clear elastic deformation regime up to the first plasticity event, or pop-in, with a length in the range of one to two Burger's vectors. Later plasticity events exhibit the same magnitude. The work of plasticity is further extracted from the measurements. Finally, the hardness is determined in combination with the indentation curve using non-contact atomic force microscopy images of the remaining indents.

This experimental protocol describes how atomic force microscopy can be used to measure hardness at the true nanometer scale and to detect single atomistic plasticity events.

計装AFMインデンテーションによる定量硬度測定

In this work, a combination of amplitude-modulated non-contact atomic force microscopy and atomic force spectroscopy is applied for instrumented hardness ...

工学

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle shells provides unique design principles with potentials for guiding the design of protective materials and systems in the future. Understanding the structure-property relationships for these material systems at the microscale and nanoscale where failure initiates is essential. Currently, experimental techniques such as nanoindentation, X-ray CT, and SEM provide researchers with a way to correlate the mechanical behavior with hierarchical microstructures of these material systems1-6. However, a well-defined standard procedure for specimen preparation of mineralized biomaterials is not currently available. In this study, the methods for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of A. spatula using nanoindentation, FTIR, SEM, with energy-dispersive X-ray (EDX) microanalysis, and X-ray CT are presented.

Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

This paper presents the methods used for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of Atractosteus spatula (A. spatula) using nanoindentation, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM), and X-ray computed tomography (X-ray CT). The experimental results have been used to investigate the design principles of protective biological materials.

多層魚の鱗の特性（<em&gt; Atractosteusヘラ</em&gt;）ナノインデンテーション、X線CT、FTIR、およびSEMを用いて

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

生物学

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

早期変形性関節症の検出に対する原子間力顕微鏡の応用

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the biological field. However, as with any other microscopic approach, methodological challenges can arise. In particular, the characteristics of the sample, sample preparation, type of instrument, and indentation probe can lead to unwanted artifacts. In this protocol, we exemplify these emerging issues on healthy as well as osteoarthritic articular cartilage explants. To this end, we first show via a step-by-step approach how to generate, grade, and visually classify ex vivo articular cartilage discs according to different stages of degeneration by means of large 2D mosaic fluorescence imaging of the whole tissue explants. The major strength of the ex vivo model is that it comprises aged, native, human cartilage that allows the investigation of osteoarthritis-related changes from early onset to progression. In addition, common pitfalls in tissue preparation, as well as the actual AFM procedure together with the subsequent data analysis, are also presented. We show how basic but crucial steps such as sample preparation and processing, topographic sample characteristics caused by advanced degeneration, and sample-tip interaction can impact data acquisition. We also subject to scrutiny the most common problems in AFM and describe, where possible, how to overcome them. Knowledge of these limitations is of the utmost importance for correct data acquisition, interpretation, and, ultimately, the embedding of findings into a broad scientific context.

We present a step-by-step approach to identify and address the most common problems associated with atomic force microscopy micro-indentations. We exemplify the emerging problems on native human articular cartilage explants characterized by various degrees of osteoarthritis-driven degeneration.

原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of nanometers. Because mammalian cells sense and react to the mechanics of their immediate microenvironment, the characterization of biomechanical properties of tissues with high spatial resolution is crucial for understanding various developmental, homeostatic, and pathological processes. The basement membrane (BM), a roughly 100 - 400 nm thin extracellular matrix (ECM) substructure, plays a significant role in tumor progression and metastasis formation. Although determining Young&#39;s modulus of such a thin ECM substructure is challenging, biomechanical data of the BM provides fundamental new insights into how the BM affects cell behavior and, in addition, offers valuable diagnostic potential. Here, we present a visualized protocol for assessing BM mechanics in murine lung tissue, which is one of the major organs prone to metastasis. We describe an efficient workflow for determining the Young&#39;s modulus of the BM, which is located between the endothelial and epithelial cell layers in lung tissue. The step-by-step instructions comprise murine lung tissue freezing, cryosectioning, and AFM force-map recording on tissue sections. Additionally, we provide a semi-automatic data analysis procedure using the CANTER Processing Toolbox, an in-house developed user-friendly AFM data analysis software. This tool enables automatic loading of recorded force maps, conversion of force versus piezo-extension curves to force versus indentation curves, computation of Young&#39;s moduli, and generation of Young&#39;s modulus maps. Finally, it shows how to determine and isolate Young&#39;s modulus values derived from the pulmonary BM through the use of a spatial filtering tool.

This protocol visualizes how to prepare cryosections of murine lung tissue, perform atomic force microscopy force map experiments, and analyze the data to determine Young's modulus of the native murine pulmonary basement membrane.

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

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