Name: whole-cell patch-clamp recordings in brain slices
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
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Questa ricerca è stata sostenuta da UT Southwestern fondi di avvio (SK).

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Nessuno degli autori hanno interessi concorrenti o interessi in conflitto.

Questo protocollo descrive la procedura di base per l&#39;esecuzione di cellule intere esperimenti di patch-clamp su neuroni in fettine di cervello. Tuttavia, la complessità, il potenziale e la sensibilità di questa tecnica non possono essere completamente descritti in questo articolo. Qui, abbiamo cercato di delineare i passaggi più elementari e sottolineare parametri importanti che devono essere controllati per ottenere registrazioni cellule intere di successo e rigorose. Per ulteriori apprendimento teorico, molti libri e articoli sono stati pubblicati su entrambi cellula intera registrazione patch-clamp in fettine di cervello 3,21-24 e metodi che possono perfezionare le soluzioni utilizzate 25-27 al fine di migliorare la vitalità delle cellule. Per eseguire routine registrazioni appropriate, è necessario miglioramento delle competenze tecniche attraverso la pratica intensiva. ore Tuttavia, con una corretta applicazione dei passaggi accennato, le cellule possono essere combinati post mortem, che forniscono importanti informazioni su cambiamenti delle funzioni sinaptiche e excitabi intrinsecalità. In generale, oltre l&#39;importanza di preparare con attenzione entrambe le soluzioni ACSF e micropipetta interno, ogni passo dalla dissezione del cervello, affettare, ottenendo cellula intera configurazione di successo, e ottenere dati rigoroso e imparziale richiede pratica intensiva. In primo luogo, è fondamentale per generare sezioni di cervello sane. Brevemente, rapida dissezione del cervello (idealmente &lt;45 sec), il mantenimento di una bassa temperatura (0 - 2 ° C) mentre affettare, e soluzioni adeguate affettatura tutti svolgono un ruolo importante nel garantire la salute delle cellule. È degno di nota ricordare che le soluzioni affettatrici possono differire tra laboratori e in base al tipo di cellula e / o di una regione del cervello che saranno oggetto di indagine. Quando affettare striato NAc o dorsale, il nostro laboratorio e altri utilizzano l&#39;acido kinurenico per la soluzione taglio per ridurre al minimo i processi eccitotossici 28-33, tuttavia, possono essere utilizzati anche altri metodi, come ad esempio soluzioni di saccarosio a base 34, alta Mg 2+ </sup&gt; / bassi soluzioni Ca 2+ 35, ecc. Questi sono solo alcuni esempi e possono essere regolati in base alla sensibilità della regione del cervello o cervello di processi eccitotossici (ad esempio, a causa di età). Per ulteriori informazioni sulle soluzioni e vitalità cellulare, si prega di consultare 25-27. In definitiva, la concentrazione di anioni, cationi e altri farmaci (ad esempio, ascorbato, recettore del glutammato antagonisti) che compongono soluzioni affettatrici è determinato in modo che imita liquido cerebrospinale e minimizza il più possibile i processi che si verificano durante eccitotossici affettatura. Il protocollo presentato in questo articolo descrive soluzioni standard che sono stati regolarmente utilizzati in precedenti studi degli autori 28-31 quando si registra da MSN nel NAc o striato dorsale in fettine di cervello. Inoltre, la corretta regolazione della osmolarità per entrambe le soluzioni ACSF e micropipetta interno sono fondamentali per la formazione della guarnizione di successo e la manutenzione di conf whole-celliguration. Per creare un gradiente di concentrazione da soluzione extracellulare soluzione intra-pipetta, ACSF osmolarità deve essere superiore per soluzioni micropipetta interne. Idealmente, la differenza può variare da 10 a 30 mOsm. Il raggiungimento di un cellula intera configurazione di successo è un altro passo importante per lo svolgimento delle registrazioni efficienti. Innanzitutto, pipetta capacità può essere regolata una volta che la pipetta viene posto nel bagno. Anche se le impostazioni automatiche di solito sono impostati correttamente, si consiglia di utilizzare le regolazioni veloci e lente di capacità delle cellule con cautela in quanto potrebbero danneggiare la cellula quando non è eseguita in modo appropriato. In secondo luogo, breve aspirazione membrana che è necessario per rompere la membrana porterà ad una significativa apertura della membrana, e quindi consentire una buona comunicazione tra intracellulare e intra-micropipetta ambiente. Questo farà sì che R s rimarrà relativamente stabili durante la registrazione. Se si utilizza la soluzione micropipetta Cs-based,il potenziale di membrana di riposo dovrebbe essere valutata immediatamente dopo la costituzione della cellula intera configurazione (vedi punto 5.8). Infatti, la diffusione di Cs + all&#39;interno della cellula causa la perdita di potenziale di membrana di riposo. Per determinare il potenziale di riposo corretta, il potenziale giunzione liquida deve essere valutato 20. Tuttavia, lo sperimentatore può segnalare il potenziale di riposo che si osserva dopo la rottura della membrana (dopo il passo 5.8) e scegliere di non registrare per ottenere il potenziale di giunzione liquida. In ogni caso, va menzionato nella sezione Metodo dell&#39;articolo. Su istituzione della cellula intera configurazione, C p può anche essere ottenuto e può essere utilizzato come un parametro indiretto per valutare la salute delle cellule e / o il tipo di cellula. In terzo luogo, quando le registrazioni hanno iniziato, gli altri parametri devono essere rigorosamente controllati. I fattori critici che devono essere controllati al momento di valutare l&#39;eccitabilità neuronale sono la temperatura, R s e R i. Comedi cui sopra, R i e C p può essere indicativo di salute delle cellule e / o il tipo di cellula. Ad esempio, la membrana plasmatica, che agisce come un isolante, separa carica (risultante dalla diversa composizione del intracellulari ed extracellulari soluzioni), che insieme costituiscono la capacità di membrana. Più grande è la superficie della membrana (specifico neuronale), maggiore è la capacità. È allora non sorprende che specifica i tipi neuronali mostra C p e R i (matematicamente legato al C p) che sono all&#39;interno della stessa gamma. R s è direttamente correlata alla dimensione della punta della pipetta, e, pertanto, di solito è indicativo della qualità o la dimensione di apertura della membrana. Brevemente, dopo istituisce cellula intera configurazione, il citoplasma diventa elettricamente continuo con la soluzione nel micropipetta e completamente isolato dal mezzo esterno. R s (o R a) proviene dalla resistenza dei current di fluire da pipetta citoplasma. Per alcune condizioni di ripresa (ad esempio, in modalità corrente-clamp o registrazione voltage-clamp di correnti ioniche voltaggio-dipendenti), R s deve essere compensato in modo appropriato (fare riferimento al Rif. ​​3,21-24 o guida manuale di amplificatore di risarcimento adeguato R s) . Come descritto in figura 4, R s è particolarmente importante in quanto può influenzare notevolmente la forma d&#39;onda del segnale elettrico, ad esempio, EPSC ampiezza. Tuttavia, R s devono essere attentamente monitorati per interpretazioni off-line di eventuali effetti osservati. Nel caso la membrana non sia stato rotto correttamente, punta micropipetta intasamento o richiusura della membrana può verificarsi, nel quale gli aumenti caso R s e polarizzazione della forma d&#39;onda del segnale elettrico in studio (Figura 4B-D). In sintesi, i numerosi problemi si possono incontrare durante la registrazione, e di quelli di solito rientrano in tre categorie: i) il tessuto-correlato, Ad esempio, un aumento della mortalità delle cellule a causa della scarsa dissezione, disadattamento di ACSF osmolarità, e ipossia; ii) apparecchiature connesse, ad esempio, problemi di rumore e di messa a terra, il controllo della temperatura, fetta e micropipetta posizionamento, ecc.; e iii) interpretazione dei dati, ad esempio, i cambiamenti osservati possono essere il risultato di artefatti sperimentali indesiderate polarizzazione dati come i cambiamenti nei parametri di forma d&#39;onda che alterano elettrici (R, R s, temperatura, vedi figura 3 e 4), piuttosto che il risultato sperimentale manipolazioni. Anche se la registrazione a cellula intera in fettine di cervello è una tecnica potente per valutare la plasticità esperienza-dipendente, questo approccio limita l&#39;interpretazione dei dati. In particolare, tre importanti limitazioni di tecnica di registrazione a cellula intera sono che: (i) i cambiamenti nei livelli di funzionalità e di espressione di proteine ​​specifiche (ad esempio, canali ionici) non possono essere distinti; (Ii) perché questotecnica valuta flusso di corrente attraverso l&#39;intera membrana (o parte sostanziale), non fornisce accurata localizzazione sub-cellulare delle correnti ioniche o cambiamenti che si osservano; e (iii) invasività della cellula intera configurazione porta alla dialisi del contenuto della cella, e quindi alla rottura del macchinario molecolare intracellulare necessario per alcuni fenomeni di sviluppare o espresse. Un modo per evitare la dialisi è quello di utilizzare le registrazioni elettrodo taglienti o la tecnica del patch perforato 3,21,23. Per quanto riguarda questi ultimi, formano pori molecole antibiotiche come nistatina può essere aggiunto alla soluzione pipetta. La formazione di questi pori permetterà la registrazione di correnti senza interrompere il secondo meccanismi messaggero all&#39;interno della cellula. Tuttavia, i recenti progressi nel campo delle nanotecnologie e lo sviluppo di nanoelettrodi 36 offrono potenti strumenti per migliorare le registrazioni neuronali. Tale progresso tecnologico nel campo delle neuroscienze sono ancora in fase SVILUPPOt e sono ora mettendo a nostra portata la possibilità di effettuare registrazioni di patch-clamp e intracellulari con invasività minima, vale a dire, mantenendo intatto l&#39;ambiente intracellulare, e indagare le funzioni dei canali ionici entro compartimenti sub-cellulari che erano finora non accessibili con la classica elettrodi di patch-clamp 37.

La tecnica del patch-clamp, una tecnica elettrofisiologica che è stato sviluppato alla fine del 1970 1,2, è uno strumento primario per studiare le funzioni di uno o più canali ionici nel tessuto vivo. Tra le diverse configurazioni di patch che si possono ottenere, registrazioni whole-cell patch-clamp permettono lo studio del comportamento elettrico di una parte sostanziale del neurone. Classicamente, questa tecnica viene eseguita in vitro sia su fettine cerebrali, neuroni appena dissociate, o su modelli di coltura cellulare 3. Quando eseguito sui neuroni in fettine cerebrali, questa tecnica presenta diversi vantaggi. In particolare: (i) i neuroni sono registrati nei circuiti cerebrali relativamente conservate che in qualche misura, e rispetto alle preparazioni di coltura cellulare, forniscono un ambiente che è fisiologicamente rilevanti 3. Questo permette di catturare in anticipo, o anche il monitoraggio in tempo reale, gli eventi cellulari e molecolari che sono attivati ​​da qualsiasi tipo di pharmacolog acutamanipolazioni iCal - una risoluzione temporale che non può essere raggiunto utilizzando classica in condizioni in vivo; (ii) capacità di identificare visivamente le regioni del cervello in fettine di cervello permette un&#39;elevata specificità regionale 3 sia per la regione del cervello studiato e per i neuroni specifici quando esprimono marcatori fluorescenti; (iii) l&#39;accesso allo spazio intracellulare della cellula aprendo una porzione significativa della membrana plasmatica (in contrasto pungere la membrana con una micropipetta tagliente per le registrazioni intracellulari) 4. A sua volta, questo consente al contenuto o la concentrazione di ioni specifici che compongono la soluzione interna da modificare bersagli molecolari modo o meccanismi cellulari possono essere studiati in condizioni diverse. Ad esempio, su di stabilire cellula intera configurazione, qualsiasi agente farmacologico specifico (ad esempio, gli antagonisti) che si può aggiungere alla micropipetta di registrazione (patch pipetta) soluzione sarà direttamente diffondersi nel citoplasma e di agire sul suo putative bersagli intracellulari senza alterare la funzione obiettivo in cellule vicine. Inoltre, rispetto alla registrazione micropipetta tagliente, la grande apertura sulla punta dell&#39;elettrodo patch clamp offre minore resistenza, meno rumore CONCORRENTI, e quindi un migliore accesso elettrico all&#39;interno della cella 4. Si noti tuttavia che l&#39;ampia apertura sulla punta della pipetta può portare alla dialisi cellule, e quindi la perdita di macchinario molecolare intracellulare che può essere critico per l&#39;espressione dei fenomeni biologici che sono in fase di studio 5,6. In questo caso, le registrazioni elettrodo taglienti può essere più adatto. Questo tipo di registrazioni richiede micropipette con un poro che è molto più piccolo di quelli usati per le registrazioni cellule intere, impedendo così la maggior parte lo scambio ionico tra lo spazio intracellulare e la soluzione pipetta interna. Ogni forma di esperienza (acuta o cronica), compreso l&#39;apprendimento 7-10, l&#39;esposizione a sostanze d&#39;abuso 11,12, lo stress 13,14, ecc, possono alterare i vari aspetti della funzione neuronale in regioni specifiche del cervello. Poiché queste alterazioni spesso richiedono tempo per svilupparsi (ore o giorni), le registrazioni integrali delle cellule in fettine di cervello da animali che sono stati sottoposti a una specifica esperienza permettono ai ricercatori di identificare questi cambiamenti. In sostanza, molti (se non tutti) i componenti che partecipano nelle funzioni neuronali (per esempio, ligando-attivato canali ionici, canali ionici voltaggio-dipendenti, trasportatori neurotrasmettitori), e in tal modo l&#39;attività del circuito del cervello e del comportamento, può essere alterato da esperienza (l&#39;esperienza-dipendente plasticità) 10,15-17. A livello neuronale, l&#39;attività circuito cerebrale emerge dalle interazioni costanti tra sinaptica (ad esempio, trasmissione glutammato) e fattori intrinseci eccitabilità cellulare (per esempio, canali ionici axosomato-dendritica: sodio, Na +, potassio, K +, e di calcio, Ca 2+ ). In condizioni specifiche che utilizzano da tE-CELL patch-clamp tecniche elettrofisiologiche, alterazioni di segnale provenienti in particolare da variazioni sinaptica vs. eccitabilità intrinseca può essere isolato. Nella maggior parte dei casi, l&#39;eccitabilità sinaptica è valutato utilizzando la tecnica voltage-clamp whole-cell. Questa modalità di registrazione permette la misura di correnti ioniche [ad esempio, mediati dai recettori di acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic ( recettori AMPA) e recettori N-metil-D-aspartico (NMDA)] attraverso la membrana plasmatica neuronale, mentre tengono il potenziale di membrana ad una tensione impostata. Qui, sperimentatori utilizzano le soluzioni interne micropipetta contenenti cesio (Cs +), una vasta bloccanti di canali K + (chiave fattori intrinseci eccitabilità). Su creazione di cellula intera configurazione, la diffusione di Cs + nello spazio intracellulare bloccherà canali K +, e quindi permetterà sia relativamente efficiente spazio-clamp e presfogare influenza dei fattori intrinseci eccitabilità su altre misure. Problemi di spazio-clamp, cioè, la difficoltà di tensione-clamp tutta la cella, sorgono quando si registra cellule di forma irregolare (ad esempio, neuroni), e in particolare neuroni con un vasto e complesso dendritic arbor 18,19. Poiché morsetto tensione somatica controlli scarsamente voltaggio nella struttura dendritica dei neuroni, vari aspetti dei segnali elettrici dendritiche in esame sono distorti in maniera dendritica distanza-dipendente. Combinato con strumenti farmacologici come picrotoxin (acido gamma-aminobutirrico, GABA A antagonista del recettore) o acido kinurenico (ampio bloccante dei recettori del glutammato) disciolti nella soluzione extracellulare (fluido cerebro-spinale artificiale, ACSF), questa tecnica permette di misurare glutammato recettore e le correnti GABA A R-mediata, rispettivamente. Al contrario, l&#39;eccitabilità intrinseca viene generalmente valutato in modalità di registrazione corrente-clamp.Al contrario di registrazione voltage-clamp, questa modalità di registrazione permette la misura delle variazioni potenziali di membrana indotte da correnti ioniche che fluisce attraverso la membrana plasmatica neuronale. Tipicamente, alterazione dell&#39;eccitabilità intrinseca è valutata attraverso cambiamenti nella capacità di neuroni di generare potenziali d&#39;azione, che richiede sia Na + e canali del K +. Pertanto, quando si eseguono registrazioni corrente-clamp, micropipette sono riempiti con una soluzione interna che contiene K + anziché Cs +. In combinazione con agenti farmacologici che bloccano glutammato e GABA A correnti recettoriali disciolti nel ACSF, questo disegno sperimentale permette la misura del contributo di fattori intrinseci (ad esempio, K + canali) a neuronale senza essere contaminati da potenziali variazioni dell&#39;eccitabilità sinaptica fattori. Questo articolo descrive i passi procedurali necessari di base to (i) prepara fette di cervello sane; (Ii) ottenere cellula intera configurazione, e (iii) monitorare i parametri fondamentali per valutare sinaptica e l&#39;eccitabilità intrinseca.

<table><tbody><tr><td>Isolated pulse stimulus generator</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Isolation unit (ISO-Flex)</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Computer controlled Amplifier&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Digital Acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Chamber and in-line Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Camera</td><td>Q Imaging</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Narishige pipette puller PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down (harp)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>Slice Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Nonmetallic syringe needle</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>Glue Gun</td><td>Home Depot</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Gas dispersion tube</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Decapitation scissors</td><td>Home Depot</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Small straight sharp tips scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>Vessel canulation forceps&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500453</td><td></td></tr><tr><td>Curved hemostatic forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>Economy Tweezers #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>Scooping spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2&amp;ndash;7.3, 280&amp;ndash;290 mOsm)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>D-gluconic acid 50%&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium-OH (CsOH) 50%&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 2.8 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.4 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>tetraethylammonium-Cl, 5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;GTP, 0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;K-Gluconate internal solution (pH 7.2&amp;ndash;7.3, 280&amp;ndash;290 mOsm)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>K D-gluconate, 120 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;GTP, 0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity &amp;asymp; 300-310 mOsm)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>KCl, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3,&lt;/sub&gt; 26.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, 11 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional compounds used for solutions preparation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell patch-clamp recordings in brain slices

Whole-cell patch-clamp registrazione è una tecnica elettrofisiologica che permette lo studio delle proprietà elettriche di una parte sostanziale del neurone. In questa configurazione, la micropipetta è a stretto contatto con la membrana cellulare, che impedisce la dispersione di corrente e quindi fornisce misure di corrente ionica più preciso del metodo di registrazione elettrodo affilato intracellulare precedentemente utilizzato. Classicamente, la registrazione a cellula intera può essere eseguita su neuroni in vari tipi di preparati, compresi i modelli di colture cellulari, i neuroni dissociate, i neuroni in fettine di cervello, e in animali anestetizzati o sveglio intatte. In sintesi, questa tecnica ha enormemente contribuito alla comprensione della passivi e attivi proprietà biofisiche di cellule eccitabili. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che fornisce informazioni sulle modalità specifiche manipolazioni (ad esempio, farmacologico, sperimentatore indotta plasticità) possono alterare le funzioni neuronali specifici ochannels in tempo reale. Inoltre, significativa apertura della membrana plasmatica permette alla soluzione pipetta interna di diffondersi liberamente nel citoplasma, predisporre mezzi per farmaci introduzione, ad esempio, agonisti o antagonisti di specifiche proteine ​​intracellulari, e manipolare tali obiettivi senza alterare le loro funzioni in cellule vicine. Questo articolo si concentrerà sulla registrazione a cellula intera eseguita su neuroni in fettine cerebrali, una preparazione che ha il vantaggio di registrazione neuroni relativamente ben conservati circuiti cerebrali, cioè in un contesto fisiologicamente rilevanti. In particolare, quando combinato con adeguate farmacologia, questa tecnica è uno strumento potente che consente di identificare neuroadaptations specifici che si sono verificati in seguito a qualsiasi tipo di esperienze, quali l&#39;apprendimento, l&#39;esposizione a sostanze d&#39;abuso, e lo stress. In sintesi, le registrazioni a cellula intera patch-clamp in fettine di cervello forniscono i mezzi per misurare in ex vivo preparazione cambiamenti duraturinelle funzioni neuronali che si sono sviluppate negli animali svegli intatti.

Temperatura, un fattore che è facilmente controllato dallo sperimentatore, influenza le proprietà biofisiche di canali ionici e recettori, e quindi la forma d&#39;onda delle correnti post-sinaptiche (PSC) (EPSC e iPSCs) e la capacità dei neuroni di suscitare picchi. Figura 3 la figura 4 mostra l&#39;effetto della temperatura sulla neuronale e la pendenza della EPSCs evocati (eEPSCs) rispettivamente. Il pattern di cottura (Figura 3) (cioè, la latenza per il picco 1 °, picco numero, frequenza, e potenziali di azione waveform) è modellato da una apertura e chiusura di specifici canali ionici voltaggio-dipendenti temporizzato e coordinata (Na +, Ca 2 + e K +), un processo sensibile alla temperatura. la Figura 3 mostra come il numero medio di picco aumenta con la temperatura. Si noti che in condizioni sperimentali qui descritte (registrazioni MSN) anche se freque picconcy non sembra essere modificata a temperatura subphysiological (28 ° C), aumenta in modo significativo quando la temperatura raggiunge il livello fisiologicamente rilevanti (32 ° C). La figura 4A mostra un esempio di come la pendenza di eEPSCs, un parametro che viene comunemente utilizzato per valutare la forza sinaptica, aumenta con la temperatura. Anche se R s può essere in qualche modo controllata dallo sperimentatore, vale a dire, attraverso un&#39;apertura di membrana efficiente durante la transizione dallo stato di tenuta a cellula intera configurazione, R solito è lentamente aumenta durante la registrazione. Questo può essere il risultato di vari eventi incontrollabili, per esempio, membrana richiusura o detriti intasamento la punta della pipetta durante la registrazione. Un tentativo di riaprire la membrana applicando un leggero vuoto, anche se potrebbe compromettere la patch, a volte può aiutare a mantenere una stabile R s. In tutti i casi, perché i cambiamenti R s possibile alter la forma d&#39;onda del segnale elettrico in fase di studio, deve essere attentamente monitorata, in particolare quando si registra PSC (modo tensione-clamp). Figura 4 mostra che quando aumenta R s (Figura 4B), l&#39;ampiezza delle correnti mediate dai recettori del glutammato (eEPSCs ) diminuisce (Figura 4C, D). Tipicamente, sperimentatori scartano i dati quando variazioni R s supera il 15% (per esempio, questo laboratorio), tuttavia alcuni laboratori fanno da una variazione del 20%. Questo criterio deve essere indicato nella sezione Metodo dell&#39;articolo. Per un neurone definito, Ri possono essere influenzati da diversi fattori, tra cui la temperatura, la salute delle cellule, e la qualità delle patch. In particolare, quando R i diminuisce, ampiezze PSC o capacità dei neuroni di generare picchi diminuisce anche. Ad esempio, la Figura 4E mostra che quando R i non varia significativamente, the il numero di punte rimangono relativamente stabili (Neuron 1); e quando R i aumenta, il numero di picchi aumenta pure (Neuron 2). Pertanto, e in modo simile a R s, R devo essere attentamente monitorati, il 10% sono sufficienti modifiche ai dati di polarizzazione. Come descritto sopra, è fondamentale per controllare o monitorare la temperatura, R s e R i durante le registrazioni. Per esempio, ha osservato cambiamenti nel segnale che è in fase di studio (PSC o cottura) può essere dovuto a cambiamenti (o una mancanza di controllo) di questi fattori, piuttosto che l&#39;effetto di manipolazioni sperimentali, ad esempio, pre vs post-effetti di applicazione vasca di droga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig1.jpg" /> Figura 1. Su ordine di recupero Camera (AD) e l&#39;immagine di un cervello fetta a 400X Visualizzazione sano e Dead Neuroni (E). ANNO DOMINI)La procedura per fare una camera di recupero personalizzato è descritto al punto 2.1. E) Immagine della CNA MSN mediale della shell in una fetta del cervello a 400X che mostra esempi di (frecce rosse sani) vs. neuroni morti (frecce blu). Si noti che, anche se alcune cellule sono indicati come sano, il loro aspetto sferica indicano che essi non possono essere sano come desiderato (frecce rosse con l&#39;asterisco). Lo stato di salute finale è valutata sulla base di riposo V e R i dopo aver raggiunto cellula intera configurazione. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54024/54024fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig2.jpg" /> Figura 2. Schema raffigurante le fasi procedurali di base per ottenere un Gigaseal e stabilire la cellula intera configurazione. Quando la micropipetta è abbastanza vicino a the cellule per creare una fossetta nella membrana plasmatica (step 1, Approach), applicare una breve e leggera aspirazione per creare uno stretto contatto tra la micropipetta e la membrana plasmatica. Se eseguita correttamente, il contatto rafforzerà e la resistenza aumenterà e raggiungerà 1 G (gigaseal) o più (fase 2, la formazione di Seal). Una volta che il sigillo è stabile e soprattutto 1 G, applicare una aspirazione breve e forte per rompere la membrana plasmatica (passaggio 3, cellula intera configurazione). Il raggiungimento della configurazione cellula intera permetterà continuità tra il citoplasma e l&#39;interno micropipetta. Per i dettagli, vedere il passaggio del protocollo 5.1-5.8. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54024/54024fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig3.jpg" /> Figura 3. neuronale di cottura (intrinseca Eccitabilità) è valutata in Current-vongole<html> Modalità p. Qui, una serie di pre-definiti e incrementale di passaggi di corrente è dato in modo da ottenere cambiamenti nella tensione della membrana, e quindi innescare potenziali d&#39;azione. A) Numero medio picco aumenta con la temperatura. traccia B) campione a 280 pA da NAC MSN guscio mediale a tre temperature diverse (24 ° C, n = 9; 28 ° C, n = 5; e 32 ° C, n = 6). La temperatura nella camera di registrazione influisce direttamente frequenza spike. Tuttavia, si noti che anche se la frequenza spike non sembra essere modificata a temperatura subphysiological, aumenta in modo significativo quando la temperatura raggiunge i 32 ° C, una temperatura fisiologicamente rilevanti. I neuroni sono tenuti a -80 mV. ANOVA a due vie: interazione, p &lt;0,0001; effetto di temperatura, p = 0,0041; test post hoc: 24 ° C e 28 ° C sono entrambi significativamente diversi da 32 ° C, ** p &lt;0.01. I dati sono rappresentati come media ± SEM. Calibrazione: 200 msec, 50 mV.jove.com/files/ftp_upload/54024/54024fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig4.jpg" /> Figura 4. Effetto della temperatura, R s e R i sulla forma d&#39;onda del segnale elettrico in fase di studio. A) Esempio di eEPSC ampiezza da un singolo NAc shell MSN. Aumentando la temperatura dal 24 al 28 ° C e 32 ° C aumenta la pendenza della eEPSCs. Si noti che le variazioni di temperatura indotte in pendenza eEPSCs si verificano rapidamente. Qui, pendenza eEPSCs è valutata in modalità voltage-clamp. Calibrazione: 5 msec, 100 pA BD) Esempio di eEPSCs pista da un unico NAc shell MSN.. Quando aumenta R s (B), la pendenza della eEPSCs diminuisce (C). D) Analisi di correlazione di pendenza eEPSC in funzione di Rs. R di Pearson = -0,5717, p &lt;0,0001. I neuroni sono Esempio di tracce da due neuroni che mostrano l&#39;effetto di Ri dalla capacità del neurone di generare picchi di tensione bloccato a -80 mV. E). I neuroni sono in corso-serrata, e ha tenuto a -80 mV. Calibrazione:. 200 msec, 50 mV <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54024/54024fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l&#39;esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-in-brain-slices

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

59.4K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center.  Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l'esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati. 

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Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Ricerca

Neuroscienze

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus and rostral periventricular nucleus, as well as the arcuate nucleus of the hypothalamus, project to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, among other cells. Previous studies have demonstrated that kisspeptin signaling occurs through the Kiss1 receptor (Kiss1r), ultimately exciting GnRH neuron activity. In humans and experimental animal models, kisspeptins are sufficient for inducing GnRH secretion and, consequently, luteinizing hormone (LH) and follicle stimulant hormone (FSH) release. Since kisspeptins play an essential role in reproductive functions, researchers are working to assess how the intrinsic activity of hypothalamic kisspeptin neurons contributes to reproduction-related actions and identify the primary neurotransmitters/neuromodulators capable of changing these properties. The whole-cell patch-clamp technique has become a valuable tool for investigating kisspeptin neuron activity in rodent cells. This experimental technique allows researchers to record and measure spontaneous excitatory and inhibitory ionic currents, resting membrane potential, action potential firing, and other electrophysiological properties of cell membranes. In the present study, crucial aspects of the whole-cell patch-clamp technique, known as electrophysiological measurements that define hypothalamic kisspeptin neurons, and a discussion of relevant issues about the technique, are reviewed.

Here, we present a protocol to perform a whole-cell patch-clamp on brain slices containing kisspeptin neurons, the primary modulator of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) cells. By adding knowledge about kisspeptin neuron activity, this electrophysiological tool has served as the basis for significant advancements in the neuroendocrinology field over the last 20 years.

Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

Definizione di una configurazione a cella intera tramite il metodo Patch Clamp

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Slice ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

Source: Engel, D. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54601">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

Registrazioni Patch-Clamp dal dendrite di un neurone dopaminergico in una fetta di cervello

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Source: Sunstrum, J. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59461">Evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

Stabilire una configurazione di voltage-clamp a cellula intera per registrazioni elettrofisiologiche in fette di cervello

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

Source: Wu, Q., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56010">Application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, brain slices are immobilized in a recording chamber, and cells of interest are located and focused on using a computer-controlled microscope. The automated image processing system then precisely positions a patch pipette to seal the cell membrane and monitor electrical signals.

Tecnica automatizzata di patch clamp guidata da immagini per lo studio dei neuroni nelle fette di cervello

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. System Setup

	Construct ...