German Research Foundation (FOR2240 "(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye" to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 "Joining Forces to Corneal Regeneration" (to CC).

ヒト組織の使用を見直し、施設内倫理委員会または同等の承認を得なければなりません。ここで説明する作業は、地元の倫理委員会によって承認され、科学的審査の承認を持っていました。この作品は、ヘルシンキ宣言に従って実施しました。人間の強膜標本は、眼科学科のアイバンク、ケルン大学、ドイツで（最大死後時間24時間）、地球ドナーの目から得ました。 1.実験の準備<ol><li> 96％エタノールを調製し、別のチューブ中で緩衝化生理食塩水（PBS）をリン酸。 2％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSの推奨希釈率で一次抗体を調製し、氷上で全ての溶液を保持します。サンプルあたり100μlのを準備します。 </li><li>すべての楽器をきれいにし、鋭いメスを使用しています。同じメスで切断を繰り返した後、メスを変更します。 </li><li> 1-2コリブリ鉗子、ストレートマイクロ解剖ハサミ、＃10メスを取得または眼科用メスマイクロ羽、および4 26 G針。 </li><li>ポリスチレン板の周りにアルミホイルを巻きまたは組織を固定するためにコルク板を使用しています。双眼実体顕微鏡の下に働きます。必要に応じて層流の下に滅菌作業。 </li></ol> 2.強膜を準備<ol><li>静かに電球を保持し、強角膜部分に穿孔穿孔を行い、その後、トレパンを回転させます。均等にラウンドカットを実行するために表面に慎重かつ均等にトレパンを回転させます。 15.5ミリメートルサイズのトレパンを使用してください。湾曲したハサミで残りの添付ファイルをカットします。強角膜穿孔を削除します。これは、前方に開いた電球になります。 <ol><li>上向きに開口部を持つ綿棒に強膜を置きます。強膜からの両方の層（網膜およびブドウ膜）をやってのけるコリブリ鉗子を使用して、網膜およびブドウ膜を削除します。内側の強膜に色素性ブドウ膜を放置しないでください。乳頭から網膜およびブドウ膜を除去するために、湾曲したハサミを使用してください。レムを削除しますaining結膜、外眼筋、および表面的な強膜からのテノン嚢。 </li></ol></li><li>ストレート型はさみとコリブリ鉗子を使用して、必要なサイズの強膜サンプルを削除してください。約2cmに別の場所から2サイズ強膜サンプルを取ります。そのため、小さなサイズで、優しく強膜を保持し、ストレート型のはさみを使用して、正方形として必要なサイズを切り出します。強角膜穿孔は強膜サンプルの前縁を定義します。 <ol><li>繰り返しつかまれた組織は、共焦点顕微鏡分析のために適していない領域として鉗子でつかんでは避けてください。実験の種類に応じて、サンプルの必要な数を用意（ 例えば、前方対後方、 図1と比較）及び使用される抗体の量は。 </li></ol></li><li>後で使用するために、1.5ミリリットルチューブにサンプルを置きます。 15分間1.5ミリリットル96％エタノール中のサンプルを修正し、その後、5分間、それらを各3回を洗いますシェーカー上で1.5ミリリットルのPBSインチ凍結組織で作業する場合は、スナップ凍結する前にこの手順を実行します。 </li><li>新鮮な組織を使用してください。これが不可能な場合には、液体窒素中で強膜を凍結し、後で使用するために-20℃でそれを維持スナップ。凍結組織で作業する場合は、使用前に解凍。解凍と凍結の繰り返し繰り返しは避けてください。 </li><li> 2時間室温で1.5ミリリットルの5％BSAを含むPBS中で各サンプルを保管してください。このステップでは、積層するのに役立つサンプルの膨潤を誘発し、また、非特異的結合を防ぐことができます。 </li><li>サンプルが膨潤した後、積層に強膜の正方形を準備します。 例えば 、双眼実体顕微鏡顕微鏡の下に働きます。 26 G針を使用して、アルミ箔やコルク板に包まれたポリスチレン膜に後部強膜のサンプルを貼り付けます。 </li><li>彼らは、顕微鏡下に視野を妨げることはありませんので、針の端を曲げます。 </li><li>全層強膜SAMPを積層レ。 <ol><li>まず、コリブリ鉗子を使用して、前方の強膜のエッジを保持します。その後、慎重に＃10メス、眼科用メスマイクロ羽、またはへらの刃を用いて表面的な強膜の薄い層をカット。水平にメスを持ち、下地層からできるだけ薄く表層を切りました。 </li><li>強膜広場から薄い強膜層を分析。この方法は、線維柱帯切除術の際にフラップを準備する標準的な外科技術に匹敵し、30-80μmの厚い層（ 図2を比較）をもたらすべきです。 </li></ol></li><li> 例えば 、50μlのPBSをピペットを用いて組織にPBSを少量添加することにより、強膜の乾燥を防ぎます。 </li><li>防水色で例えばと層（表面的で深遠な）（はexternとインターンの方に）96ウェルプレートに100μlのPBSにカット層を入れて、両方の向きにラベルを付けます。 </li><li>組織が完全に積層されて繰り返して、2.7から2.9を繰り返します。&lt;/李&gt; </ol> 3.免疫組織化学を実行します<ol><li>推奨希釈に必要な一次抗体を100μlを追加します。ここでは、 例えば、使用CD 31（モノクローナルマウス抗ヒト）およびLYVE1抗体（ウサギ抗ヒト）、1の希釈の両方において（2％BSAを含む）PBS 100と一晩4℃でインキュベートします。 96ウェルプレート中の培地を変更するには、ウェルの壁にピペットを保持し、流体を除去。 </li><li>翌日、シェーカー上で200から300μlのPBSで5分間のサンプルを3回ずつ洗浄します。対応する二次抗体を100μlを追加します。ここでヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびヤギ抗ウサギシアニン染料3（Cy3の）を使用し、1-2時間室温でサンプルをインキュベートします。 2％ヤギ血清を含むPBS中で300：二次抗体1を希釈。 </li><li>シェーカー上で200から300μlのPBS中で5分間、再び3回ずつサンプルをすすいでください。 </li><li>核染色を行い、 例えば </em&gt;の。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（希釈1：2,000、100μlの各ウェル中で、室温で10分間インキュベートする）、次いで、シェーカー上で200〜300μlのPBSで再度2回洗浄します。 </li><li> 、顕微鏡スライド上にサンプルを転送し、蛍光封入剤の1〜2滴でそれらを埋め込む、カバースリップを追加し、透明ニスでエッジを覆うことにより、それをシールし、4℃で保存し、後で使用するために、または直接共焦点でスライドを調べます顕微鏡。 </li><li>サンプルを分析するために、共焦点顕微鏡（または同等）を使用します。所望の倍率、 例えば 10-40X倍率を使用してください。 </li><li>サンプルの厚さを確認するには、Z-スタックを用いた共焦点顕微鏡で測定します。厚さは赤道と後方（導入を比較）異なるので可能な強膜の部分の量は、強膜の場所によって異なります。 </li></ol>

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	<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+(LYVE1)-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera.">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li><li>Schlereth, S. 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人間の強膜を積層することは、この組織の共焦点顕微鏡検査を行う方法です。このプロセスにおける重要なステップは、組織を固定するための代わりホルマリンエタノールの使用です。代わりに、固定のためにホルマリンのエタノールを使用する場合に我々の経験では、より良好な結果が得られます。ブラントメスは、プロシージャを悪化させるし、避けるべきです。同様に、強膜の乾燥まで、それは手順を複雑にし、画像の品質を低下させるように、避けるべきです。 免疫組織化学的染色に関しては、ここで適用されるもの以外の抗体を使用することができます。一般的に、コラーゲンは緑チャネルでより多くの自己蛍光およびバックグラウンドを示し、したがって、赤、青、遠赤チャンネルが少ない背景とのより良い結果を示しています。 しかし、技術のいくつかの制限があります。それはmicrosc下で行う顕微手順であるとして強膜を積層することは、たくさんの練習が必要ですOPE。この技術は手動で実行されるため、単一の積層スライスは正確に同じ大きさではなく、組織の一枚以内にその厚さが異なります。層の厚さは依然として異なりますが、まったく同じ大きさの組織を持っているために、穿孔は、代替可能性があります。強膜セクションの正確に規定された厚さを達成するために、自動化されたマイクロケラトームは、将来の実験のための代替可能性があります。ラミネーションが厚すぎる層で実行された場合、カバースライドを脱臼することができ、組織が潜在的に乾燥することができます。上強膜と間質との間の正確な境界はラミネーションが実行されると区別するのは難しいかもしれません。 これにもかかわらず、強膜を積層すると、現在の臨床状況における標準的な方法であるホルマリン固定パラフィン包埋、免疫組織化学、と比較場合は特に、免疫組織化学の使用にいくつかの利点があります。強膜を積層して、共焦点microscを可能にしますOPYは、強膜のより大きなサイズの領域を分析するために、実行される強膜の異なる層、並びに、スクリーニングおよび組織のスキャンを検査します。ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルで作業する場合は対照的に、強膜は、抗原回復のための予熱時に助けにならない方法で、その一貫性を変化させます。加熱プロセスを通して、コラーゲン線維がしなびおよび組織は、スライドとの接触を失います。以前は、上強膜における血管叢だけではなく、断面で、血管造影技術を使用して、または全体マウントビューに表示されています。 技術的な問題に加えて、強膜は、網膜のような目で他の組織に比べて免疫細胞中で比較的無血管や比較的貧弱です。通常、厚さ4μm、複数のスライドであるホルマリン固定パラフィン包埋スライドを使用した場合従って、強膜に陽性の細胞を検出するために必要とされます。最近では、このlaminatを使用して示されました人間の強膜が無細胞ではなく、血管1の周囲に蓄積するLYVE1 +マクロファージがたっぷり含まれている技術をる。 積層強膜切片上で、共焦点顕微鏡検査を行って、要約すると、このような強膜炎、ブドウ膜炎、または外傷などの将来の病理学的障害を調査するための有望なツールです。

強膜は、密性結合組織で構成されている、目を覆う硬質の外側の層です。それは、眼内の構造を保護し、眼内圧を維持するのに役立ちます。このように、強膜は、明確なビジョンのために不可欠です。これは、リンパ管1,2を欠いており、それによって、それとリンパのない眼の内部3-7との間に、外リンパのない境界線を形成しています。また、それによって腱と解剖学的類似性を共有し、外眼筋のための結合部位を提供します。 強膜は、主にI型コラーゲンの密な束で構成され、コラーゲンタイプIII、IV、V、VI、VIII 8,9及びエラスチン10,11のより小さい数を有するため、この組織は、免疫組織化学のために使用することは容易ではありません。 （1）表在血管新生した上強膜、結膜およびテノン嚢の下に発見され、側面と目に向けて：解剖学的に、強膜は、3つの主要な層に分離することができます電子バック軌道に直面して、目の。 （2）強膜間質、強膜の主要部分を、 （3）直接ブドウ膜の上に位置する薄い着色層であるラミナフスカ、。強膜に関する当社の解剖学的知識は、20 世紀の前半から主茎。当時、研究者は、主にインドのインク注入12と血管キャスティング13-15を使用して、血管系の解剖学を研究しました。その後、それは血管造影の研究16-19で調査しました。 その時以来、古い技術が改善されていると新しいものは、私たちは前の解剖学的知識を補完することができましたが開発されています。我々はリンパ血管内皮特異的なヒアルロン酸受容体1（LYVE1）20またはポドプラニン21のような信頼性のリンパマーカーを持っていたので、例えば、それは約10年となっています。共焦点顕微鏡は、異なるTIの解剖学的特徴を研究するための新たな可能性を提供しています目のssues。複数の汚れが細胞のマーカーを区別するための又は血管及び他の解剖学的構造に関連する細胞の局在のために使用されることが可能になります。サンプルはより大きなサイズのものであり、ときに特定の細胞型の検索では、私たちはサンプルをスキャンすることを可能にするとき、それは概要を説明します。 Zスタック技術を、共焦点顕微鏡は、100〜200マイクロメートルまでのサンプルのために使用することができます。強膜は、筋肉の挿入および後部磁極11で1ミリメートルの背後に0.3ミリメートルの厚さが異なります。その厚さと不透明さの両方のために、強膜は、伝統的な方法を用いた共焦点顕微鏡観察には適していません。 これを解決するには、強膜組織は、共焦点顕微鏡との分析を可能にするために積層しました。この技術は、人間の強膜の両方の生理学的および病理学的状況のより良い理解を得るために有用です。

<table><tbody><tr><td>96% ethanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>binocular stereo microscope&amp;nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G needles&amp;nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgium</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 scalpel&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic scalpel micro feather&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 antibody&amp;nbsp; (polyclonal rabbit anti human)</td><td>Zytomed, Germany</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>goat anti mouse FITC antibody</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rabbit Cy3 antibody</td><td>Dianova, Germany</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum normal</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&amp;uuml;nde, Germany</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluorescent mounting medium&amp;nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 confocal microscopy&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

using a laminating technique to perform confocal microscopy of the human sclera

強膜はカバーし、目を保護する密な結合組織です。これは、主に高密度のコラーゲン束（タイプI、III、IV、V、VI、及びVII）からなります。 、その自己蛍光、不透明さ、及び厚さは、共焦点顕微鏡法のために適切であることが見出されていません。免疫組織化学のためにパラフィンに包埋ホルマリン固定強膜を使用して、ここに提示されている1つの代替アプローチは、抗原回復のための組織を予熱する場合は特に、技術的な課題があります。強膜は、細胞及び血管の両方において比較的悪いため、大きな組織サンプルを使用することは、望む細胞を防ぎ、血管および他の解剖学的部位に関連し、その局在化を理解するのに役立つように調べました。共焦点顕微鏡下でより大きな組織サンプルの分析を可能にするために、積層技術は、強膜の薄層を作成するために行きました。 CD31血管およびリンパ管の内皮hyaluの結果の分析を以下のローナン受容体1（LYVE1）科学的な審査の承認が得られたために陽性細胞は、この方法の利点と限界が議論されています。

ここで行う代表的な実験では、この特定の積層技術の使用に由来する明白な利点があります。最初の実験は、3つの代表的な写真（ 図3）内の強膜上の血管叢の多様なネットワークを示す図です。血管はCD31陽性です。 第二の実験は、特定のLYVE1 +上強膜の細胞とCD31陽性の血管との関係では、免疫細胞を示しています。ここで、Zスタック技術は、組織をスキャンし、血管及び免疫細胞（ 図4）の三次元関係を理解するために10倍の倍率で使用しました。 強膜、並びに囲まれた外眼筋は、血管または免疫細胞の存在について分析することができる。図5図LYVE1陽性細胞とCD31陽性の血管。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig1.jpg" /> 図1：人間の眼の模式画像がここで人間の目の断面の概略図である。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53920/53920fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig2.jpg" /> 図2：積層技術の概略画像強膜を慎重コリブリ鉗子で開催され、メスを用いて微細な層に積層されています。このステップを繰り返すこと、共焦点顕微鏡観察のために使用することができ、薄い組織スライドにつながる。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53920/53920fig2large.jpg" target="_blank">このFiのの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>グレ。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig3.jpg" /> 図3：Cは後方の位置からである間上強膜血管神経叢は、CD31 AとB のための免疫は 、前方上強膜に由来しています。スケールバーは100μmを示している。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53920/53920fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig4.jpg" /> 図4：CD31 +血管およびzスタックでLYVE1 +細胞、それらの間の解剖学的関係を示す小型船舶と大きいものが重なってもよいです。スケールバーは100μmを示している。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53920/53920fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図5：強膜で囲まは、外眼の筋肉である彼らは、同様の微細な血管網といくつかのLYVE1 +細胞を含みます。スケールバーは200μmで示している。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53920/53920fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

人間の強膜の共焦点顕微鏡法を実行するために積層技術を用いて、


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

7.5K ビュー.  University of Cologne. Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used. 

ビデオ: Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

発生生物学

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

生物工学

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

人間の免疫細胞の三次元可視化のための光シート顕微鏡

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

免疫・感染学

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

架橋 (TXL) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

医学

<meta charset="utf8"></head><body>上皮細胞および線維芽細胞のための高度な2層3D共培養システム

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:PVA-PCLナノファイバーメンブレンによる3D共培養システムの進歩

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

げっ歯類の外科的緑内障に対する辺縁血管神経叢の全周焼灼

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

神経科学

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

人間の強膜の共焦点顕微鏡法を実行するために積層技術を用いて、

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三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

人間の免疫細胞の三次元可視化のための光シート顕微鏡

架橋 (TXL) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

げっ歯類の外科的緑内障に対する辺縁血管神経叢の全周焼灼

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞