Name: molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
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我々はツァイスConfocor 3機器のメンテナンスのため、およびセル測定に関する役立つヒント博士Vladanaブコエビッチ、分子医学センター、カロリンスカ研究所に感謝します。この研究はVetenskapsrådet（承認番号2012- 1629年）、マグナスBergvallsのstiftelseから、とStiftelsenクレスGroschinskysのminnesfondからの助成金によって賄われていました。

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The authors have nothing to disclose.

FCSのためのこのプロトコルは、免疫細胞（マウス、ヒト、または他の種）のすべてのタイプの表面分子の分子動力学の評価のために使用することができます。生細胞における単一分子の解像度にダウンFCS対策時空間分子動力学を。分子密度、ならびに目的のタンパク質の拡散速度とクラスタリングのダイナミクスは、自己相関曲線から抽出することができます。 蛍光標識は、成功したFCS実験のために極めて重要な重要です。細胞膜上で目的のタンパク質は、従来の抗体を用いて標識され、抗体はしばしば、ナイーブ免疫細胞における表面タンパク質の使用のために最も便利です。非標識抗体は、直接、高分子明るさと光安定性の蛍光色素に結合させなければなりません。抗体結合のための蛍光体の選択は、測定の質のために重要です。フローサイトメトリーのための標準的なラベル例えばフルオレセインおよびフィコエリトリン系染料として、急速な漂白に推奨されていません。抗体に直接結合するフォト安定染料は、現在、いくつかの企業によって提供されています。製造業者は、通常、得られたコンジュゲート抗体のコンジュゲーション及び精製のために十分なプロトコルを提供し、これは数時間で行うことができます。蛍光タンパク質を使用してFCSを行うことも可能であるが、蛍光タンパク質は、ほとんどの光安定な化学フルオロフォアより漂白一般的傾向にあるので、特別な注意が、レーザーパワーを最小化するために取られるべきです。以前の経験によれば、過剰発現タンパク質の多くの場合、蛍光タンパク質の使用が適さないによる混雑の拡散速度のかなりの減少をもたらします。 測定の前にピンホールの校正も重要なステップです。焦点体積の大きさを決定するために使用されるフルオロフォアは、拡散係数を知っていなければなりませんS（式2を参照）。焦点体積の大きさを決定するために、抗体の標識の発光スペクトルに密接に対応する遊離フルオロフォアを使用してください。これは、最適な信号効率と色チャネル間の潜在的相互相関の適切な検出を保証するために行わなければなりません。システムは電力の範囲にわたって予想される出力信号を与えることを確実にするために自由に拡散する蛍光団のFCSレーザパワーシリーズを実行します。実験間の一貫性を確保するための実験の間に同じレーザパワーでCPMを比較。 分析工程では、モデルをフィッティングするときの変数のための合理的な範囲や初期値を置くことが不可欠です。良い出発点を見つけるために、同様の細胞系からの以前に発表された知識を使用してください。注意ある程度の結果を解釈する際に注意しなければならない、理論的には、FCSは、定量的な技術であるが、最適な条件はほとんど発生しないからです。変動のすべての種類が記録されます、かかわらず、このような変動の起源の。したがって、可能な誤差源を排除するために実験システムに関するできるだけ多くの情報を有することが有用です。溶液中の遊離蛍光体の推定上の汚染物質が少なくとも10倍短いTAUDに拡散するのに対し、例えば、全細胞膜の動きは、長いTAUD（ 図3A）との変動を生じさせます。 この基本的なプロトコルは、いくつかの方法で変更することができます。二つのタンパク質は、異なる蛍光体で標識されている場合、共拡散（相互作用の間接的な尺度）は、相互相関を検出する方法を拡張することによって評価することができます。これらのタンパク質は、細胞膜において互いに結合する程度は、個々のカラーチャネルの自己相関曲線の高さに対する相互相関曲線の高さで表されます。相互相関は、測定ソフトウェアでCH1〜Ch2のように表されます。プレ相互相関のcise分析は、クロストークのコントロールを必要とするので、やや複雑ここに提示プロトコルよりなります。この基本的なプロトコルの拡張として、続行する方法の詳細な説明は、Strömqvist らに見出すことができます。 13。 z方向の位置決めを最適化するために、z-スキャンFCS 22を使用することができます。これまでの経験によれば、手動でこれを行うには満足しています。 FCSの自己相関曲線23に複数の拡散係数を適合することも可能です。これは、異なる拡散速度を有すると亜集団の少なくとも一つのおおよその拡散速度の亜集団の数の事前知識を必要とします。それ以外の場合は、フィッティング信頼できないをレンダリングしますあまりにも多くの自由変数が存在するであろう。典型的な例は、その拡散速度はかなりリガンドの結合によって減速された表面タンパク質であろう。最後に、cleani完全反復配列を除去することなく、外れ値のトレースをngのは、24可能です。 蛍光シグナルの欠如は、トラブルシューティングするための共通の問題です。自由に蛍光団を拡散させるために、ドロップが蛍光性であるかどうかを確認するためにハロゲンランプを使用します。ドロップが蛍光でない場合、（nM範囲内で）わずかに増加濃度のフルオロフォアの新しいバッチをミックスして、再試行してください。フォーカスが蛍光ドロップ内にある、レーザはレーザパワーが十分であり、ソフトウェアでオンになっていることを確認し、（正しい発光フィルターと検出器が選択され、そして「FCS測定」ウィンドウで右チャンネルが活性化されるステップを参照してください3.6）。レーザーを起動し、視覚的にレーザ光がサンプルに到達したことを確認する側から見て。ストレートレーザ光源に探して避けてください。選択された放射フィルタは、レーザ波長を含む場合は、シャッターが自動的に検出器への損傷を避けるために、光路を遮断します。私Fすべての設定は大丈夫ですが、何の光が、到着していないレーザー、FCSシステム、およびコンピュータを再起動してください。蛍光シグナルの欠如が解消されない場合は、専門家に依頼してください。標識された細胞が蛍光を表示しない場合は簡略化の手順が適用されます。ハロゲンランプと蛍光の存在を確認してください。 、レーザーをオンにしたレーザチャンネルを選択して、レーザーパワーを調整します。いずれかの「十字」または「位置を追加」オプションを（ステップ6.4を参照）を使用して、細胞膜上の位置を選択します。信号は依然として低すぎる場合には、次のサンプルに切り替えます。 技術の変動基準の1つの重要な態様は、分子を検出することが合理的に移動しなければならないことです。非常にゆっくりと全体の測定時間中にフォーカスよりも小さな領域内に捕捉された分子または分子の画分を動かす従って測定することはできません。これは、表面密度の可能な過小評価と拡散率の過大評価をもたらします。漂白分子は、それらがレーザー照射焦点体積内で過ごす時間が漂白されているのより高い確率を持っていますので、また、密度とTAUD両方の推定上の過小評価に寄与することができます。背景（焦点面の外側からの蛍光）の影響は、一方で、人工的に検出された分子の数を増加させ、測定されたCPMを減少させるであろう。これまでは、絶対密度の決意で合計最大誤差は約40〜20％であると推定されました。誤差源は、ほとんどの場合、実験を通して等しいので、お互いに異なる生物学的サンプルを比較することが通常可能です。別の潜在的なエラー源は、抗体は、各抗体は、潜在的に2つの標的分子に結合することができることを意味し、二価であることです。著者らは、この現象を観察しなかったが、これは他の抗体のための世界的な機能があることを保証することはできません。二価の潜在的な影響なければなりませんしたがって、各抗体について個別に試験すること。特定の一次および標識二次抗体の組み合わせは、2つの連続した二価のラベルから人工クラスタを誘発する危険性が高いために使用してはなりません。細胞ではなく、目的のタンパク質の蛍光タンパク質で標識されたバージョンでトランスフェクトされた場合は、すべてのタンパク質は、1つのラベルだけを持つことになります。しかし、これは必ずしも望ましくないとさえ可能でないかもしれない、トランスフェクションを必要とする（ 例えば、直接にヒト血液から単離された免疫細胞を使用する場合）。最後に、シングルポイントFCSは、画像を記録しません。画像が公開または他の目的のために必要とされる場合、これらは、ソフトウェアの撮像部を用いて別々に捕捉されなければなりません。常に細胞表面の不要な漂白を避けるために、FCS測定後の画像を取り込みます。 FCSは異なり、例えば、FRAP、画像相関方法として、従来の共焦点系顕微鏡は、蛍光の変動を定量化することができません単一分子レベル6で。画像相関法が間接的に低い解像度を有する分子の数を測定するが、それらは全体の画像化された領域25の上に分子拡散およびクラスタリングのばらつきを評価することができます。共焦点顕微鏡により測定した標準SPTは、標識の理想的なレベル、FCS 7よりも低い桁違いを持っています。したがって、標識されたタンパク質の濃度は、標準的なSPTによって測定することができません。他の顕微鏡技術とSPTの組み合わせ（ 例えば、確率的光学再構築顕微鏡または光活性化局在顕微鏡）は、密度と動きを評価することができますが、それは非常に特殊な染料やタンパク質11が必要です。このような構造化照明顕微鏡などの超解像技術、および発光枯渇顕微鏡を刺激し、多くの場合、固定したサンプルとlabelinのための一次および二次抗体の組み合わせを必要としますグラム26。システムのダイナミクスが頻繁に評価することはできないが局在化は、したがって、非常に正確です。 SPTと超解像技術と比較すると、FCSはまた、結果の分析および抽出のために大幅に少ないコンピュータパワーと時間を要します。フローサイトメトリーは、免疫学の主力であり、良好FCSと組み合わせることができます。光安定性色素が選別前に使用された場合、細胞選別は、例えば、選択された細胞集団のその後の測定によって追跡することができます。 FCSは、このように、単独で、または他の確立された方法と組み合わせて使用​​することができる方法です。 このプロトコルは、単一分子レベルでの細胞膜内の免疫細胞の動態との相互作用の現在未知の機能を同定するために用いることができます。また、選択されたサブセット対全集団の特徴を比較することができます。それはまた、免疫細胞療法の選択ステップとして潜在的な役割を有しています。測定は行うので、電池を消費し、免疫細胞の機能を調べるための最も他の方法とは異なり、個々の細胞は、潜在的に回収して培養することができるではありません。したがって、FCS曲線の分析の後、有望な細胞を抽出することができると推定される臨床用途を含む付加的な用途に拡大しました。

多くの免疫細胞の機能は、分子拡散し、膜内の相互作用に依存しています。生体膜は複雑であり、免疫細胞の機能に重要であり得る多くの因子が細胞膜1内のタンパク質の並進拡散の速度に影響を与えることができます。我々は最近、自然免疫系に属するナチュラルキラー（NK）細胞、リンパ球、NK細胞活性化2の状態に応じて、細胞膜の2つの研究のタンパク質の差拡散を示すことが示されました。 蛍光相関分光法（FCS）は、生体膜内の分子の拡散速度を定量化することが可能な技術です。これは、固定されたボリューム内の蛍光標識された分子の平均拡散速度、共焦点顕微鏡の一般的に焦点を報告します。これは、中分子運動の際に発生する蛍光の変動の測定に基づいています定常状態でのシステム。 FCSは、溶液中及び脂質膜の中に両方の蛍光色素とタンパク質の拡散を研究するために広く使用されています。拡散速度に影響を与える他の出力パラメータは、また、間接的にこの方法で研究することができる（ 例えば、タンパク質または細胞膜上の分子の相互作用の立体構造変化）3、4。 FCSは、単一分子検出のための可能性を可能にする、その高い感度のために他の技術に比べて際立っています。これは、ほとんどのタンパク質5の内因性発現レベルに典型的なミリモルの範囲にナノモル、中の分子の濃度に適しています。他のほとんどの技術が唯一のタンパク質発現レベルについての相対的な情報を提供しながら、さらに、FCSは、研究ボリューム内のタンパク質の絶対数の近似値を与えることができます。膜内の分子拡散速度を測定する他の方法は、フルオが含まれます（FRAP）を光退色後のrescence回復、単一粒子追跡（SPT）は、複数のピンホールFCS、および画像相関方法。 FRAPと画像相関法は、一般の分子10の絶対数についての情報を与えていないアンサンブル技術です。 SPTと比較すると、FCSのスループットは、母集団の平均を特徴付けるの点で高くなっています。レーザー焦点内に存在する分子の平均拡散速度がなく、1つの分子の速度よりも、測定されているので分析も負担が小さいです。特殊な顕微鏡は11用意されていない限り、標準的なSPTの標識は、単一分子の同定を可能にするために非常に低くなければならないためにも、SPTは、濃度に関する情報を与えることはできません。一方、FCSは、研究中の分子がモバイルであることが必要です。それは単に非常にゆっくりと移動し、任意の推定される不動の分画または分子を検出しません。その分子の拡散速度取得時間の10分の1程度が正しくFCS測定3、12で表現されることはありませんよりも長い焦点内に存在します。したがって、FCSによって記録された拡散係数がto-不動-近く、非常に遅い画分も同様に考慮されFRAPとSPT、のような技術から報告拡散速度よりも速くなる傾向があります。 SPTはまた、FCSの意志よりも分子集団内での拡散速度の変動のより詳細な説明を行います。 FCSは興奮ボリューム内の経時的な蛍光強度の変動を定量化します。膜測定の場合には、これは、膜の照明領域に変換されます。本稿では、そのような変動はブラウン拡散を示す分子によって誘導されるため、および励起体積の外に移動しているという事実を利用しています。 fluctuaのためのいくつかの他の可能なソースもあります。このような結合バインド解除、全細胞膜のリガンド、または運動の、点滅またはフルオロフォア、環境への影響で三重項状態の存在のような蛍光シグナルのン、。これらの推定上の誤差源は、正確な結果12、13を解釈するためにFCS実験を設計する際に考慮される必要があります。一般的に、生体膜における横方向の拡散率は、膜タンパク質の間にタンパク質および細胞骨格間の両方、混雑との相互作用に起因する低いです。歴史的には、膜中のFCSを使用することは、従って、励起焦点14を貫通通過時間中に退色を避けるために必要な光安定性蛍光体の欠如によって妨げられてきました。しかし、今日、適切な光安定性染料のためのオプションがたくさんあります。検出器および他のハードウェアの大幅な改善はまた、蛍光proteの検出を可能にします低輝度のインおよび染料。ここでは、目的のタンパク質は、蛍光タグ化抗体で標識されたマウス初代リンパ球を用いたFCSの適用のための基本的な手順について説明します。拡散係数および分子密度を抽出するために自己相関曲線を適合させる手法も示されています。プロトコルは、簡単に分子の拡散を研究するための技術の以前の経験を持つ免疫学者が続くことを目指しています。しかし、共焦点顕微鏡の基本的な理解が期待されている（参照15を参照して 、この基本的な理解を得るために）。このプロトコルは、比較的容易に他の懸濁細胞、細胞株および初代細胞の両方に適合させることができます。より洗練された分析方法が存在し、より経験豊富なFCSユーザーの場合、そのうちのいくつかは、議論に記載されています。

<table><tbody><tr><td>MACS NK Cell Isolation Kit mouse II</td><td>Miltenyi Biotec Norden&lt;sup&gt;AB&lt;/sup&gt;</td><td>130-096-892</td><td>Negative selection of NK cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>-</td><td>-</td><td>Made in house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td><td>PAA The Cell Culture Company&amp;nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Transparent medium</td></tr><tr><td>Antibody clone 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>For blocking Fc-receptors.</td></tr><tr><td>Anti-Ly49A antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Dd antibody&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>Conjugated in house to MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Fluorescent dye for antibody conjugation.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Diluted in distilled water (1.10)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td>Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Rhodamine 110 chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Known diffusion coefficient: 3.3 &amp;times; 10&lt;sup&gt;&amp;minus;10&lt;/sup&gt; m&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/sec &lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A20006</td><td>Known diffusion coefficient: 4.4 &amp;times; 10&lt;sup&gt;&amp;minus;10&lt;/sup&gt; m&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/sec &lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Software: Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab with curve fitting toolbox</td><td>Matlab</td><td>Version R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo-scientific&amp;nbsp;</td><td>155411</td><td>8 wells, 1.0 borosilicate bottom</td></tr></tbody></table>

molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy

蛍光相関分光法（FCS）は、高い空間及び時間分解能で生体膜内の分子の拡散を研究するための強力な技術です。 FCSは、細胞膜に蛍光標識された分子の分子濃度及び拡散係数を定量化することができます。この技術は、（プロセスは実際の測定時に結果に影響を与えることなく、すなわち、）定常状態における免疫細胞の原形質膜中の分子の分子拡散特性を探索する能力を有します。 FCSは、ほとんどの内因性タンパク質のための典型的なレベルで発現されるタンパク質の拡散を研究するのに適しています。ここでは、一次リンパ球上の細胞膜タンパク質の拡散速度を決定するための簡単かつ堅牢な方法が示されています。抗体染色生細胞と買収後の一般的に存在する観測に測定を実行するための効果的な方法が記載されています。最近の進歩フォト安定した蛍光色素の開発に測定中に広範囲に漂白しない染料を適切なために目的の抗体を結合することにより利用することができます。また、これは、細胞膜に発現したタンパク質の共通の特徴である、ゆっくりと拡散するエンティティの検出を可能にします。生成された自己相関曲線から分子濃度と拡散パラメータを抽出するための分析手順が強調表示されます。要約すると、FCS測定のための基本的なプロトコルが提供されます。それは、共焦点顕微鏡の理解ではなく、このような分子の拡散速度などの動的パラメータを測定するための技術の無い他の以前の経験と免疫学者を続けることができます。

典型的な結果は、膜タンパク質のための400ミリ秒に10ミリ秒の範囲内の通過時間との自己相関曲線を生成します。分子の数は、内因的に発現するタンパク質を約200μmの2あたりに0.5の間で変化することができます。 CPMが予想より低くないことを慎重に確認してください。これは、バックグラウンド信号の影響があることを意味します。経験則として、分析のために受理された細胞上のCPM信号が自由に同一のレーザパワーで抗体を拡散させるためのCPMの33％よりも低くするべきではありません。 CPMは、レーザパワーで直線的に拡張する必要があります。一次免疫細胞表面受容体に対する自己相関曲線は0.001と1秒との間の最も急な部分と、滑らかであることが期待されます。代表的な自己相関曲線とそのタイム・トレースについては、 図2を参照してください。 導入部で簡単に述べたように、再FCSが原因で信号を交絡するために貢献する蛍光変動の他の供給源の影響で分子拡散を測定するのに適していないいくつかの例です。 図3は、特定の細胞または測定の繰り返しを破棄すべき例の例を示しています。すでに非常に低い信号（非常に低いCPM）は、セルを廃棄するための原因であることが言及されています。個々のセルを廃棄するための別の理由は、セルが（ 図3A）に移動していることです。効果は測定全体を通してかなりまたは存在する場合に漂白の場合（ 図3B）、または大規模なクラスタが存在する場合（ 図3C）では、測定値は破棄されるべきです。この機能は、1つまたは2つの反復中にのみ存在する場合、これらの個々の反復は、廃棄することができるが、残りの反復はまだ使用されてもよいです。 両方が正しい使用することが重要ですデータに合わせて、また、フィット感が密接に自己相関曲線と重なっていることを慎重に確認するためのモデル。 図4では、良好な悪いカーブフィットの例が示されています。拡散を表す曲線（最も急傾斜部分）の部分には細心の注意を払ってください。開始と曲線の傾斜部分の両端は、モデルによってよくフィットしていることを確認することも重要です。フィットは、細胞を廃棄する最終決定を行う前に、開始値及び/又は（合理的な範囲内）に上限値と下限値を変更する、移動、漂白、又はクラスターのような明白な問題もなく、不良である場合。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig1.jpg" /> 図1：FCSソフトウェアインターフェイス。ここに示されているプロトコールに記載されているように、FCS取得および画像化のためのソフトウェアツールを動作させるために必要なメインウィンドウです。ウィンドウA、「構成のControl」ウィンドウには、イメージング用のビーム経路、レーザー・チャネル、およびフィルタのための制御ウィンドウです。ウィンドウBは「スキャン制御」スキャンの設定イメージング用のウィンドウと表示されます。ウィンドウCが「測定」ウィンドウのための窓FCSの測定設定のセットアップ。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54756/54756fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig2.jpg" /> 図2：H-2D D 主要組織適合性クラスを 拡散の代表的なトレースと自己相関曲線は、 私は新たに単離したマウスNK細胞内の分子表面。図の上のパネルは7倍10秒測定の全体時間トレース全体で時間の関数としての蛍光の変動を示しています。下のパネルは表しこれらの7つの反復からの平均自己相関曲線です。自己相関曲線の高さが焦点体積内の移動、蛍光標識されたH-2D dのエンティティの濃度に反比例します。 x軸曲線の傾きの最も急な部分の値が、振幅の半分は、焦点体積内の蛍光標識されたH-2D dの分子の平均滞留時間を表します。提示された測定は、文献2に公開されたデータセットの一部です。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54756/54756fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig3.jpg" /> 図3： 問題のあるセルのトレースの例 。トレースによって例示されるような（A）移動する細胞、安定した基礎ルを有していませんVEL。上部パネルは、この時点の後、非常に低い信号によって表されるような全細胞は、約35秒後焦点外に移動した例を示しています。下のパネルでは、効果は数秒の間隔で見かけのうねりで、より微妙です。 （B）細胞は、漂白、時間とともに減少するトレースの高さを表示します。測定終了時と、測定開始時のトレースの高さを比較してください。 （C）大規模なクラスタの存在、微量の急増によって表されます。上のパネルでは、20〜25秒で一つの大きなクラスタが存在しています。下のパネルでは、複数のクラスタは、測定全体に存在しています。提示測定は、参考文献2に公開されたデータセットの一部です。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54756/54756fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図4： カーブフィッティングと残差を持つ代表的自己相関曲線。赤と青の縦線は、フィッティングのために使用される時間ウィンドウの範囲を表します。試料の自己相関曲線の2次元拡散モデルの代表的な適合の（A）の例。上のパネルでは、緑の曲線（モデル）は、良好なフィット感を示し、青い曲線（取得自己相関）をオーバーレイします。下のパネルは、カーブフィッティングから残留を示しています。うまく装着されていない1秒の周りの変動は、セル測定のための典型的であり、許容されています。 （B）と同じ自己相関曲線に2次元拡散の悪いフィットの例。フィットされたモデルは、自己相関曲線をオーバーレイしません。また、（AとB）1.下のパネルで収束しないフィッティング曲線からの残留を示しました。残差特にカーブの拡散部のため、悪いフィット感を大幅に大きくなっています。提示された測定は、文献2に公開されたデータセットの一部です。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54756/54756fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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蛍光相関分光法で測定した初代リンパ球の細胞膜における分子拡散 |免疫学と感染症 |ビデオ

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

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10.8K ビュー.  Karolinska Institutet. A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

ビデオ: Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

免疫・感染学

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

生化学

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

生物工学

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

生物学

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

要約

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傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスターサイズ

k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

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傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスターサイズ