This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

<ol>
	<li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks.">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li><li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. 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X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires:+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies.">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li><li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning,+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination.">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li><li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

FRETは、ここで説明するフローサイトメトリーシステムを迅速かつ定量的にタウ播種活性を評価するための強力なツールです。これは、中程度の細胞培養の経験とFRETの実用的な知識を必要とし、フローサイトメトリー。このようチオフラビンTのような他の播種アッセイ、 - βシート構造に結合したときに増強された蛍光を示す - 面倒であり、純粋な、組換えタンパク質基質を必要とします。さらに、タウのためのin vitroアッセイは、播種のみ半定量的およびシード材料23,24のナノモル以下のレベルに一般的に鈍感です。フローサイトメトリーFRETしかし、組換えまたは生物学的サンプルのいずれかから播種活性の定量と絶妙に敏感な尺度を提供します。また、プロシージャの適応は、タンパク質凝集疾患の様々な検討することが有用なものにすることができます。 本明細書に記載されたプロトコルは、タウの播種に焦点を当てているが、単純な修正が必要とされるトンO proteopathic種子の別のタイプから播種アクティビティを監視することを可能に。ホームズとファーマンらが実証された。、CFPまたはYFPのいずれかにタグ付けされた安定的疾患関連A53T変異を保有するαシヌクレインを発現するモノクローナル細胞株の作成 ​​は、完全長のαシヌクレイン組換え原繊維16から播種活動の高感度検出を可能にしたよう。同様の実験はまた、効果的にタンパク質凝集を検出した、ハンチンチンのバイオセンサセルを使用して行われてきました。したがって、単にタンパク質バイオセンサーを変更することによって、フローサイトメトリー、多数の種子源と互換性がありFRET。治療パラダイムと細胞モデルを含むアッセイの他の変形例は、FRET生理学的メカニズムを評価する多くの適用可能なフローサイトメトリーを作製するために使用することができます。このプロトコルでは、種子を直接感度を向上させる方法として、リポソーム媒介形質導入を介してバイオセンサ細胞に導入しました。 これは、nに重要ですOTE、しかし、これは必要条件ではないこと。組換えまたはマウスの生物学的サンプルはまだリポソーム（ 図5）の不存在下でバイオセンサーの細胞を播種することができるから、タウが集約されます。したがって、生理的伝播および/またはタウ種子の取り込み機構を研究に興味を持ってラボはまだアッセイを使用することができます。さらに、フローサイトメトリーの一次神経細胞培養と互換性がありFRET。メッキ時CFP-とYFP符号化されたレンチウイルス構築物を細胞に感染させることによって、効率的なFRET応答性であっても、リポソーム（ 図5）の非存在下で、組換えタウ原線維を用いた治療の後に、ナノモル濃度で達成されます。まとめると、これらのデータは、FRETのフローサイトメトリーは、タンパク質凝集体の様々な複数の細胞培養モデルにおける播種の生理学的メカニズムを研究するために有用であることを示しています。 FRETのフローサイトメトリーシステムはユーザーフレンドリーで適応可能であるが、特定の重要なステップは次のようになります処理時の試料調製および適切な細胞集密度を含む、互換性を確保するために行きました。脳標本の高輝度プローブ超音波処理は、播種の活動を効果的かつ最適な分離のために重要です。開発と最適化の間に、それは、この方法は、他の一般的な技術 、例えばハンドヘルド均質化に比べてP301Sマウスの脳から播種の活動を隔離で10倍以上効果的であることが観察されました。これは、非常に大規模なタウ凝集物は、比較的低い播種傾向があり、そのプローブ超音波処理が小さく、種子互換フラグメントにこれらの凝集体を破壊するために最も有効であることが可能です。必要に応じて、上記の設定は播種活動の高感度検出のために推奨されているが、超音波処理の持続時間と頻度は、変更することがあります。 それは感度と細胞の健康の両方に影響を与えるとして処理時の細胞の密集度は、最も重要でもあります。セルAの場合あまりにコンフルエント再、彼らは容易にそれによって劇的に感度を減少させ、リン脂質とシード材料を取ることはありません。密集度が低すぎると、リン脂質およびシード材料の添加は、毒性であり得ます。実証試験は60から65までパーセントのバイオセンサーの密集度は、治療とその後の反応のために最適であることを示しています。 プロトコルで述べたように、補償アルゴリズムは、定期的に、それによって偽信号を除去し、感度を増加させ、YFPおよびFRETチャネルにCFPのスピルオーバーを除外するために使用されます。播種活性の迅速かつ定性的な評価のために、しかし、この工程は、フローサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて事後省略または実行されてもよいです。クリーンでより強固な信号は、しかし、補正後に得されるため、最も厳しいと定量分析のために、この手順を強くお勧めします。 アッセイの制限は、生化学的に報告することができないことです 物の組成proteopathic種子。現在のアッセイは、播種活動、種子の機能特性。種子の生化学的および生物物理学的性質の決意はそれにもかかわらず、このアッセイは無数の標本からエンドポイントとして播種効力を評価するのに有用であることを証明しますなど免疫沈降、クロマトグラフィー、円偏光二色性、質量分析法、などの従来のアッセイとの結合が必要になります。 このアッセイは、最近、このような組織学的染色などのタウ沈着の他の一般的なマーカーを基準とする相対P301Sマウスに発症と進行を播種の時間経過を定量化し、特徴づけるために使用されました。本研究では、タウ播種活性は前に私達は16をテストした最も初期の組織学的マーカー（MC1）に6週間にわたって明らかでした。その初期の外観を考えると、活動を播種することは、少なくとも予備的な研究のために、治療的介入の有効性を評価するための重要な補足、あるいは代替、アウトカム指標を表すことができます。治療コースを短縮し、若い動物を研究することによって、住宅費、実験所要時間が減少します。これは、治療薬は、2-4週間後に播種活性について評価した4-6週間後、脳におけるP301Sマウスに投与することができると考えられます。あるいは、細胞における抗タウ治療の評価は、図5に示すように、バイオセンサ細胞で播種活性の誘導をブロックする能力を評価することによって日以内に実行することができます。 結論として、アッセイを播種FRETのフローサイトメトリーは、組換えまたは生物学的供給源からのタウの播種を検出するための簡単​​かつ効率的な方法です。その感度は、 インビトロでのタウ播種アッセイによって比類のない他のであり、P301Sタウオパチーマウスにおいて最も早い病変を検出するために使用することができます。さらに、異なる処理条件の下で、複数の細胞培養モデルで多数のproteopathic種子をモニタリングにおけるその柔軟性は、それのために有用です迅速に定量的データの収集に興味を持って任意のタンパク質凝集実験室。

細胞内のタウアミロイドの蓄積がアルツハイマー病などのタウオパチーを定義します。疾患の早期段階で、病理学は、一般的に脳の別々の領域に局在しているが、疾患の進行と、病理学は、常に明確なニューラルネットワーク1-5に沿って広がります。証拠の蓄積は毒性タンパク質凝集体の細胞間伝播が（6-10のレビュー）この病理学の根底を示唆しています。このモデルでは、proteopathic種子（ 例えば 、タウ）は、テンプレートコンホメーション変化を経て11月15日ミスフォールド形式にネイティブタウタンパク質を変換する、ドナー細胞から放出され、隣接するセルを入力されています。ここに記載のアッセイは敏感にそのようなシーディング活性を検出するために開発されました。これは、組換えタンパク質および生物学的サンプルと互換性があり、proteopathic播種アクティビティ16の微小レベルの定量を可能にします。 安定タウ繰り返しdを表現するHEK 293T細胞CFPまたはYFPのいずれかに融合された疾患関連P301Sの突然変異を含むomain（RD）は、播種活性の安定したバイオセンサーとして機能する（以下、タウ-RD-CFP / YFP細胞と呼ばれます）。 proteopathic種子の非存在下では、細胞は、可溶性単量体としてタウを維持し、感知できるバックグラウンドFRETがありません。細胞への自発的な取り込みまたはタウ種のリポソーム媒介形質導入、しかし、フローサイトメトリーを介して、単一の細胞内で測定されるFRETシグナルを生成RD-CFPとRD-YFPの集約、で結果。 このアッセイの多数の構成要素は、感度を高め、ばらつきを低減するように設計されました。 1を有するモノクローナル細胞株：それは最適な信号を提供するよう1 RD-CFP / YFP発現率は、選択された：ノイズを。感度を高めるために、リン脂質は、直接細胞内に種子を導入するために使用された（取り込みの生物学的機構を研究するが、これを省略することができます）。最後に、フローサイトメトリーモニタは集団レベル、単一細胞にFRET<html>レベル、他のタンパク質凝集アッセイとは異なり。最終アウトカム指標、統合されたFRET密度は、高度に定量的であり、両方の集合を有する細胞の数、及び凝集は、各セル内で発生した程度を占めます。これらの最適化されたパラメータのすべては、感度を向上させ、再現性を確保します。 このシステムは、最近、他の一般的に使用されるタウ病理学的マーカー （例えば、MC1、AT8、PG5、およびチオフラビンS）にタウ播種活動の相対的な時間的な発症と進行を評価するトランスジェニックマウスP301Sタウオパチー17に包括的な研究で用いました。シーディング活性は、少なくとも6週間の組織学的検出の前に、これまでで評価しタウ病理の初期の、最も堅牢なマーカーです。種まき活動が発症および/ ​​または神経変性16の進行におけるproteopathic種子の因果的役割を示唆し、年齢とともに徐々に1.5ヶ月と増加に表示されます。 e_content &quot;&gt;生物学的サンプルからのシード材料の微細なレベルの正確な定量化は、初期の疾患の進行をモニターする研究を容易にすることができる試験の期間を短縮し、より若い動物の使用を可能にすることで、これは前臨床動物試験の効率及び精度を高めることができる。例えば、でP301Sマウス先に述べた、鉛化合物は、初期の4〜6週間ほどお届けすることができ、2〜4週間後に有効性について監視。アッセイが正確に播種内の任意の削減を定量化する必要があります（または播種活動の開始時の直前に）アクティビティ。フローサイトメトリーFRETは、同様にインビトロスクリーニングの用途を有する。例えば、抗タウ試薬（ 例えば、抗体 、小分子など ）、組換えタウを使用して、培養物中に直接播種誘導をブロックする能力について迅速に試験することができますシード源（ 図5）。このセットアップでは、シード材料を準備したら、元のような凝集体または脳由来の溶解物perimentは、データ分析など、完了するまでにわずか3日かかります。 proteopathic播種活動の急速な定量化は、このように神経変性の多くの研究を容易にすることができます。

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Boats</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Noise Cancelling Ear Muffs</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>USA Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx&quot;&gt;1615-5510&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml reagent resevoirs</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Multi channel pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96 well flat bottom plates</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom plates</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo analysis software</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l pipet tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

FRETフローサイトメトリー敏感、定量、および組換えまたは生物学的サンプルからの播種活動の迅速な検出を可能にします。アッセイセットアップが容易である：タウ- RD-CFP / YFPを発現しているモノクローナル由来の安定な細胞株は、24〜48時間インキュベートし、シード材料を用いて形質導入し、分析（ 図1A）、フローサイトメトリーに供しています。種子の不在下では、バイオセンサセルは、可溶性、モノマー形態（ 図1B）でタウを維持します。シードの存在下で、しかしながら、バイオセンサ細胞はフローサイトメトリーを用いてセル単位で検出されたFRET応答を生成し、凝集状態（ 図1C）にτを変えます。定量的評価は、バイオセンサセルは、シード材料のフェムトモル濃度に応答し、そのシード活動が効果的に3桁の大きさ（ 図1D）にわたって測定することができることを示しています。 ゲーティングパラメータは、TRの検出を確実にするために確立されましたUEは、低シード濃度で、信号をFRET。まず、標準的なゲーティング法は、細胞集団（ 図2A）および単一細胞（ 図2B）を単離するために使用されます。偽FRETシグナルは、405 nmレーザーによってYFPの直接的な活性化から生じる可能性があります。したがって、偽FRETゲートは汚染信号（ 図2C）を除外するYFP単一陽性細胞集団から引き出されます。最後に、FRETのゲートは、非シードCFP / YFPデュアル陽性細胞（ 図2D）から定義されます。ゲートが上方に延びる人口の斜面付近で描かれ、そこから離れて左にされています。非刺激細胞は、バックグラウンドは約1％に設定した値をFRETているはず、とFRET陽性細胞（図2Eおよび2Fを比較 ）は、用量依存的にこのゲートにシフトします。複数のパラメータは、FRETに考慮されるなど、フローサイトメトリー：パーセント陽性（ すなわち 、全細胞数あたりのFRET陽性細胞数）と、すなわち 、程度はFRET応答はFRET陽性細胞で生産された中央値蛍光強度（）。それは、これらの2つの変数の積であり、完全に任意のサンプルによって誘導さ播種活性の程度を表すように統合されたFRET密度は、好ましい転帰尺度です。 4つの異なる脳領域の顕微解剖後。フローサイトメトリーは、図3に表示されているように、でも若い年齢で、P301Sタウオパチーマウス由来の脳溶解物と互換性のあるFRETフローサイトメトリー脳幹（ 図3A）から播種活性を測定するために使用されたFRET、新皮質（ 図3B）、前頭葉（ 図3C）、および年齢の範囲にわたってP301Sマウスにおける海馬（ 図3D）。各地域では、播種活性は年齢とともに増加し、ちょうど1.5ヶ月で現れました。しかし、タウノックアウトマウス（「KO」）&gt; 12モスは播種活性を示したことはありません。時間と比較すると同じ動物内で行わistological分析は、これはすぐにコンホメーション異常なタウ（MC1）、過リン酸化タウ（AT8とPG5）、およびアミロイド立体構造のマーカーを含むタウ沈着（ 図3E）のいずれかの他のマーカーの出現、より6週間です（チオフラビンS）。機構的な観点からは、タウ播種活動の近位検出は、タウオパチーの発症および/または進行の原因メディエーターとして種子を示唆しています。実験的な観点から、これは播種活性の分析は、その早期かつ堅牢な外観を与えられたタウ沈着の標準アウトカム指標に理想的なサプリメントであることを示唆しています。 トランスジェニックマウスに加えて、フローサイトメトリーFRET人間の脳溶解物と互換性があり、容易にアルツハイマー病被験者（ 図4）から単離されたタウ凝集体を検出することができます。 P301S脳溶解物のために、ここで説明したように凍結ヒト脳組織を活性播種、同様に均質化された場合ロバストAD被験者から派生したすべての試料から検出されました。これとは対照的に、シーディング活性は、年齢が一致するか、ハンチントン病対照被験者の溶解物から検出されることはありません。これは、タウ凝集体のためのアッセイの特異性を強調しています。 この論文の焦点は、HEKの293Tバイオセンサーセルに凝集体のリポソーム媒介送達を使用したタウ播種活性の高感度検出で​​あるが、多くの生理学的な細胞培養パラダイムは、基本的な細胞取り込みメカニズムを評価するためにフローサイトメトリーFRETを用いて行うことができます。例えば、一次神経細胞培養物は、タウ - RD-CFPとタウ-RD-YFPを発現するレンチウイルスに感染させることができる、めっき時に作成します。 DIV4で、凝集が未処理細胞（ 図5A）には存在しないが、種子を含有材料（ 図5B）で処理した神経細胞で検出可能です。重要なことは、リン脂質は、生理学的およびPATの調査を可能にして、これらの実験で除外されています<html> hophysiological播種メカニズム。従って、タウ原線維の適用は、神経HSPG媒介取り込みをもたらし、FRETのフローサイトメトリー（ 図5C）を用いて定量することができる用量依存的に凝集を刺激します。さらに、アッセイは、タウの取り込みの治療の評価のために使用し、HEK 293Tタウバイオセンサセルを使用してインビトロで遮断を播種することができます。偶数リン脂質の非存在下での、組換え線維（ 図5D）とP301S脳溶解物（ 図5E）の両方は、タウ凝集を誘導します。ヘパリンこれらのタウ種のプレインキュベーションは、（以前HSPG媒介タウ取り込みの強力な阻害剤であることが示されている）、ただし、それらの播種能力を排除します。この実験は、任意の薬剤（ 例えば、抗体 、小分子など ）に適用することができ、取り込みおよび/ ​​または種子修飾治療薬の迅速な評価を可能にします。 グレ1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 53205 / 53205fig1.jpg &quot;/&gt; 1. FRETは、フローサイトメトリーの図は、敏感タウ播種アクティビティ16を検出する 。タウ-RD-CFP / YFPを発現するモノクローナルHEK 293T細胞を、フローサイトメトリーを使用して、組換えまたは生物学的サンプルを用いて形質導入24-48時間インキュベートし、そして単一細胞に基づいて分析しました（A）。非刺激細胞は、シード含有材料表示目立つインクルージョン（C）で処理した細胞に対し、単量体状態（B）におけるタウ-RDを維持します。播種活動の定量的評価は、（平均±SEM）のFRETフローサイトメトリーは、組換えシード材料のフェムトモル濃度（モノマー換算）に敏感であり、検出は三桁（D）をまたがっていることを示しています。モノマーと同等の線維化反応中に含まれるタンパク質の総量を表し、不完全な＆のために修正されません。＃160;凝集物質へのモノマーの取り込み。したがって、実際の骨材（種子）の濃度は、以下の「モノマー同等」に等しくなければなりません。 *ホームズとファーマンら 16から変更された<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig2.jpg" /> FRETフローサイトメトリー。細胞集団（A）と一重/二重（B）ゲートの図2.ゲーティング戦略は、方法論標準的なフローサイトメトリーで描画されます。偽FRETゲート（C）は、FRETフィルターにYFPのbleedthroughを排除するために、単一のYFP陽性細胞から引き出されます。 FRETゲート（D）のような、空のリポソームで処理した細胞から構成されていますその背景FRETは≥1％です。 FRETゲートへの人口移動は、シード陽性物質（E）で処理した後で表示されており、シフトは、シード材料のより高い量（F）と、ますます顕著になります。最終的な読み出しは、次のとおりです。％のFRET陽性のイベント、および統合されたFRET密 ​​度（統合FRET密 ​​度=パーセント陽性細胞がMFIの*）の陽性、蛍光強度中央値（MFI）をFRET <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig3.jpg" /> P301Sマウス16におけるタウ播種アクティビティ図3.進行。 P301Sマウスの脳ホモジネートからの種まき活動は、（平均±SEM）脳幹で1.5ヶ月で明らかです（）、新皮質（B）、前頭葉（C）、および海馬（D）。しかし、播種活性がタウノックアウトマウス（&gt; 12ヶ月）で観察されることはありません。種まき活動は、年齢とともに増加し、MC1、AT8、およびPG5（E）を含む他の一般的な組織学的マーカーの出現に先行します。 *ホームズとファーマンら 16から許可を得て転載<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig3large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig4.jpg" /> FRETの図4の互換性は、ヒトの生体試料16とフローサイトメトリー 。タウ-RD-CFP / YFPバイオセンサー細胞を20μgのヒト脳の溶解物で形質導入された場合には、堅牢な播種（平均±SEM）試験したすべてのアルツハイマーdiseaで発生年齢をマッチさせたとハンチントン病のコントロール溶解物に対し、SEの頭脳は、播種活性を欠きます。 *ホームズとファーマンら 16から変更された<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig5.jpg" /> 図FRET 5.別の用途は、レンチウイルスエンコーディングタウ-CFPを形質導入したフローサイトメトリー16。一次ニューロンを流れ、タウ-YFP構築物。外因性の種子がない場合には、明らかな凝集（A）はありませんが、種子（B）の存在下にあります。ニューロンのバイオセンサーも、リン脂質媒介送達（C）の非存在下で、組換えタウ種子に用量依存的に応答します。組換えのプレインキュベーション（D）または双方向ヘパリンと学的（E）シード源は、HSPG媒介タウ種の取り込みの阻害剤は、HEK 293Tバイオセンサー細胞の応答性をFRET枯渇します。定量的評価が表示されます（平均±SEM）。 *ホームズとファーマンら 16から変更された<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53205/53205table1.jpg" /> 表1： FRETと共に使用される細胞株は、フローサイトメトリー。HEK 293T細胞を、フローサイトメトリーのセットアップのために使用されます。 CFP単一陽性細胞は補償（*）のために使用されます。 YFP単一陽性細胞を405nm励起によるYFPの直接活性化に起因する誤ったFRETシグナルを除去するために使用されます。 CFP / YFPデュアル陽性細胞は、FRET互換性があり、として機能バイオセンサーセル。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205table1large.jpg" target="_blank">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/53205/53205table2.jpg" /> 表2：レーザーとフィルタの設定フローサイトメーター <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205table2large.jpg" target="_blank">このテーブルの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K ビュー.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

ビデオ: Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

発生生物学

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

免疫・感染学

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

がん研究

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

生物学

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal allophycocyanin (APC) fluorescence intensity, are conjugated to antibodies specific to a particular analyte. Next, a selected panel of defined capture bead sets is incubated with a biological sample containing target analytes specific to the capture antibodies. A biotinylated detection antibody cocktail is added, which leads to the formation of capture bead-analyte-detection antibody sandwiches.
Finally, streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) is added, which binds to biotinylated detection antibodies, providing fluorescent signal intensities in proportion to the amount of bound analyte. The PE fluorescent signal of analyte-specific beads regions is quantified using flow cytometry, and the concentrations of particular analytes are determined using data analysis software and the standard curve generated in the assay.
In this experiment, we use a mouse T helper cytokine panel to simultaneously quantify the concentration of 13 separate cytokine targets in tissue culture supernatants collected from mouse splenocytes cultured under various stimulatory conditions.

This protocol describes the quantification of multiple cytokine targets simultaneously in tissue culture supernatants collected from stimulated mouse splenocytes using multiplex bead based immunoassay platform and a flow cytometer.

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

ヒト好中球におけるβ2インテグリン活性化阻害剤のスクリーニング

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

著者スポットライト:β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを同定する方法の開発 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

要約

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フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフローフローサイトメトリーを用いた測定

蛍光レポーターの pH 依存性を用いたフローサイトメトリー流 mt 桂馬によって Mitophagy の高感度測定

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

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フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

蛍光レポーターの pH 依存性を用いたフローサイトメトリー流 mt 桂馬によって Mitophagy の高感度測定

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフローフローサイトメトリーを用いた測定