This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

<ol>
	<li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks.">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li><li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome.">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li><li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia.">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+Alzheimer's+disease-related+neurofibrillary+changes.">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation.">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li><li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies.">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+properties+of+Tau+protein:+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target.">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles.">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds.">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li><li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer's+Disease.">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo.">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li><li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires:+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies.">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li><li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning,+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination.">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li><li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

מערכת cytometry זרימת סריג המתוארת כאן היא כלי רב עוצמה להערכת פעילות זריעת טאו במהירות ובכמותית. זה דורש רק ניסיון מתון תרבית תאים וידע בסיסי של סריג וcytometry זרימה. מבחני זריעה אחרים, כגון Thioflavin T - אשר מציגה משופר הקרינה כאשר חייב מבנה גיליון בטא - הם מייגע ודורשים מצע חלבון טהור, רקומביננטי. בנוסף, במבחנה מבחני זריעה לטאו הם חצי כמותית בלבד, ובדרך כלל רגישים לרמות subnanomolar חומר זרע 23,24. סריג cytometry זרימה, לעומת זאת, מספק מדד כמותי ורגיש להפליא של פעילות זריעה מדגימות או רקומביננטי או ביולוגיות. יתר על כן, עיבודים להליך יכולים לעשות את זה שימושי ללמוד מגוון רחב של הפרעות צבירת חלבון. בעוד הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתמקד בזריעת טאו, רק שינויים פשוטים נדרשים to לאפשר למשתמש לעקוב אחר פעילות זריעה מסוגים חלופיים של זרעי proteopathic. כפי שהודגם בהולמס ופורמן ואח &#39;., יצירת קו תא חד שבטי יציבות להביע α-סינוקלאין מחסה המוטציה A53T הקשורים למחלות מתויגת לאו CFP או YFP אפשר זיהוי רגיש של פעילות זריעה מסיבי α-סינוקלאין באורך מלא רקומביננטי 16 . ניסויים דומים בוצעו באמצעות תאי biosensor Huntingtin, שגם ביעילות לזהות צבירת חלבון. לפיכך, רק על ידי שינוי biosensor החלבון, סריג cytometry זרימה תואם מקורות זרע רבים. שינויים אחרים לassay, כולל פרדיגמה טיפול ומודל תא, ניתן להשתמש כדי להפוך את סריג cytometry זרימה יותר ישים להערכת מנגנונים פיסיולוגיים. בפרוטוקול זה, זרעים הוכנסו ישירות לתאי biosensor באמצעות התמרה תיווך liposome כדרך להגביר את הרגישות. חשוב nOTE, עם זאת, כי זה לא דרישה. טאו אגרגטים מדגימות ביולוגיות רקומביננטי או עכבר עדיין מסוגלת זריעת תאי biosensor בהעדר יפוזומים (איור 5). כך, מעבדות מעוניינות ללמוד התפשטות פיזיולוגית ו / או מנגנוני קליטה של ​​זרעי טאו עדיין עשויה להעסיק את assay. בנוסף, סריג cytometry זרימה תואם תרבויות עצביות עיקריות. על ידי הדבקה של תאים עם CFP- ומבני lentiviral קידוד YFP בזמן של ציפוי, היענות סריג יעילה מושגת בריכוזים של ננו-מולר בעקבות טיפול בסיבי טאו רקומביננטי, גם בהיעדרו של יפוזומים (איור 5). יחדיו, נתונים אלה מצביעים על כך שזרימת סריג cytometry הוא שימושי לחקר מנגנונים פיסיולוגיים של זריעה עבור מגוון רחב של אגרגטים חלבון ובדגמי תרבית תאים מרובים. בעוד סריג cytometry זרימת המערכת הוא ידידותי למשתמש והתאמה, צעדי מפתח מסוימים צריכים להיותאחריו כדי להבטיח תאימות, כולל הכנת מדגם וconfluency תאים התקין בזמן טיפול. sonication בדיקה בעצימות גבוהות של דגימות מוח הוא קריטי עבור בידוד יעיל ואופטימלי של פעילות זריעה. במהלך פיתוח ואופטימיזציה, זה היה ציין כי כי שיטה זו היא מעל 10 פעמים יעילה יותר בבידוד פעילות זריעה ממוח P301S עכבר ביחס לטכניקות נפוצות אחרות, למשל הומוגניזציה כף יד. ייתכן שיש לי אגרגטים טאו גדולים מאוד נטיית זריעה נמוכה יחסית, וכי sonication הבדיקה הוא יעיל ביותר לשבירת אגרגטים אלה לרסיסים קטנים, זרע תואם. משך ותדירות של sonication ניתן לשנות במידת צורך, אם כי ההגדרות שתוארו לעיל מומלצות לזיהוי רגיש של פעילות זריעה. confluency הסלולרי בעת הטיפול גם הוא בעל חשיבות עליונה, כפי שהוא משפיע על רגישות ובריאות תא. אם תאיםמחדש ומחוברות מדי, הם לא בקלות לקחת את פוספוליפידים וחומר זרע, וכך באופן דרמטי הפחתת רגישות. אם confluency הוא נמוך מדי, תוספת של פוספוליפידים וחומר זרע יכולה להיות רעילה. בדיקות אמפיריות מראה כי confluency biosensor של 60-65% הוא אופטימלי לטיפול והיענות שלאחר מכן. כפי שצוין בפרוטוקול, אלגוריתמי פיצוי משמשים באופן קבוע להוציא גלישת CFP לתוך YFP וסריג ערוצים, ובכך למנוע אותות כוזבים והגברת רגישות. להערכה איכותית ומהיר של פעילות זריעה, עם זאת, צעד זה עשוי להיות מושמט או שבוצע לאחר מעשה באמצעות cytometry זרימת תוכנת ניתוח. אות נקיה וחזקה יותר מתקבלת בעקבות פיצוי, לעומת זאת, ובכך לניתוח הקפדני וכמותיים ביותר בשלב זה מומלץ מאוד. הגבלה של assay היא חוסר היכולת שלה לדווח על יוכימיים הרכבזרעי proteopathic. הפעילות השוטפת אמצעי assay הזריעה, רכוש פונקציונלי של זרעים. קביעת הטבע ביוכימיים וbiophysical של הזרעים תדרוש צימוד למבחנים מסורתיים כגון immunoprecipitation, כרומטוגרפיה, dichroism המעגלי, ספקטרוסקופיית מסות, וכו &#39;עם זאת, assay זה יהיה שימושי בהערכת עצמת זריעה כנקודת סיום מדגימות עצום. assay זה היה בשימוש לאחרונה לכמת ולאפיין את timecourse של זריעת התפתחות והתקדמות בעכברי P301S ביחס לסמנים אחרים נפוצים בתצהיר טאו, כגון כתמים היסטולוגית. במחקר זה, פעילות זריעת טאו הייתה ברורה יותר משישה שבועות לפני הסמן המוקדם היסטולוגית (MC1) שבדקנו 16. בהתחשב במראה שלה מוקדם, זריעת פעילות עשויה לייצג משלימה חשוב, או אפילו חלופי, מדד תוצאה להערכת יעילות של התערבויות טיפוליות, לפחות למחקרים ראשוניים.על ידי קיצור כמובן טיפול ולומדים בעלי חיים, עלויות דיור צעירות וזמן אספקה ​​ניסיוני יקטן. זה מתקבל על הדעת כי תרופות יכולות להיות מנוהלות על עכברי P301S ב4-6 שבועות ומוח הערכה לפעילות זריעה 2-4 שבועות לאחר מכן. לחלופין, הערכה של תרופות אנטי-טאו בתאים יכולה להתבצע בתוך ימים על ידי הערכת יכולתם כדי לחסום אינדוקציה של פעילות זריעה בתאי biosensor, כפי שמודגם באיור 5. לסיכום, סריג cytometry זרימת זריעת assay היא דרך קלה ויעילה לגילוי זריעת טאו ממקורות רקומביננטי או ביולוגיים. הרגישות שלה היא שאין כמותו על ידי אחרים במבחני זריעת טאו מבחנה, וזה יכול להיות מועסק על מנת לזהות את שינוי פתולוגי המוקדם בעכברי tauopathy P301S. יתר על כן, הגמישות שלה בניטור זרעי proteopathic רבים בתנאי טיפול שונים, ועם מודלים תרבות תאים מרובים, עושה את זה שימושי לכל מעבדה צבירת חלבון מעוניינת באיסוף נתונים כמותיים במהירות.

ההצטברות של amyloids טאו תאיים מגדירה tauopathies כגון מחלת אלצהיימר. בשלבים המוקדמים של מחלה, פתולוגיה בדרך כלל מקומית לאזורים הנפרדים של המוח, אך עם התקדמות מחלה, פתולוגיה תמיד מתפשטת לאורך רשתות עצביות שונות 1-5. ראיות מצטברות מצביעות על התפשטות transcellular של אגרגטים חלבון רעילים בבסיס הפתולוגיה זה (שנסקר ב6-10). במודל זה, זרעי proteopathic (למשל, באוניברסיטת תל אביב) משתחררים מתאי תורם ולהיכנס תאי שכנים, הפיכת חלבון טאו ילידים לטופס misfolded באמצעות שינוי קונפורמציה בתבניות 11-15. Assay המתואר כאן פותח כדי לזהות פעילות זריעה כגון רגישות. זה תואם עם חלבון רקומביננטי ודגימות ביולוגיות ומאפשר כימות של רמות דקות של פעילות זריעת proteopathic 16. תאי HEK 293T שיציבות להביע ד חוזר טאוomain (RD) המכיל את המוטציה P301S הקשורים למחלות התמזגו או CFP או YFP (להלן כתאי טאו-RD-CFP / YFP) לשמש כbiosensor יציב של פעילות זריעה. בהעדר זרעי proteopathic, התאים לשמור על טאו כמונומר מסיס, ואין להם סריג רקע ניכר. ספיגה ספונטנית או התמרה תיווך liposome של זרעי טאו לתאים, עם זאת, תוצאות בRD-CFP וצבירת RD-YFP, אשר מייצר אות סריג שנמדד בתוך תאים בודדים באמצעות cytometry זרימה. רכיבים רבים של assay זה הונדסו כדי לשפר את הרגישות ולהפחית השתנות. שורת תאים חד שבטי עם יחס של 1: ביטוי RD-CFP / YFP 1 נבחרה, כפי שהיא מספקת אות אופטימלית: רעש. כדי להגביר את הרגישות, פוספוליפידים משמשים להציג זרעים ישירות לתוך תאים (למרות ללמוד מנגנונים ביולוגיים של ספיגה, זה יכול להיות מושמט). לבסוף, cytometry זרימת צגי סריג ברמת אוכלוסייה ותא בודד<html> רמה, שלא כמו מבחני צבירת חלבון אחרים. מדד התוצאה הסופי, צפיפות סריג משולבת, היא כמותי מאוד והחשבונות הן למספר תאים עם צבירה, והמידה שבה צבירה התרחשה בתוך כל תא. כל פרמטרים האופטימליים אלה לשפר את הרגישות ולהבטיח שחזור. מערכת זו הועסקה לאחרונה במחקר מקיף בעכברים מהונדסים tauopathy P301S 17 שהעריך את תחילת הזמן והתקדמות של פעילות ביחס זריעת טאו לסמנים פתולוגיים טאו הנפוץ אחרים (לדוגמא, MC1, AT8, PG5, וThioflavinS). פעילות זריעה היא רחוקה סמן המוקדם וחזק ביותר של פתולוגיה באוניברסיטת תל אביב העריך, שקדמו לגילוי היסטולוגית על ידי לפחות 6 שבועות. פעילות זריעה מופיעה ב 1.5 חודשים ועליות בהדרגה עם גיל, מה שמרמז תפקיד סיבתי של זרעי proteopathic בתחילה ו / או ההתקדמות של ניוון מוחיים 16. e_content &quot;&gt; כימות מדויק של רמות דקות של חומר זרע מדגימות ביולוגיות יכול להקל על מחקרים העוקבים אחר התקדמות מחלה מוקדמת. על ידי קיצור משך משפט ומאפשר שימוש בבעלי החיים צעירים, זה יכול להגביר את היעילות והדיוק של ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. לדוגמא, ב עכבר P301S שתואר קודם לכן, תרכובות עופרת יכולות להיות מועברות מוקדם ככל 4-6 שבועות (מייד לפני, או בתחילתה של פעילות זריעה), ופיקוח על יעילות 2-4 שבועות לאחר מכן. assay צריך במדויק לכמת הפחתה כלשהי בזריעה פעילות. סריג cytometry זרימה שניתן לבדוק במבחנה יישומי הקרנה גם כן. לדוגמא, ריאגנטים אנטי-טאו (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו &#39;) במהירות ליכולתם לחסום זריעת אינדוקציה ישירות בתרבות, או באמצעות טאו רקומביננטי אגרגטים או lysates נגזר מוח כמקור זרע (איור 5). עם התקנה זו, מהרגע שחומר זרע מוכן, לשעברperiment לוקח רק שלושה ימים כדי להשלים, כולל ניתוח נתונים. הכימות המהיר של פעילות זריעת proteopathic יכול כך להקל על מחקרים רבים של ניוון של מערכת עצבים.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Boats</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Noise Cancelling Ear Muffs</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>USA Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx&quot;&gt;1615-5510&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml reagent resevoirs</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Multi channel pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96 well flat bottom plates</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom plates</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo analysis software</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l pipet tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

סריג cytometry זרימה מאפשר רגיש, כמותי, וזיהוי מהיר של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטי או ביולוגיות. התקנת assay היא קלילה: שורות תאי יציבות הנגזר חד שבטיים להביע טאו-RD-CFP / YFP הם transduced עם חומר זרע, טופח במשך 24-48 שעות, ונתונים לניתוח תזרים cytometry (איור 1 א). בהעדר זרעים, תאי biosensor לשמור טאו בצורה מסיסה, monomeric (איור 1). בנוכחות של זרעים, לעומת זאת, תאי biosensor להמיר טאו למדינה מצטברת (איור 1 ג), ייצור תגובת סריג שהוא זוהה על בסיס לכל תא עם cytometry זרימה. הערכה כמותית מראה כי תאי biosensor להגיב לריכוזי femtomolar חומר זרע וכי פעילות הזריעה ניתן למדוד בצורה יעילה על פני שלושה סדרי הגודל (1D איור). הפרמטרים gating הוקמו כדי להבטיח זיהוי של TRUE סריג אות, גם בריכוזים נמוכים זרע. ראשית, שיטות gating סטנדרטיים משמשות כדי לבודד את אוכלוסיית התא (איור 2 א) ותאים בודדים (איור 2). אות סריג שווא יכולה לנבוע מהפעלה ישירה של YFP על ידי לייזר 405 ננומטר. לפיכך, שער סריג False נמשך מאוכלוסיית תא בודדת חיובית YFP להוציא אות זיהום (איור 2 ג). אחרון, שער סריג מוגדר מתאי unseeded CFP / YFP הכפול חיוביים (איור 2 ד). שער מצויר ליד המדרון של האוכלוסייה המשתרעת כלפי מעלה ושמאלה ממנה. תאי unstimulated צריכים רקע סריג הערך מוגדר כ 1%, ותאי סריג חיובי יעברו לשער הזה באופן תלוי-מינון (השווה איור 2E ו2F). מספר פרמטרים נלקחים בחשבון עם סריג cytometry זרימה, ובם: חיוביות אחוזים (כלומר, מספר תאי סריג-חיוביים לכלל ספירת תאים) ובעוצמת הקרינה החציונית (כלומר, המידה שבה תגובת סריג מיוצרת בתאי סריג-חיובי). צפיפות משולבת סריג היא מדד התוצאה המועדף, כפי שהוא התוצר של שני משתנה אלה ומלאים מייצג את מידת פעילות זריעה הנגרמת על ידי כל מדגם נתון. סריג cytometry זרימה תואם lysates מוח P301S tauopathy נגזר עכבר, אפילו בגילים צעירים, כמוצג באיור 3. בעקבות microdissection של ארבעה אזורים שונים במוח, סריג cytometry זרימה שימש למדידת פעילות זריעה מגזע המוח (איור 3 א), הניאוקורטקס (איור 3), אונה קדמית (איור 3 ג), וההיפוקמפוס (איור 3D) בעכברי P301S על פני טווח של גילים. בכל אזור, פעילות זריעה עלתה עם גיל ונראית במרחק של 1.5 חודשים. עם זאת, עכברי נוקאאוט טאו (&quot;KO&quot;)&gt; 12 mos לא מוצגים פעילות זריעה. בהשוואה לשעותistological ניתוחים שבוצע באותה חיות, זה שישה שבועות מוקדם יותר מהמראה של כל סמן אחר של בתצהיר טאו (איור 3E), כוללים סמנים של טאו conformationally-הסוטה (MC1), טאו hyperphosphorylated קונפורמציה (AT8 וPG5), ועמילואיד (ThioflavinS). ממבט מכניסטית, זיהוי הפרוקסימלי של פעילות זריעת זרעי טאו מציע כמתווך סיבתי של תחילת ו / או התקדמות tauopathy. ממבט ניסויי, זה מצביע על כך שניתוח של פעילות זריעה עשוי להיות תוספת אידיאלית למדדי תוצאה סטנדרטיים של תצהיר טאו, נתן הופעתה המוקדמת וחזקה. בנוסף לעכברים הטרנסגניים, סריג cytometry זרימה תואם lysates המוח האנושי וקלות יכולה לזהות אגרגטים טאו המבודדים מנושאי מחלת אלצהיימר (איור 4). כאשר רקמת מוח אנושית קפואה הומוגני באותו אופן כפי שתואר כאן לlysates מוח P301S, זריעת פעילותהוא זוהה וחסונה מכל המדגמים נגזרו מנושאים לספירה. לעומת זאת, פעילות זריעה לא זוהתה מlysates של נושאי בקרת מחלות של התאמה-גיל או הנטינגטון. זה מדגיש את הייחוד של assay לאגרגטים טאו. למרות ההתמקדות של מאמר זה הוא גילוי רגיש של פעילות זריעת טאו באמצעות משלוח בתיווך liposome של אגרגטים לתאי biosensor 293T HEK, יכולות גם להתבצע פרדיגמות תרבית תאים פיסיולוגיות יותר עם סריג cytometry זרימה להעריך מנגנוני קליטה סלולרית בסיסיים. לדוגמא, יכולות להיות נגועות תרבויות עצביות עיקריות עם lentivirus להביע טאו-RD-CFP וטאו-RD-YFP בונה בזמן של ציפוי. בDIV4, צבירה נעדר בתאים שלא טופלו (איור 5 א), אבל לזיהוי בתאי עצב שטופלו בחומרים המכילים זרעים (איור 5). חשוב לציין, פוספוליפידים אינם נכללים בניסויים אלה, המתירים את החקירה של פיסיולוגי וטפיחה<html> מנגנוני זריעת hophysiological. לפיכך, יישום של סיבי טאו מוביל לספיגה בתיווך HSPG עצבית וממגר צבירה באופן תלוי-מינון שניתן לכמת עם זרימת סריג cytometry (איור 5 ג). בנוסף, assay יכול להיות מועסק להערכה טיפולית של ספיגת טאו וזריעת מצור במבחנה באמצעות תאי biosensor טאו 293T HEK. גם בהיעדרו של פוספוליפידים, שני סיבי רקומביננטי (איור 5D) וlysates המוח P301S (5E איור) לגרום לצבירת טאו. טרום דגירה של זרעים אלה טאו עם הפרין (הראתה בעבר להיות מעכב חזק של ספיגת טאו תיווך HSPG), עם זאת, מבטל את יכולת זריעתם. הגדרת ניסוי זה יכול להיות מיושמת על כל תרופה (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו &#39;) ותאפשר הערכה מהירה של ספיגה ו / או תרופות המשנה את הזרע. &quot;Src =&quot; איור 1 &quot;/&gt; / קבצים / ftp_upload / 53,205 / 53205fig1.jpg איור 1. סריג cytometry זרימת רגישות מזהה פעילות זריעת טאו 16. תאי 293T חד שבטיים HEK להביע טאו-RD-CFP / YFP היו transduced עם דגימות רקומביננטי או ביולוגיות, טופחו במשך 24-48 שעות, ונותחו על בסיס תא בודד באמצעות cytometry זרימה (). תאי unstimulated לשמור טאו-RD במדינה (B) monomeric, ואילו תאים שטופלו עם תכלילים המכילים זרעי תצוגת חומר בולטים (C). הערכה כמותית (ממוצע ± SEM) של מופעי פעילות הזריעה שסריג cytometry זרימה היא רגיש לריכוזי femtomolar (שווה ערך מונומר) של חומר זרע רקומביננטי וגילוי משתרע על פני שלושה סדרי הגודל (ד &#39;). שווה ערך מונומר מייצג את הכמות הכוללת של חלבון בתוך תגובת fibrillization ולא לתקן שלם ו# 160; התאגדות של מונומר לחומר מצטבר. לפיכך, הריכוז של אגרגטים בפועל (זרעים) חייב להיות קטן או שווה ל&#39;שווה ערך מונומר &quot;שלה. * השתנה מהולמס ופורמן ואח &#39;. 16 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig2.jpg" /> איור 2. אסטרטגית gating לסריג cytometry זרימה. אוכלוסיית תא () וגופיית כפיל שערים / (ב) נמשכות עם זרימה סטנדרטית cytometry המתודולוגיה. שער סריג שווא (C) נמשך מהתאים בודדים חיוביים YFP לחסל YFP bleedthrough לתוך מסנן סריג. שער סריג (ד &#39;) בנוי מהתאים שטופל liposome ריקים, כגוןשסריג הרקע הוא ≥1%. שינוי אוכלוסייה לשער סריג מופיע לאחר טיפול בחומר הזרע חיובי (E) והמשמרת הופכת בולטת יותר ויותר עם ​​כמויות גדולות יותר של חומר זרע (F). קריאות סופיות כוללות:. אחוז סריג חיובי, עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של אירועי סריג-חיוביים, וצפיפות סריג המשולבת (תאים חיוביים אחוז הצפיפות המשולב סריג = * MFI) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig3.jpg" /> התקדמות איור 3. פעילות זריעת טאו בעכברי P301S 16. פעילות זריעה (± אומר SEM) מhomogenates המוח של עכברי P301S ניכר בחודשים 1.5 בגזע המוח (), הניאוקורטקס (ב &#39;), באונה הפרונטלית (C), וההיפוקמפוס (ד&#39;). עם זאת, פעילות זריעה מעולם לא נצפתה בעכברי נוקאאוט טאו (&gt; 12 חודשים). פעילות זריעה עולה עם גיל ומקדימה את ההופעה של סמנים אחרים נפוצים היסטולוגית, כולל MC1, AT8, וPG5 (E). * הודפס מחדש באישור מהולמס ופורמן ואח &#39;. 16 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig4.jpg" /> איור 4. תאימות של סריג cytometry זרימה עם דגימות ביולוגיות אנושיות 16. כאשר תאי biosensor טאו-RD-CFP / YFP הם transduced עם 20 מיקרוגרם lysate המוח אנושי, זריעה חזקה (ממוצע ± SEM) מתרחש בכל disea אלצהיימר נבדקמוח se, ואילו lysates שליטת מחלת מותאם-הגיל והנטינגטון חסר פעילות זריעה. * השתנה מהולמס ופורמן ואח &#39;. 16 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53205/53205fig5.jpg" /> איור 5. יישומים אלטרנטיביים לסריג cytometry זרימת 16. נוירונים יסודיים transduced עם קידוד lentivirus טאו-טאו וCFP-YFP בונה. בהעדר זרעים אקסוגניים אין צבירה לכאורה (), אבל יש בנוכחות של זרעים (B). חיישנים עצביים להגיב מינון dependently לזרעי טאו רקומביננטי, גם בהיעדרו של משלוח בתיווך פוספוליפידים (C). טרום דגירה של רקומביננטי (ד) או דומקורות זרע (E) ological עם הפרין, מעכב ספיגה של זרע טאו תיווך HSPG, מכלה את סריג תגובה של תאי biosensor HEK 293T. מציג הערכה כמותית (ממוצע ± SEM). * השתנה מהולמס ופורמן ואח &#39;. 16 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/53205/53205table1.jpg" /> שולחן 1: שורות תאים בשימוש עם סריג cytometry זרימה. תאי 293T HEK משמשים לזרימה cytometry התקנה. תאים בודדים חיוביים CFP משמשים לפיצוי (*). תאים בודדים חיוביים YFP משמשים לחסל אות סריג שווא בשל הפעלה ישירה של YFP על ידי 405 עירור ננומטר. תאים כפולים חיוביים CFP / YFP הם סריג תואמים וישמשו כתאי biosensor. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205table1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/53205/53205table2.jpg" /> טבלה 2:. Cytometer זרימת הגדרות לייזר ומסנן <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53205/53205table2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry at JoVE.com

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Video: Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Developmental Biology

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Cancer Research

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biology

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal allophycocyanin (APC) fluorescence intensity, are conjugated to antibodies specific to a particular analyte. Next, a selected panel of defined capture bead sets is incubated with a biological sample containing target analytes specific to the capture antibodies. A biotinylated detection antibody cocktail is added, which leads to the formation of capture bead-analyte-detection antibody sandwiches.
Finally, streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) is added, which binds to biotinylated detection antibodies, providing fluorescent signal intensities in proportion to the amount of bound analyte. The PE fluorescent signal of analyte-specific beads regions is quantified using flow cytometry, and the concentrations of particular analytes are determined using data analysis software and the standard curve generated in the assay.
In this experiment, we use a mouse T helper cytokine panel to simultaneously quantify the concentration of 13 separate cytokine targets in tissue culture supernatants collected from mouse splenocytes cultured under various stimulatory conditions.

This protocol describes the quantification of multiple cytokine targets simultaneously in tissue culture supernatants collected from stimulated mouse splenocytes using multiplex bead based immunoassay platform and a flow cytometer.

מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

סינון של מעכבי הפעלת אינטגרין β2 בנויטרופילים אנושיים

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

מחבר זרקור: פיתוח שיטה לזיהוי אנטגוניסטים מולקולריים קטנים של הפעלת אינטגרין β2 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה כדי לזהות תרכובות לשבש קשירה של ליגנד כימוקין שכותרתו Fluorescently CXC 12 לקולטן כימוקין CXC 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה כדי לזהות תרכובות לשבש קשירה של ליגנד כימוקין שכותרתו Fluorescently CXC 12 לקולטן כימוקין CXC 4

מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima