この刊行物は、サウスカロライナ医科大学の学術家、NIH / NCATS認可番号UL1 TR000062と、サウスカロライナ州臨床およびトランスレーショナルリサーチ（SCTR）研究所によってサポートされていました。さらにサポートがDRMにVAのメリット賞BX002327-01によって提供されました。 DJHは、NIH / NCATS認可番号TL1 TR000061によっておよびNIH認可番号T32 GM008716によってサポートされていました。 SEAは、NIHグラント番号T32 HL07260によってサポートされていました。

ここに記載されたすべての手順は、サウスカロライナ医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。ここに記載した実験は、急性、非生存実験です。このように、そこに眼軟膏のない使用はありませんし、無菌手術室は必要ありません。安楽死は、心臓の収穫時に放血することによって達成されます。 1。実験の準備<ol><li>一定圧力または一定流量、ランゲンドルフ灌流装置4のいずれかを設定します。 </li><li> （：112のNaCl、5 KClを、1.2 硫酸マグネシウム、1 K 2 HPO 4、1.25のCaCl 2、25のNaHCO 3、11 D-グルコース、0.2オクタン酸、pH値= 7.4ミリモル）に変更されたクレブスヘンゼライト緩衝液の4 Lを準備します。 <ol><li> 10×ストックバッファを作成します。 <ol><li> 3 Lの超純水に塩化ナトリウム、塩化カリウム、 硫酸マグネシウム、及びK 2 HPO 4を溶解します。 </li><li> 500ミリリットル超純水のwiでのCaCl 2を溶解1 N HClを40mlの目。 </li><li>ゆっくり1.2.1.1で行われたバッファへのCaCl 2溶液を加えます。 4 L.合計するのに十分な超純水を追加し、0.8ミクロンフィルターを通して濾過する前に、1時間攪拌します。 4℃で保存します。 </li><li> 4 Lの超純水に炭酸水素ナトリウムを溶解します。 0.8μmのフィルターで通して濾過する前に1時間攪拌します。 4°Cで保存</li></ol></li><li> 400ミリリットル10倍クレブスヘンゼライト緩衝液を400mlの10倍のNaHCO 3緩衝液で結合します。攪拌しながら、グルコースおよびオクタン酸を溶かし4 L.合計するのに十分な超純水を追加します。 0.8μmのフィルターを通して濾過します。 </li></ol></li><li>心のためのシステムを準備します。 <ol><li> 4 Lボトルにろ過し、バッファの2 Lを追加大動脈カニューレに取り付けられたコック上記に38を置きました。これは推奨灌流圧4である心臓に70〜80 mmHgでの灌流圧をお届けします。 </li><li>ボトル内のバッファにガス分散バブラーを挿入します。 </li><li>チューブの内部から気泡を除去するようにしてくださいされ、システムを介してバッファを実行します。 </li><li>心臓の前に少なくとも30分（95％O 2/5％CO 2）ガスをオンにすると、システム上に配置されることになります。酸素飽和度を確認するために、ガス流プローブおよび血液ガス分析装置を使用します。 </li></ol></li><li>外科的供給とバルーンを準備します。 <ol><li>心の収穫については、6.75「手術用はさみ、4.5の1対」ハサミ、止血の二対、caramalt鉗子の二組、27 G針を持つ2つのシリンジ、0 - ゲージ絹縫合糸の2個（約15の1組を準備長さはセンチ）、1 1/16インチ有刺カニューレ、1気管カニューレ。 </li><li>気管カニューレを組み立てるには、Yコネクタに1/16インチ径のプラスチック管の短い断片を接着。 </li><li>バルーン装置を組み立てるには：1/16インチチューブの片に強制経口投与針を取り付け、その後、圧力変換器ハウジングにチューブを接続します。圧力TRの反対側に取り付けられた小型の注射器ansducerハウジングは、バルーンの膨張および収縮が可能になります。 <ol><li>中心部の強制経口投与針のプラスチックラップと場所先端の正方形をカットします。経管栄養針の周りにラップを包みます。 </li><li>生理食塩水でバルーンを記入し、2本の縫合糸で縛ります。漏れがないことを確認するためにバルーンを膨らませます。膨張したバルーン内の生理食塩水の量​​は、およそ200μLであるべきであるが、ラットの大きさに依存して変化し得ます。 </li><li>あるいは、プラスチックラップの代わりにラテックス指サックを使用しています。指サックの中に強制経口投与針を置き、生理食塩水で満たし、縛ります。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.収穫の心<ol><li> decapiconeまたは他の手動の拘束装置を使用して、スプラーグドーリーラットを抑制する。ラットを計量。 </li><li>ラットを麻酔するために腹腔内注射を介して、ケタミン/キシラジン混合物（0.85ミリグラム/ kgのケタミンおよび0.15ミリグラム/ kgのキシラジン）を管理します。麻酔薬のこの用量は、のために十分な麻酔を提供します20〜40分が、麻酔が確認された後の手順では、可能な限り迅速に完了する必要があります。 </li><li>つま先ピンチ反射をテストすることによって、麻酔の適切度を確認してください。 </li><li>気管切開<ol><li>切開を作るために毛皮やはさみを上昇させるために止血剤を使用して、顎のベースに半ば前足から毛皮を削除します。一つは毛皮に沿って切断し、それを削除することができ、基礎となる筋肉からそれを分離するために上昇した毛皮を保管してください。 </li><li>止血剤を使用して、腺組織を持ち上げ、腺組織に筋膜の横切開が悪くなります。ニックにない頸静脈を注意しながら、オープン切開部を広げるために止血剤を使用してください。 </li><li> 、止血剤を使用してピンチの筋肉の気管の上にあるし、使用してハサミだけで止血の先端下の筋肉に横切開を行います。止血鉗子を使用して、気管を明らかに離れて組織を広げます。 </li><li>静かに止血を前進および後退させることによって進行しながら、筋膜をクリアし、気管の下に止血剤を慎重に挿入します。 </li><li>止血剤が正常気管の後ろに配置されると、止血剤で0-0絹縫合糸をつまんではさみの小さな、鋭いペアで気管を二等分します。 </li><li>二等分気管に気管カニューレを挿入し、気管の後ろに縫合糸を引っ張ると、カニューレを挿入し、気管の周りに縫合糸を結ぶ、外科医の結び目とカニューレのY-鼠径部に縫合糸を固定します。 </li><li> 27 G針を使用して、頸静脈に千U / kgのヘパリンを注入し、30秒間を循環させています。 </li></ol></li><li>開胸<ol><li>止血剤でピンチとハサミで切断することにより、ミッド前足領域に半ば腹部から毛皮を削除します。 </li><li>ちょうどダイヤフラムの下に、腹部の筋肉壁に¾インチ横切開を加えます。 </li><li>胸骨に沿って切断し、腹壁と胸の壁まで縦切開を行います。 </li><li>左右のバックダイアフラムをカットし、それが普及のまま確保するために止血剤と心を明らかにするために胸郭、クランプ胸郭を広げます。 </li&gt; <li>止血剤を使用して、静かに上行大動脈を露出し、胸腺を削除します。 </li><li>進退止血剤を、ゆっくりと止血の先端を介してできるように筋膜を広げ、大動脈ループを介して止血をいじめます。 </li><li> 、上行大動脈の後ろに0-0絹縫合糸を引っ張る緩い半正方形の結び目に縫合糸を結ぶために止血剤を使用してください。 </li><li>灌流バッファ、二等分する大動脈の流れを開始し、すぐに大動脈内腔にカニューレを挿入するためにコックを回します。急速半正方形の結び目を締める、徹底的に締め、結び目を完了します。 </li><li> 、離れて大血管から心臓を解剖胸から心臓を除去し、灌流列に接続するはさみを使用してください。 </li><li>過剰な肺組織を切り取ると、心臓がバルーンの挿入前に約15分間カラムに平衡化することができます。 10〜20ミリリットル/分の中心部を介してバッファの通常の流量を使用してください。 </li></ol></li></ol> 3.ランゲンドルフ灌流と虚血再灌流障害<ol><li> LV前の配置ssureバルーン<ol><li>円錐状に回転させながらバルーンを収縮し、バルーンが収縮したまま確保するためにコックを回します。 </li><li>消費税​​は、僧帽弁へのアクセスを露出するようにはさみの小さなペアで心房を残しました。 </li><li>左心房と左心室に僧帽弁を介してバルーンを挿入します。 </li><li>圧力監視ソフトウェアを起動します（LabChartプロ）。 </li><li>コックを開け、ゆっくりとマイクロマノメーターから拡張期圧の読みがゼロを超えるまでバルーンに生理食塩水の量​​を増加させることにより、バルーンを膨らませます。 </li><li>ゆっくりと収縮、長さ張力応答を確認75 mmHgでの拡張期圧にゆっくりバルーンを膨張させるために、一回繰り返します。 </li><li>バルーンに生理食塩水の量​​を調節することによって、10 mmHgでの拡張期圧を設定します。インフレのこのレベルでバルーンをシールし、LVのバルーンと圧力変換器との間の閉鎖圧力システムを維持するためにコックを回します。 </li><li>プラスチックと加熱室とカバー室内への低い心。 </li></ol></li><li>広告虚血再灌流障害の奉仕<ol><li>加熱室の底部を接続し、チャンバが流出し、バッファを充填することを可能にします。 </li><li>バッファが心を沈めたときに、全体的虚血を誘導する、心臓にバッファの流れを止めるためにストップコックを回します。虚血時間は、実験の目的に依存して変化し得ます。 </li><li>虚血の30分後、再灌流を開始し、心臓にバッファの流れを回復するためにコックを回します。 </li><li>実験を終了する前に1時間、心臓の再灌流を可能にします。実験の目的に応じて、変数の再灌流時間を使用してください。 </li></ol></li><li>実験の終了および組織の収穫<ol><li>栓の側面ポートを使用して、心臓を停止させるために10ml /分の速度で心臓に4℃でリン酸緩衝生理食塩水を10mlを投与。 </li><li>残りの心房組織を切り取る、潅流カラムから心臓を取り出します。 </li><li>ペンシルベニア州で覆い、ステンレス鋼の組織スライスマトリックスに心を置きます8分間、または心臓まで-80℃でrafilm、および場所は、マシュマロのような一貫性を持っています。 </li><li>冷凍庫からブロックを削除し、2mmのスライスに心をスライスする行列をスライスにrazorbladesを挿入します。組織ブロックは2ミリメートル以外のスライスサイズで購入することができます。 </li><li>スライスを一度に1つを削除して、生化学的研究のための凍結をフラッシュする液体窒素の中にドロップします。梗塞染色のための頂点から第三脳室のスライスを保持します。 </li><li>生化学実験に使用するまで-80℃で液体窒素とストアから組織を削除します。 </li></ol></li><li>梗塞染色<ol><li> 37℃で15分間/ Vの塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）の1％w 10mlに第心室切片をインキュベートします。 注：TTCでのインキュベーションは、有効15変化なしで15または30分間行うことができます。 </li><li> 10％緩衝ホルマリンにTTCから組織切片を移し、室温で一晩インキュベートすることができます。最適な結果を得るために、聞きますTSは、ホルマリンから取り出し、24時間以内に4画像化されるべきです。 </li><li>写真はスライスを染色し、製造業者のプロトコルに従って梗塞の大きさを推定するために、このようなImageJのようなソフトウェアを使用しています。色素が時間をかけてフェードインしますように、固定後できるだけ早く写真を撮ります。 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

単離された灌流ラット心臓が正常虚血再灌流傷害9心臓プレコンディショニングにおける薬理学的介入の効果を研究するために使用することができます。しかし、再現可能な結果を​​保証するために標準化されなければならない手順をいくつかの重要なステップがあります。システム内で37.4℃の温度を維持することはあっても軽度の低体温と高体温が心臓プレコンディショニング10,11の原因となりますので、非常に重要です。ケタミンへの長時間の暴露が、心臓のプレコンディショニング12を妨げる可能性の心臓の切除に麻酔薬の注射からの経過時間全体を最小限に抑える必要があります。 その場での大動脈のタイムリーな挿管は、心臓切除の前に心臓や動物の放血内の低酸素症の発症を予防するために不可欠です。全体的に、最初の切開からの心臓の除去に時間がもう6-8分以内とします。左心室のBAlloonは、各実験の前に漏れがないかチェックし、必要に応じて交換する必要があります。システムは、細心の注意を払って、各実行後に蒸留水で装置全体をフラッシュするとチューブの内部の漏れや汚染を防止するために、必要に応じて使い古されたチューブを交換するなど、維持されなければなりません。 単離された心臓は、蛍光画像13、NMR分光法7、および他の多くの間で光学的マッピング14を含む新規な用途の任意の数のために修飾することができます。システムはまた、マウスなどの別の動物から心臓を灌流するように変更することができます。それはトランスジェニックマウスを用いた実験を可能にするように、この変更は、特に便利です。マウス心臓のためのシステムを変更するには、より小さなカニューレと小さい灌流列は、他の修正に加えて、使用する必要があります。マウス心臓のためのランゲンドルフ法を利用する方法の詳細な説明は他の場所で16,17発表されています。の他の修飾このプロトコルは、異なる時点で様々な薬物の投与を含みます。薬理学的プレコンディショニングまたはポストコンディショニングを引き起こす薬剤の能力を調査するときには、虚血再灌流障害に関連して、異なる時点での薬剤を投与することが不可欠です。薬物は、心臓を切除する前に動物に投与し、または薬物は、再灌流時に存在するように心臓がカラム上または虚血性段階の間に配置されているいずれかの前にバッファに混合してもよいです。代わりに、サイドポートプロトコル中の任意の時点で薬剤のボーラスを投与するために使用することができます。さらに、プロトコルは、虚血、再灌流、またはその両方の持続時間を変更するように変更することができます。これは、複数の時点で、機能的および生化学的データの分析を可能にし、薬物の急性効果の時間経過を追跡するために使用することができます。再灌流期間が変更される場合には、再灌流の少なくとも60分neceであることに注意することは重要ですTTC染色のためssaryを効果的に梗塞領域15を描写します。 虚血再灌流傷害の点で、単離された心臓モデルの主な制限は、 インビボでの虚血再灌流の設定に存在する全身性因子の多くを考慮しないことです。全身影響のこの排除は、ランゲンドルフモデル​​を用いて生成されたデータの分析において考慮されなければならないが、虚血およびその後の再灌流に筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞の応答に関する新たな質問に答えるために、モデルの能力を排除するものではありません。単離された心臓モデルは、短い時間間隔にわたって心臓に対する機能的効果のリアルタイム分析に加えて、虚血再灌流障害に影響を与える変数の多くの完全な操作を可能にします。単離された心臓のシステムを使用して生成されたデータは、薬理学的プレコンディショニングまたはポストコンディショニングの理解に非常に貴重です様々な医薬介入に応答して心。

虚血および再灌流の両方に対する心臓応答の基礎となる事象の解明は、心筋梗塞1および大動脈クロスクランプ2を必要とする心臓の外科手術の治療の向上に不可欠です。虚血再灌流障害のin vivoモデルは、非常に有用なエンドポイント解析を可能にするが、それらはリアルタイムで急性虚血再灌流障害の機能的効果を研究するように有効ではありません。さらに、 インビボでの虚血再灌流モデルは、一般的に梗塞サイズで有意な変動を生成し、再灌流時の心臓への薬剤の直接送達は、困難です。虚血再灌流障害を研究するためのランゲンドルフ単離心臓システムの利用は薬理学的治療、梗塞組織の均一な領域と、直接心筋への薬物の瞬間デリバリーのリアルタイム機能評価を可能にします。 最初のBを記載1895年3中のyオスカーランゲンドルフ、ランゲンドルフ単離された心臓は、過去40年間4,5のために、虚血再灌流研究に用いられている、虚血再灌流障害を研究するための堅牢なモデルです。ここでは、いくつかの変更は、機能解析のために、単離された心臓を最適化するために行われる。大動脈のその場挿管で心臓が鼓動を心臓が虚血再灌流試験6の結果を変化させる虚血プレコンディショニングを、経験していないことが保証されています。これを容易にするために、気管切開は、換気を可能にし、手術中、ラットの生理学的安定性を確保することが行われます。心臓は、その後、クレブスヘンゼライト緩衝液を大動脈に直接逆行性灌流を介して配信され、それを通してガラスウォータージャケットスパイラルカラムに取り付けられています。生理食塩水で満たされたバルーンを左心室に挿入し、心室AN内からの圧力の実時間測定を可能にする圧力トランスデューサーに取り付けられています。複数の機能パラメータのd計算。実験の終了時に、心臓が収縮し、DNA、RNAおよびタンパク質レベルのダウンストリーム解析を可能にするために、液体窒素中で急速冷凍を逮捕するために、冷生理食塩水でフラッシュされます。このように変更され、ランゲンドルフ灌流心臓は虚血再灌流障害の間に急性任意の時点での薬理学的介入の生理的効果を直接監視するための効果的なシステムとして機能します。

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Octanoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Medical Pressure Transducer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Peristaltic Pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Easy Load Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Heated circulating water bath</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Flow Module</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Modular Research Console</td><td>Transonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Inline flow sensor</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Data Acquisition Device</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart data acquisition software</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff-perfused rat hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

左心室のバルーン装置は、左心室収縮（ 図1）によって開発された圧力のリアルタイムモニタリングを可能にします。先に7に説明したように、この圧力トレースは、心室機能のパラメータの多くを計算することができます。これらの計算は、ベースライン期と同様に再灌流段階で行うことができ、各グループ内で複数のトレース上で平均し、我々は以前に9を行っているような薬理学的介入は、心臓のプレコンディショニングをもたらしたかどうかを決定するために比較しました。そのようなパラメータは、収縮期血圧と拡張末期圧との差として計算し発生する圧力です。通常の灌流ラット心臓における開発の圧力は70〜130 mmHgの（ 図1A）の範囲とすることができます。虚血性傷害後、発生圧力が減少し、拡張末期圧が上昇（ 図1B）されます。ラットがある場合このようなクラスIおよび18は、心臓を切除する前に、先進の圧力の低下や虚血再灌流障害に関連した拡張末期圧の上昇が減衰しているのIIb HDAC阻害剤SAHA（ボリノスタット）（ 図1C）として知られている前処理剤を投与しました。このような圧力発生（DP / dtの最大 ）の速度と左心室機能の他の測定は、圧力緩和（-dP / dtが最大 ）の速度、及び速度圧力積（RPP）が直接得られるか、から算出することができますソフト出力（ 図2）。虚血性相はまた、虚血の発症後数分以内に圧力発生の見かけの停止と、リアルタイムでモニターすることができます。虚血性収縮も収縮と収縮のピークまでの時間の発症までの時間を測定することによってモニターすることができます。 塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）は、一般的に、代謝の間で区別するために使用されctiveおよび不活性組織、および梗塞染色のためにここで使用されます。いったんアクティブな組織赤色になり、TTCは、代謝酵素によって還元される組織に吸収。非アクティブな組織は、TTCを低下させない、そのように白8を染色します。虚血再灌流障害のショーの実質的な領域にかけ心は（ 図3）梗塞組織を示し、白染色しながら、虚血性傷害に供されていないランゲンドルフ灌流ラット心臓は、任意の白い部分（図示せず）は表示されません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig1.jpg" /> 図1：左心室のバルーンからの代表的な圧力トレース心室収縮時にLVのバルーンによって記録された圧力。虚血（A）が施されていない心は時間をかけて収縮能のわずかな損失が発生します。虚血（B）にかけハーツIMMEDを表示します強直性収縮に続いて圧力発生のiate損失、。再灌流時には、これらの心の経験がEDPを上昇し、先進の圧力を減少させました。ハーツSAHAで前処理し、虚血（C）にかけ虚血再灌流傷害の減衰を示します。 N =グループあたり1。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig2.jpg" /> 図2：心室機能の計算パラメータレート圧力発生（A）、圧力緩和（B）、発生圧力（C）、およびレート圧力物（D）の比率から算出することができる心室機能のいくつかのパラメータがあるの。圧力監視ソフトウェア。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig3.jpg" /> 図3：梗塞領域のTTC染色。 </stronG&gt;例虚血再灌流障害後の心室の断面。点線は右心室（RV）から左心室（LV）を描きます。生存組織が赤染色によって示されているのに対し、焦点梗塞は、白領域で示されています。

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Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

22.8K ビュー.  Medical University of South Carolina. The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

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Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

ラットにおける急性心筋梗塞

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

医学

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

生物学

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

ラットにおける心筋虚血再灌流後の冠動脈流量の評価

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

改良型ランゲンドルフ灌流によるCVD研究の強化

Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and scientific advancement. As a result, innovation, improvement and/or repurposing of the available research toolset can provide improved testbeds for research advancement. Langendorff perfusion is an extremely valuable research technique for the field of CVD research that can be modified to accommodate a wide array of experimental needs. This tailoring can be achieved by personalizing a large number of perfusion parameters, including perfusion pressure, flow, perfusate, temperature, etc. This protocol demonstrates the versatility of Langendorff perfusion and the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) without graft function loss by utilizing lower perfusion pressures (30-35 mmHg). Achieving extended perfusion times without graft damage and/or function loss caused by the technique itself has the potential to eliminate confounding elements from experimental results. In effect, in scientific circumstances where longer perfusion times are relevant to the experimental needs (i.e., drug treatments, immunological response analysis, gene editing, graft preservation, etc.), lower perfusion pressures can be key for scientific success.

著者スポットライト:心臓血管研究の進歩 - 実験結果を改善するためのカスタマイズされたランゲンドルフ灌流技術

This article demonstrates the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) of murine cardiac grafts without function loss by employing lower (30-35 mmHg) than physiological (60-80 mmHg) perfusion pressures during Langendorff.

げっ歯類の心臓移植片の灌流時間を延長するための修正ランゲンドルフ灌流

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and ...

生物工学

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

ラット肝移植モデルにおける血球力学的変化をシミュレートすることによる臓器虚血再灌流損傷

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence suggests that thrombolytic therapy or primary percutaneous coronary intervention (PPCI) does not prevent reperfusion injury. There is still no ideal animal model for MIRI. This study aims to improve the MIRI model in rats to make surgery easier and more feasible. A unique method for establishing MIRI is developed by using a soft tube during a key step of the ischemic period. To explore this method, thirty rats were randomly divided into three groups: sham group (n = 10); experimental model group (n = 10); and existing model group (n = 10). Findings of triphenyltetrazolium chloride staining, electrocardiography, and percent survival are compared to determine the accuracies and survival rates of the operations. Based on the study results, it has been concluded that the improved surgery method is associated with a higher survival rate, elevated ST-T segment, and larger infarct size, which is expected to mimic the pathology of MIRI better.

Myocardial ischemia-reperfusion model of rat heart is improved by using a self-made retractor, polyvinyl chloride tube, and a unique knotting method. Electrocardiogram, triphenyltetrazolium chloride and histological staining, and percent survival analysis results showed that the improved model group has higher success and survival rates than the already existing model group.

心筋虚血および再灌流傷害の改善されたげっ歯類モデル

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence ...

ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価

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げっ歯類の心臓移植片の灌流時間を延長するための修正ランゲンドルフ灌流

げっ歯類の心臓移植片の灌流時間を延長するための修正ランゲンドルフ灌流

げっ歯類の心臓移植片の灌流時間を延長するための修正ランゲンドルフ灌流

ラット肝移植モデルにおける血球力学的変化をシミュレートすることによる臓器虚血再灌流損傷

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

心筋虚血および再灌流傷害の改善されたげっ歯類モデル