Name: a standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy
Uploaded: 2015-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
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注：動物の使用を含むすべての手順は現地の法律に従って行われます。私たちの仕事はシドニー現地保健地区動物福祉委員会によって承認されています。許可された手順は、プロジェクトのライセンスのドキュメントに記載されており、すべての回で、動物の福祉を確保するためのガイドラインに従っています。作業が行われている国の動物実験に関する法律の遵守を確認してください。 EM固定剤を調製するための1プロトコル<ol><li>固定液100mlを、磁気撹拌機で絶えず撹拌しながら、三角フラスコに蒸留水25ミリリットル、65ºCの熱パラホルムアルデヒド粉末2gを添加することによって、パラホルムアルデヒドを準備します。 注：グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびカコジル酸ナトリウム緩衝液は、すべての有害物質であり、常に換気フード内で処理する必要があります。 </li><li> 2分間65ºCの熱は、その後冷却します。必要に応じて、水酸化ナトリウム溶液を加えるdropwISE完全に透明な溶液に、撹拌しながら。 注：水酸化ナトリウムは危険です、取り扱いに注意して。 </li><li> EMグレードの株式のグルタルアルデヒドの10ミリリットル、50の0.2Mカコジル酸ナトリウム緩衝液mlのショ糖の2グラムを追加し、マグネチックスターラーで攪拌します。 1.0 M CaCl 2を2ミリリットルを追加します。 </li><li>蒸留水で100mlにソリューションを構成するに先立ってpHを7.4に調整します。最終的な固定液は、2.5％のグルタルアルデヒド、2％パラホルムアルデヒド、2ミリモルのCaCl 2、0.1 Mカコジル酸緩衝液中の2％スクロースを含有します。総浸透圧が440ミリオスモル/ Lであることを確認してください。準備の24時間以内に使用してください。 </li></ol>肝臓の2灌流固定<ol><li> 37ºC - 35ウォーム灌流緩衝液および固定液。放血バッファおよび固定液の正確な温度は、組織の整合性を確保するのに役立ちます。 </li><li>を50mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンの単回腹腔内注射で動物を麻酔し。 </li><li>動物は、下になったら後肢の引っ込めと尾のピンチによって評価深麻酔は、Yの切開は、肝臓と門脈を露出させるために、動物の腹部の平滑末端のはさみで作られています。 注：その機器が容易にSEMで見られます微生物や一般破片と試料の汚染を回避するために、クリーンであることを確認してください。 </li><li>他のより遠位の肝臓に、肝臓に門脈の周りに1近位に2つの非常に緩い縫合糸を結びます。 </li><li> （マウス用のラットで18 G、22 G）適切なサイズIVカニューレとカニューレを確保する.Tighten縫合糸を門脈にカニューレを挿入。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水で灌流を開始37ºCに加温し、そしてH 2 Oの10cmの圧力で行われます。 PBSの5〜20mlを、通常肝臓に放血するために必要とされます。 注：気泡は、彼らが塞栓と圧力に二次的アーティファクトを誘導するようにカニューレに接続されたチューブを介して肝臓に入力できるようにしないでください。肝細胞の損傷、SI灌流圧が高すぎるnusoidsとLSECの開窓が発生します。 </li><li>バッファは肝臓から自由に出ることができるように、腹部と胸部大静脈を切断。これは、のLSECに高い背圧による損傷を防止します。 </li><li>肝臓は血液の自由になると、EM固定剤を含むPBSを交換し、肝臓が硬化して非常に薄いされるまで、約5分間灌流。 </li><li>灌流を中止し、1に固定された肝臓をカット-鋭いメスを用いて2mmの3ブロック。 </li><li> 4ºCで72時間 - 24 EM固定剤でポストフィックス組織。 注：一般的に、underfixationはoverfixation以上のアーティファクトを引き起こします。 </li><li> 4ºCで保存、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液に接尾期間以下の固定液に変更します。 注：この方法で保存された試験片は（12ヶ月まで）かなりの時間のために保存されます、しかし、タイムリーな二次固定と検査は最良の結果を得るために推奨されています。 </li></ol> 3.ニードルPerfusion 注：ニードル固定は、直接生検肝組織に固定液を注入することを含む灌流固定の変形です。目的は、それらを放血し、固定液に組織ブロックのすべてを露出させるために、血管を通ってフラッシュする固定剤のためのものです。ケアは、圧力傷害18,19を回避するために低い注入圧力を保つように注意しなければなりません。 <ol><li>動物または被験体から肝臓の小片を除去し、血液や破片を除去するために生理食塩水ですすいでください。 </li><li>ファインゲージの針（典型的にはインスリン注射器）を取り付けたシリンジに通常の生理食塩水を描画します。 </li><li>血液が組織の外にフラッシュされるまで、肝臓に非常にゆっくりと生理食塩水を注入します。複数回の注射が必要な場合があります。 </li><li>ファインゲージの針（典型的にはインスリン注射器）を取り付けた別のシリンジにEM固定剤を描画します。 </li><li>それはハードで色は黄褐色になるまで肝臓に非常にゆっくりと固定液を注入します。頻回注射sが必要とされ得ます。 </li><li>鋭いメスを用いて2mmの3ブロック- 1に固定された肝臓をカット。 72時間4℃ - 24のためのEM固定剤でインキ​​ュベートします。二次固定を開始する前に、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で3回洗浄します。 </li></ol>走査型電子顕微鏡4.準備<ol><li>洗浄サンプル、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で3回。脂質を修正するには、ポストは2時間、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の2％四酸化オスミウムのサンプルを修正します。 注：グルタルアルデヒドと四酸化オスミウムの交差反応し、SEMのアーティファクトを生成するように完全な洗浄は非常に重要です。 </li><li>脱水を開始するために、エタノールの濃度を増加さでサンプルをすすぎます。 5分間、50％エタノールで洗い流し、その後、70％エタノールで5分間3回、 90％のエタノールで5分間、3回すすぎ、 100％エタノールで5分間2回リンス。そして最後に100％エタノール（分子篩）中で10分間2回リンス。 </li><li>サンプルからすべてのエタノールを除去<html>と換気フードにヘキサメチルジシラザン（HMDS）と交換し、10分間のままにします。組織サンプルからHMDSを削除し、蒸発させます。 注：したがって、最終脱水工程のために使用する前に室温に到達させるときに冷たいHMDSは非常に吸湿性です。 </li><li>必要に応じて、すぐにサンプルをマウントするか、SEMのためにマウントする準備ができるまでデシケーターに入れます。 </li></ol> 5.取り付け注：正しい試料取付は、SEMで分析のために利用可能な明確に線引き正弦波の数を最大化します。 <ol><li>金属SEMスタブのベースにラベルを付け、スタブの先頭に両面導電性カーボンテープを適用します。 </li><li>後続のSEMのための最良の正弦波で表面を識別するために、解剖顕微鏡を用いて試料を可視化。スタブのカーボンテープ表面に上向きにその表面を置きます。 </li><li>スティック片をしっかりとスタブに、標本は今スパッタコーティングの準備ができています。 </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6。塗装注：スパッタコーター敷地内に試料を導電性金属（金、プラチナ）の緻密な膜で試料を塗布し、電子ビームによる損傷から保護します。コー​​ティングが厚すぎると、目的の構造が隠されてもよいです。 <ol><li>回転および45秒間自動スパッタコーティングにモードを設定する自動微細スパッタコーターの真空チャンバ内に配置スタブ。しかし、金にも適しており、細かいディテールのためにプラチナコーティングを使用してください。 </li><li>被覆するために、正弦波の表面を注意していないながら、取り付けられ肝臓検体の外部表面にカーボン塗料の薄い層を適用します。 </li><li>標本はプラチナでコーティングされており、炭素塗料が乾燥した後、彼らは、SEMの観察の準備ができています。サンプルをデシケーター中で保存することができます。 </li></ol>前記走査型電子顕微鏡を使用して<ol><li>場所は、走査型電子顕微鏡に標本や真空に顕微鏡を返します。&lt;/ LI&gt; <li>低倍率で開始することによって試料の可視化のための標準的な顕微鏡の操作手順を使用して、徐々に倍率を増加させます。 </li><li>顕微鏡は、距離、スポットサイズと非点収差を操作するための適切に調整されていることを確認。 </li><li>固定の整合性をチェックします。 LSECは、隙間からほとんどが無料で、30測定開窓が含まれている場合 - これは、一般的に試料作製に成功したことを示す250 nmの直径を。 </li><li>正弦波は、ギャップの完全または開窓を欠いている場合には、試料調製は成功していないか、重大な病状があります。この場合には、非常に微細なかみそりの刃でサンプルをスライスし、切断面は、重ね塗りし、正常に固定された正弦波を分析しました。 </li><li>約15,000〜20,000倍の倍率で良好な定着と開窓が明確に（表示されている場合に典型的には、少なくとも10開窓を含むとデブリのない平らなLSECの表面を選択）。 </li><li>肝臓あたり少なくとも二つのブロックを使用して、ブロックの異なる領域から、肝臓あたり少なくとも10正弦波の画像を保存します。 15,000で10顕微鏡写真をサンプリング - 開窓の定量化は、肝臓全体の代表であるために、動物あたり20,000倍の倍率は、一般的に十分です。 </li></ol> 8.分析注：NIHから無償でダウンロードすることができますImageJソフトウェアは、開窓径と周波数（定量化するために利用される<a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ijを</a> ）。 <ol><li>画像を開くJと（ 画面は、1ショット ）画像に埋め込 ​​まれたスケールバーを使用してスケールを設定します。 </li><li> ImageJの中のポリゴンツールを使用して、有窓とdefenestrated領域を含むLSECの全体の平坦な領域の周りにトレース。これは誤って気孔率を膨らまれるように、単にふるいプレートをトレースしません。 obscuriかもしれない細胞表面にあるデブリのいずれかの大規模な作品を除外NGの開窓。 </li><li> 、開窓径を測定ラインツールを選択することにより、各開窓の最大直径を通る線をトレースして、ラインを測定するために「M」を押し、「D」永久に画像上に線を描画する（描きます）。この行は、開窓の直径として定義されます。線の長さは、現在のImageJ（ スクリーンショット2）の結果ボックスで利用できるようになります。 </li><li> 250 nmのオーバーLSEC細胞質内で大きく穴であるすべてのギャップを測定し、同様に開窓。ギャップはギャップがまた、疾患および毒性の結果として発生する可能性がありますが、多くの場合、貧しい灌流または固定を反映した工芸品です。ギャップのデータは、後の分析における開窓パラメータの計算から除外されます。 </li><li>円形でないギャップの面積は、ギャップの周りトレースとImageJの上での面積を計算することによって計算されるべきです。 </li><li> furtheためのExcelスプレッドシートにはImageJに結果ボックスからデータを貼り付けR解析。 </li></ol> 9.計算<ol><li> （ギャップは≥250 nmであるギャップを含まない）、すべての開窓径の平均開窓径=平均。 </li><li>開窓面積=πR2、R、半径は、ギャップを含まない、個々の穿孔の直径（R = D / 2）から計算されます。 </li><li>気孔率（％）=（Σ（πR2）/分析総面積-ギャップのΣ（面積=））（μmの2））×100。 </li><li>開窓周波数=ギャップの（面積）（μmの2） - Σ分析開窓/（総面積の合計数。 </li></ol>開窓データの10プレゼンテーション注：開窓データの定量化を含め、可能な限りの資料は、以下の情報を含める必要があります。 <ol><li>使用境界の直径は、典型的には、（開窓を定義するために何を確認するステートメントと開窓直径、NM 250）、開窓周波数（数個/μm2）と空隙率（％） - 50との間。 </li><li>ギャップが分析に含まれているかどうかを確認するステートメント、開窓直径肝臓、ブロック、イメージおよび穿孔の数の度数分布のグラフは、分析に含まれるべきです。 </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells.">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li><li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy.">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

正確かつ再現肝類洞内皮の状態を測定する能力は、これらの非常に特殊化した細胞の生物学を理解する上で重要なステップです。このような構造化照明顕微鏡32などの新しい技術、原子間力顕微鏡33とD-STORM（直接確率光学Reconstrucion顕微鏡）34は、 インビトロでこれらの細胞の形態に関する重要な情報を付与しますが、SEMはにその構造を視覚化し、測定するために主要な方法論のままその場で 。 最も重要と技術的に困難なステップは、初期固定である：肝臓がよく保存されている場合は後続のステップは、肝臓の正弦波の画像を容易に観察し、確かに、美しい生成されます。肝臓全体の灌流は良好な定着性を確保するための最も有効な方法であるが、同等の結果はすぐに修正されている針灌流サンプルが可能です低圧下で。脱水肝臓サンプルによる水の吸収が悪いSEM像のための別の一般的な理由ですが、これは簡単に乾燥剤とのデシケーター内のサンプルを適切に保管することによって回避することができます。 異なる研究グループからの研究は、比較して解釈することができるように穿孔の定量の標準化が必要です。過去には、これらの値が得られたかについてはほとんどの方法論的な情報を公表された値には大きなばらつきがありました。ここでは、開窓の超微細構造を記述する値を決定し、提示するための標準化されたアプローチを提供しています。 可能な限り、開窓データの定量化を含む資料は、以下の情報が含まれている必要があります境界直径はどこ開窓定義するのに使用したものを確認するステートメントで、開窓径（典型的には50の間 - 250 nm）を。開窓周波数（数/＆＃181; m 2）とし、気孔率（％）;ギャップが分析に含まれているかどうかを確認する声明。開窓直径の周波数分布グラフ。また、肝臓、ブロック、画像、開窓の数は、分析に含まれるべきです。 開窓直径、周波数及び気孔率は、肝臓の状態の重要な指標であり、このデータの収集を標準化するフィールドに有益であろう。ここで説明する方法は、LSECと開窓の超微細構造の研究が行われ、別の研究グループ間で比較可能な方法で提示されていることを保証するためのフレームワークを提供します。方法論は、容易に単離及び培養のLSECに開窓を測定するように適合されます。

肝類洞内皮細胞（のLSEC）は、高度の肝正弦波の壁を覆う内皮細胞を分化されます。のLSECを非diaphragmedある穿孔で穿孔され、経細胞は、直径50〜250 nmの細孔。のLSECの表面の最大20％が篩板1-3（ 図1）と呼ばれる数十〜数百のグループに通常は穿孔によって覆われています。開窓は非常に効率的限外濾過システムを作成し、血液と肝細胞との間にプラズマとnanosubstratesの転送を可能にします。開窓は動的構造である - それらのサイズおよび/または数の両方は、種々の生理学的状態、薬物、および疾患に応じて変更することができます。例えば、開窓は摂食状態4よりも絶食が大きいです。 2ジヨードアンフェタミンは開窓の数を増加させ、5,6および細胞あたり穿孔のサイズおよび数の減少は、加齢および多くの疾患状態7-13で起こります</sup&gt;。穿孔のサイズと数の正確な測定は、LSECの形態は、種々の疾患、毒性、および生理学的状態に影響される方法を理解するために重要です。肝機能に及ぼす影響。および開発するための治療的介入1を開窓を調節。 開窓の研究は困難です。開窓の直径は、両方の無傷の肝臓組織または培養のLSECに電子顕微鏡を用いて、先にのみ観察が可能であった、従来の光学顕微鏡の解像度の下にあります。走査型電子顕微鏡（SEM）は、最も頻繁に、SEMは、数千の内皮表面と測定の大部分の観察を可能にするために開窓サイズ、周波数及び気孔率（開窓によって穿孔さLSEC膜の割合）を研究するために使用されていますそうでない場合は数十開窓の何千もの。その有用性にもかかわらず、結果がために、SEMベースの研究から報告されますこのような開窓大きさ、数、周波数および多孔性などのLSECのパラメータは、文献（ 表1）に大きく異なります。 開窓とふるい板は、契約、ブレーク拡張または試料調製中に合体壊れやすい構造であり、このように慎重な処理は、それらの整合性を維持するために必要とされます。上昇灌流圧14;固定液およびバッファ15の誤った浸透圧;不十分な固定または固定時間。とポストの固定、脱水、乾燥の速度は超微細構造の保存（ 図2）と干渉アーティファクトを生成することができるSEMのための処理のすべての領域です。開窓の損失（「窓外放出 &#39;）と開窓収縮が減少し開窓径および細胞間隙率で、その結果、貧困層の固定の結果として発生する可能性があります。 SEM分析のための試料の保存性を向上させる方法は、先に15-17に記載されていると説明されますここでは、試料の保存性を改善する方法についての追加のヒントを。試料保存の主な目標は、LSECの表面を可視化することができるように、正弦波から血液を除去し、高圧または遅延固定のいずれかからLSECの損傷を回避するためです。門脈を介して固定液の全肝灌流は、肝臓固定するための好ましい方法です。詳細に説明したように他の場所で16,18灌流が低圧で行われなければならない（例えば、H 2 0 10 cm）のLSECに圧力関連灌流遺物や損傷を回避するためには、典型的には、細胞膜における内などの大きなギャップを明らかに。他の箇所19で詳細に説明したようしかし、合理的な固定は、多くの場合、ヒトおよび動物の肝生検の針灌流を使用して得ることができます。血液試料からフラッシュされるまで、この技術は、直接組織に固定液を注入することを含むと組織がしっかりと固定されています。電子顕微鏡用試料の固定はPERFする必要があります肝臓極めて迅速自己分解プロセスの結果として生じる微細構造の変化を防止するための血流の停止後、できるだけ速やかにormed。 我々は、アーチファクトの混入を最小限に抑え、かつ開窓の測定を標準化する画像解析の方法をも提供します。多孔性および開窓周波数について顕微鏡写真用正弦波の選択の変化、アーティファクトの画像解析、およびセル面積の測定は、公表された結果の主な相違につながっています。開窓とデータ表示のための最小要件の評価および測定のための標準化されたアプローチは、明らかに以前4,10,20-31文献で ​​扱われていません。

<table><tbody><tr><td>25% EM grade Glutaraldehyde</td><td>ProSciTech</td><td>C001</td><td>Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>Always prepare Paraformaldehyde fresh</td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td>Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Osmium tretroxide</td><td>ProSciTech</td><td>C011</td><td>Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle</td></tr><tr><td>Ethanol- Absolute</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836&amp;nbsp;</td><td>100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve</td></tr><tr><td>Other grades of Ethanol</td><td>Labtech</td><td>EL5</td><td>Prepare graded Ethanols with dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52619&amp;nbsp;</td><td>Allow to reach room temperature before use</td></tr><tr><td>Cannulas</td><td>Terumo</td><td>TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td><td>18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice</td></tr><tr><td>Conductive Carbon tape</td><td>ProSciTech</td><td>IA0201</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Paint</td><td>ProSciTech</td><td>I003</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td></td><td></td><td>Must be obtained under license</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>Must be obtained under license</td></tr><tr><td>Molecular Sieve</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208647</td><td>Removes water from the 100 % Ethanol</td></tr></tbody></table>

a standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

走査電子顕微鏡による低倍率での初期の可視化は、多くの大規模な肝血管および正弦波（ 図1A）を観察するのに十分な大き露出面積と肝臓試料の平らな面を明らかにする。実装スタブの正しい肝臓ブロック配置を確保することが、この理由（ 図1B）のために避けるべきである正弦波と肝臓のグリソン鞘の鮮明な画像を得るために必須です。倍率を大きくすると、肝臓の密な血管構造の精密検査を可能にし、血管（ 図1C）を分割し、肝細胞の単一細胞プレートを明らかにする。悪い画質、血液細胞および残骸における肝結果の悪い固定肝臓（ 図1D）の視野を不明瞭。 また、倍率を大きくすると、LSECの開窓（ 図2A）の観察を可能にします。これは、正弦波がCORRていることが不可欠です<html> ectly特定さ-肝細胞のプレートは、ある状況下で、このような姿勢（ 図2B）を支援細管胆汁などの血管が、機能のように見えることができます。高い灌流圧はLSEC篩板の合体によって引き起こされると考えられ、そのような内皮における大きなギャップとしてアーティファクトを引き起こす可能性があります。これらは簡単にSEM（ 図2C）の下で識別されます。核の上に直接、細胞膜を回避することは開窓密度と気孔率の計算（ 図2D）の精度を支援します。 ImageJのでLSECの分析は、LSEC開窓径、密度と周波数（ 図3A）の定量化を可能にします。これらの寸法は、開窓の経験的な測定を提供し、老化、疾患、毒素または治療（ 図3B）によって誘導される変化の測定を可能にします。 ファイル/ ftp_upload / 52698 / 52698fig1.jpg &quot;/&gt; SEMと肝臓の可視化図1。 （B）グリソン鞘は、正弦波のすべての詳細を説明し;（C）肝臓の密な血管系と（A）SEMの下で最初の検査では、肝臓の正弦波とポータル道と中央静脈のものを含むより大きな血管を明らかに血管の間にある肝細胞の単一細胞プレート;崩壊した正弦波と超微細工芸品の開発における（D）悪い定着結果<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52698/52698fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52698/52698fig2.jpg" /> 図2.肝臓の超微細構造。（A）LSECの開窓を簡単に確認されています<html> Nウェル固定組織で、（B）よく保存毛細胆管と肝細胞の表面;高灌流圧による内皮における（C）大きなギャップ;（D）LSEC核矢印で示した表面の下に膨らみます薄いLSECと気孔率の分析のための領域に含まれるべきではない。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52698/52698fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52698/52698fig3.jpg" /> ImageJのでLSECの図3.分析。イメージJ分析から得られたデータによって生成された周波数ヒストグラム（B）、（A）多角形ツールは、測定のための全体の面積の測定を可能にし、ラインツールは開窓の直径を測定するために使用されます。269​​8fig3large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 直径（nm）と </td><td> 周波数（UM2あたり） </td><td> 気孔率（％） </td><td> リファレンス </td></tr><tr><td>ナ</td><td>ナ</td><td> 60±12 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 127±4nmで</td><td> 6.5±0.5 </td><td> 4.6±0.4 </td><td> 21 </td></tr><tr><td>ナ</td><td>ナ</td><td> 40.5 </td><td> 22 </td></tr><tr><td>ナ</td><td> 0.6±1.4 </td><td> 0.01±0.03 </td><td></td></tr><tr><td>ナ</td><td> 2.5±0.5 </td><td> 0.047±0.012 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> 87.25±1.4 </td><td>ナ</td><td> 9.22±0.7 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 100-200 </td><td> 4.49±0.69 </td><td>2.55±0.54 </td><td> 26 </td></tr><tr><td>ナ</td><td>ナ</td><td> 23±2 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 85±17 </td><td> 11±0.4 </td><td> 6.6±0.2 </td><td> 28 </td></tr><tr><td>ナ</td><td> 2.7±1.1 </td><td> 4.1±2.3 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 68±1 </td><td> 8±0.6 </td><td> 3.4±0.2 </td><td> 29 </td></tr><tr><td>ナ</td><td>ナ</td><td> 3.9±0.2 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 73.3±0.4 </td><td>ナ</td><td> 2.2±0.2 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> 90.7±11.7 </td><td> 8.45±2.43 </td><td> 5.93±2.05 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 110.7±0.25 </td><td> 9 </td><td> 6 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 104.8±0.22 </td><td> 13 </td><td> 8 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> 表1。 <st栄&gt;無傷で保存した肝臓組織におけるSEMにより測定した場合開窓径、周波数および気孔率の値の広い範囲を示すラットでの研究の選択から開窓の公表データは、（平均±SEM）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> アーチファクト </td></tr><tr><td>固定液の浸透圧と低すぎるバッファ（低張） </td><td>細胞膨張</td></tr><tr><td>固定液の浸透圧と高すぎるバッファー（高張） </td><td>細胞収縮</td></tr><tr><td>試料サイズが大きすぎます</td><td>固定剤は、インキュベーション=自己融解/不十分な定着時に十分に浸透することはできません</td></tr><tr><td>固定液のpHおよびオスミウムの前にバッファ未満7.2以上7.4 </td><td>タンパク質の変性と構造変形</td></tr><tr><td>固定時間が短すぎます</td><td>自己消化</td></tr><tr><td>固定時間が長すぎます</td><td>細胞収縮を引き起こす可能性があります</td></tr><tr><td>高温</td><td>定着速度がしかし、タンパク質を変性することができる増加</td></tr><tr><td>低温</td><td>不十分な固定</td></tr><tr><td>灌流圧が高すぎます</td><td>ギャップ、Disse拡大、肝細胞における空胞、篩板の損失、開窓径の拡大の空間</td></tr><tr><td>機械的損傷ミンチおよび/または鉗子を使用している場合</td><td>組織は固定液によって十分に硬化されていない場合、細胞構造の破砕</td></tr><tr><td>死後固定、試料生検、または瀉血に長時間</td><td>虚血、自己消化、ギャップ形成、窓外放出</td></tr><tr><td>低固定剤インキュベーション容量</td><td> 20倍未満の検体量=ブロックの中央に固定剤と自己分解の不十分な浸透。 </td></tr><tr><td> Fixative濃度が高すぎます</td><td>濃度は、固定および固定液の浸透速度に影響を与えます。アーチファクトの形成。 </td></tr><tr><td>固定剤の濃度が低すぎます</td><td>定着処理の前に固定液の枯渇は、細胞ブレブ形成およびその他の工芸品を生産完了です。 </td></tr><tr><td>肝臓での不完全な固定の兆候</td><td>細胞ブレブ形成（腫れ微絨毛や細胞質に由来する）、窓外放出、ギャップ、微絨毛の消失、腫れミトコンドリア、細胞膨張、崩壊または圧縮正弦波ルーメン、正弦波管腔内の血液、不規則な形状の肝細胞核</td></tr><tr><td>固定剤の血液汚染</td><td>固定液を無効にします</td></tr><tr><td>汚れた灌流と準備機器</td><td>破片や細菌による汚染を試料</td></tr><tr><td>塗布後の乾燥剤なしの標本やストレージの不完全な脱水</td><td>具体男性はチャージアップSEMに。ブロックにカーボン塗料を追加すると、電荷を減らすことができます</td></tr></tbody></table> 貧しい検体と画質表2.トラブルシューティングのヒント。

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A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K ビュー.  University of Sydney and Concord Hospital. The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

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Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

生化学

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

がん研究

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

免疫・感染学

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

生物学

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may form spontaneously or in response to growth factors, inflammatory cytokines, and phorbol esters. Some of the membrane protrusions may reorganize into circular membrane ruffles that fuse at their distal margins and form cups that close and separate into the cytoplasm as large, heterogeneous vacuoles called macropinosomes. During the process, ruffles trap extracellular fluid and solutes that internalize within macropinosomes. High-resolution scanning electron microscopy (SEM) is a commonly used imaging technique to visualize and quantify membrane ruffle formation, circular protrusions, and closed macropinocytic cups on the cell surface. The following protocol describes the cell culture conditions, stimulation of the membrane ruffle formation in vitro, and how to fix, dehydrate, and prepare cells for imaging using SEM. Quantification of membrane ruffling, data normalization, and stimulators and inhibitors of membrane ruffle formation are also described. This method can help answer key questions about the role of macropinocytosis in physiological and pathological processes, investigate new targets that regulate membrane ruffle formation, and identify yet uncharacterized physiological stimulators as well as novel pharmacological inhibitors of macropinocytosis.

Macropinocytosis is a highly conserved endocytic process initiated by the formation of F-actin-rich sheet-like membrane projections, also known as membrane ruffles. Increased rate of macropinocytotic solute internalization has been implicated in various pathological conditions. This protocol presents a method to quantify membrane ruffle formation in vitro using scanning electron microscopy.

走査型電子顕微鏡による膜ラッフル形成の可視化

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

医学

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of the intact endothelium will provide valuable information for understanding the cellular and molecular events in the dysfunctional endothelial cells. Here, we describe a modified en face immunofluorescence staining technique which enables scientists to obtain clear images of the intact endothelial surface and analyze the molecule expression patterns in situ. The method is simple and reliable for observing the entire endothelial monolayer at different sites of the aorta. This technique may be a promising tool for understanding the pathophysiology of atherosclerosis, especially at an early stage.

Here, we present a protocol for immunofluorescence staining to observe the endothelial cells of the mouse aorta directly. This technique is useful when studying the cellular and molecular phenotype of endothelial cells in different flow patterns and in the development of atherosclerosis.

血管内皮細胞を直接観察するためにエンフェイス免疫蛍光染色を用いて

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...