We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

全体的に、このプロトコルは、ⅰ）understudied生理学的なAPCとして内皮細胞を調査するための方法を説明し、ii）の「平面携帯APCモデル」の新規タイプとして。前者に関しては、ますます適応免疫応答16-18を形成する上で（造血APCに比べて、 すなわち ）を、周辺非造血（または「間質&#39;）APCは、重要な、非冗長な役割を果たしていることが理解されるようになりました。このような「セミプロ」のAPC、血管と（非常にプロフェッショナルAPCを上回っ）リンパ管内皮細胞の中では最高の16〜18感謝の一つです。しかし、シグナル伝達事象の詳細とその結合された免疫学的シナプスの大部分は未調査のままです。本明細書に記載の方法は、この新興地域での理解を進めるための基礎を提供します。例えば、個別のadaptivを示すことが知られている別の組織からの内皮上に形成されたISの研究にこれらの方法を適用しますE免疫学的機能 （例えば、肝臓およびリンパ内皮）が特に有益かもしれません。 重要なことに、この方法は、適応免疫応答の基本的なメカニズムを調べるための能力を高めるためにプロフェッショナルAPC人工APC基板モデルとの間のギャップを埋めるのに役立ちます。平面（ すなわち 、脂質二重層、抗体でコーティングされたガラス）のAPC基板に対し、そのようなモデルは、本質的に限られている（多くの重要な洞察7,11-14につながりました）最適な画像を提供しています。代替的に、生理学的な細胞間スキャンダイナミクスの詳細は、これまで深く向き関連イメージングの問題8-10によって隠されています。現在のアプローチで提供イメージング機能は、独自に他の方法で検出不可能な3次元細胞内アーキテクチャおよび生理学的APC-T細胞インタフェースの迅速なリモデリングを明らかにするために、この障害を克服します。抗原signalinの新たな理解のためにこれらのオファーの可能性グラム。 例えば、T細胞は、（例えば、 図2D、 図3）TCR、アクチンおよびシグナル伝達分子で富化ILPSを形成するという認識は、これらはおそらくマイクロクラスタシグナリング平面TCRに3次元カウンタ部が上に観察された生理学的に表すことを示唆しています人工APCは6,7,12-14,29-31を基質。これは、生理的な設定の下で、リンパ球が増幅し、重要な分子/活動32,33を濃縮することにより、シグナリング維持」signalosome&#39;様の特性を個別の細胞内「3D-反応体積」としてILPSを採用することができることを意味します。また、観光地において重要な生体力学的な入力（ すなわち 、細胞-細胞力付与）の存在は、APCに対してILP突起は、イメージングから推測することができる場合。機械的な力がますます抗原性シグナル伝達の重要なファシリテーターとして見ているよう正確にどのような力でありながら、これは、非自明です14,34-37不明なままで現れます。 プロフェッショナルAPCのための合理的な代理としてこのモデルの全体的な関連性は同様のILPアレイは類似の結像アプローチが採用されたとき（B細胞およびより少ない程度に）ECおよびDCの上に形成されたシナプスで見ることができることを当社の直接の実証により支持されている（例えば、 、同じ蛍光メーカー、IS面方位面19）の制御を使用します。それにもかかわらず、それはプロAPC膜表面に対するECの相対的な生体力学的特性が不明であること、およびこのパラメータの差がISトポロジおよび抗原応答の内容に影響を与える可能性があることを考慮する必要があります。 本明細書に記載されたアプローチの鍵となるのは、その解像度の利点に強く関連しています。これは、今度は、蛍光シグナルの強度に非常に関連しています。このように、蛍光物質のトランスフェクションおよび染色の最適化に特別な注意を払うことが重要ですセントは、記者と撮影パラメータ/技術（例えば、露光時間、焦点、 など）。前者に関しては、ここで説明した生細胞研究のためのプロトコルは、一般的な膜とリアルタイム（ 例えば 、 図2中のT細胞のAPC界面におけるトポロジの変更、映画1を報告し、細胞質マーカーのトランスフェクションに限定されています、 2）。さらに、このプロトコルは、容易に、シグナリングおよび生体力学のための内皮で同時に導入/イメージングさらにレポーター（例えば、蛍光タンパク質タグ付きMHCI / IIとの密着性、共刺激および共阻害分子およびバイオセンサーによって、より高度な分析のために変更することができますダイナミクス）。しかし、残念ながら、一般的な制限は、リンパ球が有名トランスフェクトすることが困難であるということです。これは、蛍光タンパク質生細胞イメージングのためのT細胞（例えば、TCRにタグ付けし、PKC-Q など ）の便利な使用を妨げます。 一方現在のプロトコルサグ（広く使用されているモデル）を介してヒトエフェクター/メモリーCD4 + Th1型リンパ球の活性化を伴う、より広範な可能性が存在します。以前19,20を実証したように、このアプローチは、他のCD4 + サブセットと応答を殺 ​​すCD8 + リンパ球の活性化の応答として、他の設定の広い範囲のに容易に適合可能です。既存のTCRトランスジェニック株由来のリンパ球と内皮細胞の単離を経て、この方法は、特定のペプチド抗原19,20に対する応答を研究するためにも容易に適用可能です。最後に、現在のアプローチは、エフェクター/メモリーT細胞の検査に限定されています。しかし、本質的な共刺激分子（CD80 / 86、通常内皮に発現していない）と内皮細胞のトランスフェクションは、このモデルでナイーブ細胞プライミングダイナミクスの研究を可能にすることがあります。

Tリンパ球は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に結合した、効率的ペプチド抗原（銀）を認識する能力を特徴と適応免疫系の分岐であるが、それらのT細胞受容体（TCR）を介して1分子。ナイーブリンパ球恒常移行し、「プロのAg提示細胞」（APCは、 例えば 、樹状細胞）をスキャンするメモリ/エフェクターT細胞が効果的に末梢組織内のAPCおよび潜在的な標的細胞の非常に広い範囲を調査する必要がある一方で、リンパ節内。 APC上の同族銀の当初認識以下分では、リンパ球は、それらの移動を阻止し、（IS）「免疫シナプス」と呼ばれる特殊な親密な細胞間のインタフェースを形成し始めます。持続（ すなわち 、30〜60分）は接点が増幅し、2-7のシグナリング維持する必要がありますされています。新興の研究では、IS内、それが連続形成し、迅速なRであることを識別強度および免疫応答2-7を得られるの品質を決定する（ すなわち 、MHC / AgをTCR、F-アクチン、接着およびシグナル伝達分子を含む）は、離散サブ細胞シグナルマイクロクラスタemodeling。しかし、このプロセスの動的な詳細及び調節機構は不完全に理解されている8,9。これは、APC表面の不規則なトポロジーに関連する技術的な課題や細胞間相互作用面のコントロール不良の向き、深く必要な時空間イメージングは8月10日 （Figure1A）に近づく制限の問題から大きく茎。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> イメージング免疫学的シナプスのダイナミクスについては、図1のA生理学的平面内細胞APCモデル。概略的には、T細胞とprofessio間の免疫学的シナプスの伝統的なイメージングを示しています<html>最終APC（A）とT細胞とこの新規内皮平面APCモデル（C）と比較して、従来の平面脂質二重層APCモデル（B）。プロフェッショナルAPCは、生理学的、免疫学的シナプスを提供するが、不十分指向細胞間のインタフェースを提供（最適なX-Yの撮像面に対してすなわち 、;解像度〜0.2μm）で、劇的空間（Zの撮像面〜1μmの分解能）および時間的（ すなわち 、妥協します繰り返しイメージングのすべてのzイメージングプレーン）の解像度をスキャンする必要性に起因します。二層モデルは、最適な時空間分解能イメージングを提供する平面のトポロジーを持っているだけでなく、高度に簡略化された非生理学的な剛性です。この内皮細胞モデルは、生理学的な設定で最適な空間と時間的画像の解像度を提供するために、古典的なAPCの生理学的基質と脂質二重層の平面トポロジを兼ね備えています。M /ファイル/ ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 以前の研究は、部分的に最適なXYイメージングに平行である、単一の計画に、T細胞活性化の面を固定経由で最適な時空間解像度（ すなわちを提供し 、平面基板モデル（ すなわち 、脂質二重層と抗体被覆表面）、開発することによって、これらの障害物を回避していますプレーン）11-15（ 図1B）。これらのモデルは、動的なアクチン/ TCRシグナリングマイクロクラスター7,11-14の発見を含むT細胞における抗原性のシグナル伝達を制御する分子/細胞内動態に重要な洞察を容易にしました。しかし、このようなモデルは、本質的に単純化されるだけでなく、剛性（ 図1B）（3次元位相幾何学的特徴の開発/研究を排除）。したがって、PHYに、このような調査結果を関連付ける方法を依然として不透明siologic細胞 - 細胞免疫監視。 まだunderstudiedものの、血管やリンパ管の内皮細胞は、「セミプロ」のAPC 16-18の大（ すなわち 、〜1000倍により、すべてのプロフェッショナルAPCより数の大きい）周辺の区画として浮上しています。これらの細胞は、MHC-I、MHC-II-および共刺激分子の多数を表現（例えば、CD40、LFA3、ICOSL、4-1BB、OX40L、TL1A、PD-L1;ではなく、CD80およびCD86）と戦略的です彼らは16-18特殊なセンチネル機能を果たし、血液-組織界面に位置します。以前の研究では、内皮細胞が効果的にエフェクター/メモリー、しかしナイーブではない、T細胞の19-25を再刺激することができることを実証しました。従って、内皮細胞は、T細胞の活性化、分化、メモリーと寛容16,17,26のローカル影響などの末梢組織中での適応免疫応答のエフェクター相に固有のAPCの役割を果たしている可能性があります。 CRIin vitroで増殖させた場合tically、 内皮細胞は、実質的に平面状のセル表面を形成し、（蛍光タンパク質レポーターを用いて、 例えば、）容易にトランスフェクトされています。これらの機能は、細胞間相互作用19,27の間の位相幾何学的力学の高時空間分解能イメージングに最適です。従って、内皮細胞は、抗原認識を駆動し、応答（ 図1C）19,20 を制御する細胞内分子/改造メカニズムの研究のための明らかに適した生理的な「平面携帯APC」モデルとなる恐れがあります。 接着および経内皮移動27中の白血球-内皮相互作用の詳細を研究するための（形質膜と細胞質ゾルの蛍光タンパク質メーカーと内皮細胞のトランスフェクションを含む）以前に確立された補完的なイメージング技術は、白血球が積極的にダイナミックによって内皮の表面を探査することを示しました挿入ANサブミクロンスケールのd後退は、アクチン豊富な円筒状の突起が（〜直径、深さ200〜1,000 nm）をinvadosome状突起（ すなわち 、「ILPS &#39;）27,28と呼ばれます 。これらのイメージング手法は、さらに19,20を報告し、本明細書でさらに説明するように、T細胞、内皮免疫学的シナプスの高時空間分解能イメージングのための最初の方法を開発する内皮APC機能を利用するためのプロトコルの作成 ​​に伴って拡張されました。この小説平面携帯APCモデル由来中央知見は、T細胞ILPSは、初期のAg検出を促進する上で、その後のシグナル伝達を維持するには、両方の機能することです。実際、（安定化およびカルシウム流入初期に応じて計上されていた）、TCRと活性なシグナルなどのPKC-Q、ZAP-70、ホスホチロシンとHS1の示唆に富む分子でshow濃縮を複数ILPSの配列。したがって、ILPSは、TCRシグナルマイクロへの3次元生理学的同等を表しているように見えます平面二重層モデルで見られたクラスタ。このアプローチは、このように、敏感に明らかに/レポート分子と建築（および生体力学的暗黙の）ダイナミクスそうでなければ検出できません。 本明細書に記載の方法は、適応免疫応答の基本的なメカニズムを調べるために我々の能力を向上させるために、プロのAPCと人工APC基板モデル間のギャップを埋めるに有用であるはずです。ここでの焦点は、CD4 + Th1型エフェクター/メモリー細胞の活性化にある間に、以下に説明するように、この基本的なアプローチは、容易に、T細胞型とのAgの広い範囲を研究するために改変することができます。

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer stretch latex free tourniquet</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD alcohol swabs</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Bring to RT before use</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>staphylococcal enterotoxin B</td><td>Toxin Technology</td><td>BT202RED</td><td>Stock solution 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>toxic shock syndrome toxin 1</td><td>Toxin Technology</td><td>TT606RED</td><td>Stock solution 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>human IL-15</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Stock solution 50ug/ml in PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Stock solution 10x, dilute in PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Required Kit for step 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>phenol Red-free HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Stock solution 1M in H20</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Stock solution 1M in H20</td></tr><tr><td>Human Serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Stock solution 1mM in DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Toxic, use fumehood</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Corning Cell Culture Treated T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&amp;nbsp;</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon Tissue Culture Plates 24-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Delta-T plates</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Disposable Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;ICAM1 mouse anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 mouse anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 Alexa Fluor&amp;reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHC Class II antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Talin 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKC theta antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>phosphotyrosine (4G10 Platinum)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Required electroporator for step 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Forma STRCYCLE 37 &amp;deg;C, 5% CO2 Cell culture Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr><tr><td>Isotemp Waterbath model 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

an endothelial planar cell model for imaging immunological synapse dynamics

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞（「APCの &#39;）との間の動的な相互作用によって調節される「免疫学的シナプス」と呼ばれます。これらの親密な細胞間のインタフェース内の個別のサブセルラーMHC / AgをTCRのクラスター、F-アクチン、接着およびシグナル伝達分子を形成し、急速に改造。これらのダイナミクスは、病理学的免疫対開発し、したがって、保護の免疫応答の効率と品質の両方の重要な決定要因であると考えられています。生理学的なAPCとの免疫学的シナプスの現在の理解を得ることができる画像解像度の不足によって制限されます。人工基質モデル （例えば、平面脂質二重膜）は、優れた解像度を提供し、非常に貴重なツールとなっているが、彼 ​​らは本質的に非生理学的および単純化し過ぎています。血管とリンパ内皮細胞は重要な末梢組織（または間質）として出現した「半専門職のコンパートメントアルのAPC」。 （プロフェッショナルAPCの分子機構のほとんどを発現する）これらのAPCは、事実上平面状細胞表面を形成するユニークな機能を持っており、（蛍光タンパク質レポーターで、 例えば ）は、容易にトランスフェクトされています。基本的な抗原性シグナル伝達プロセスの改善されたイメージング及び質問のための新規な及び生理的な「平面セルラーAPCモデル &#39;に説明するように内皮細胞を実装するために、本明細書の基本的なアプローチ。

内皮細胞を使用し、生理的な複雑さとプロフェッショナルAPCの変形能を有する平面脂質二重層モデルの解像度の利点を組み合わせた新たなイメージング手法は、（ 図1）を開発しました。2本で観察された典型的な移行、カルシウムフラックスとトポロジカルダイナミクスの例を示します。図アプローチ。内皮上のサグ不在下でサグ特異的CD4 +のTh1リンパ球が急速に偏光さ、広がり、カルシウムを流動させずに内皮表面（ 図2A）を介して横方向に移動する（図示せず）。 〜5-10分以内に、これらのリンパ球は、内皮を通過する遊出を開始します。彼らが示す、その間、内皮へのSAg搭載の存在下では、リンパ球（すなわち、30〜60分間）は、細胞内カルシウムフラックス（動画1 図2B）持続、「目玉焼き」トポロジーと対称的に広がっ開始しますほとんど、あるいは全くの移行（ 図2C）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig2.jpg" /> T細胞活性化および内皮のAPCの移動及び免疫学的シナプスのトポロジの図2生細胞分析 （A）パネルがsagの非存在下での内皮細胞上のT細胞遊走の時系列画像の一例を示します。上のパネルはDIC画像を示します。移行T細胞の初期位置は、赤い点線で示されています。下のパネルは、移行T細胞のことで内皮上に形成された陥入を示しています。矢印は内皮APC表面に対して「invadosome状突起」（ILPS）（D参照）のT細胞の生成の結果として形成された膜-YFP蛍光の過渡リング（〜0.5〜1ミクロンの直径）の形成を示しています。 （B）は、サグロード内皮（左の存在下で同様の一連の例を示す図である。も参照してください。ムービー1）及びカルシウムレベル（右）の動的変化を定量的にトレースを対応します。矢印は、高カルシウムフラックス（II）と相関カルシウムフラックス（i）の開始と相関初期ILPS形成し、複数のILPSのその後の安定化を示しています。 A及びBのような（C）実験は細胞追跡分析に供しました。 10分（赤のトレース）の期間に残さショーの代表的なT細胞の移行パスのDIC画像。右のグラフがsagの非存在下および存在下で算出された移動速度を示しています。 （D）（19から変更された）免疫学的シナプストポロジの動的解析。 （I）は、膜標的-YFPおよび可溶性細胞質ゾルRFPからなる敏感内皮細胞/ APC「トポロジーレポーター系 &#39;を示す回路図。円筒状の陥入を生成する内皮細胞表面に突出アクチン媒介ILPグラム（細胞フットプリントの種類は、「podoプリント」と呼びます）膜YFP蛍光のリングとして現れる鋭く曲がった膜へiving上昇（ すなわち 、 顔専用閲覧シリンダーの壁）。これらの遺伝子座でのサイトゾル変位と除外はサイトゾルRFPのようにくまが表示されます。 DIC及び（ii）のSAgの存在下で、このような分析の例を示しにおける蛍光画像（動画も2に対応する参照してください）​​。 podoプリント/ ILPは&gt; 20の配列に展開する単一の初期には、15分かけてILPSを安定化。 15分でブルーボックス（iii）は、膜-YFPのリングは除外サイトゾルのRFPの領域と重なることにより、単一podoプリント/ ILPの高解像度の図を示します。破線（iv）は、蛍光強度の定量的なラインスキャン分析を示します。スケールバー=5μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 以前に確立されたように、リンパ球は、ACTIVエリーアクチンを拡張することによって内皮細胞の表面を探査し、HS1（コータクチンホモログ）が富化とWASp-とSRC依存突起がinvadosome状突起」と呼ばれます。 （ILPS;直径、深さ各〜0.5〜1ミクロン）27,28。膜標的化蛍光タンパク質（FP）のトランスフェクションは、細胞表面での細胞内トポロジカル力学ため高感度のレポーターを提供することが実証されています。これにより、蛍光膜-FPの明るいリングはT細胞ILPS突起の結果として、T細胞 - 内皮相互作用の間に曲げ膜を示すものであることが示されています。それはここに示されている、とされている以前の研究19,20で、小さな急速ILPSフォームと売上高のクラスター（ すなわち 、10〜30秒〜の寿命）のSAgの不在下での内皮上のT細胞の横方向の移行時（ 図2Aに対し、 ）、それらは非常に安定化（ すなわち 、〜30分の寿命）と存在下で高密度のアレイに蓄積するようになりますサグ（ 図2B）。また、ILPSカルシウム開始動態の解析（「オフセット時間」）ILPSは、それらがMHC-II / Agの認識処理（ 図2Bii）の助けを示唆し、カルシウムシグナル伝達に先行することを示しています。さらに、ILPSアレイを安定化し、最大のカルシウム流入（ 図2Bii）に見合っを形成します。アイデアは、膜蛍光のリングは、内皮のAPCにおける個別の陥入スポットを駆動するT細胞の突起に対応する、すべての場合において、これらの環は、可溶性のDsRedによって報告されるように変位/除外質のゾーン（と空間的および動力学的に相関デモによって確認されました。 図2Dムービー2）。 図3は、固定されたエンドポイント共焦点イメージング研究の例を示します。 T細胞および内皮のAPCとの間に形成されたサグのISの存在下での共インキュベーションの10分後、私は、固定によって画像化しましたmmuno蛍光染色および共焦点顕微鏡。これらの研究は重要な分子の細胞内分布動態の分析を提供し、ILPSに特に関連してのIS内シグナル伝達活性を。具体的には、細胞骨格/細胞骨格レギュレータ（アクチン、HS1; 図3A）、抗原提示/認識（CD3 / MHC-II; 図3B）接着（ICAM-1、LFA-1、タリン; 図3C）、および抗原シグナリング（PKC -Q; 図3D）は、podo-プリント/ ILP中で共濃縮されていることが見られます。共焦点の連続切片のzスタックのデジタル再構成は、T細胞、内皮細胞、内皮は、APCの表面に突出するT細胞ILPにより中断離散3次元構造（ 図3Aii、Ci を有していることが図2Dに示されるものと相補的な証拠を提供しますIII、D）。 （ 図3Civ）。 <img alt="図3" src= &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53288 / 53288fig3.jpg&quot; /&gt; T細胞-内皮細胞の免疫学的シナプスにおける分子の分布動態の図3.固定サンプル分析はリンパ球は、30分間垂れロード内皮上でインキュベートし、固定し、染色しました。示されたパネルに、内皮細胞は、膜または-DsRed YFPを発現するように事前にトランスフェクトしました。 （A）代表イメージングショーアクチン（i）とHS1（コータクチンホモログと、ii）内皮蛍光膜-YFPのリング（ すなわち 、 &#39;の中心と相関マイクロクラスターにおける免疫学的シナプスの周囲に共同濃縮podo-プリント&#39;; 図2Dを参照してください ）、T細胞ILPSがpodo・プリントの出現に関与していることを確認しました。側面図（II。90°プロジェクション）がILPSは（19から変更）は、z の撮像面における3次元突起を表すことを示しています。 （B）代表のT細胞のTCR（i）の濃縮およびendothelial MHC-II（ii）は、免疫学的シナプスの中に、ILP / podo-プリントに個別の細胞内のパーティションを示しています。それぞれISの（C）（ⅰ）podo-プリントとILPにおけるICAM-1およびLFA-1の代表的な共同濃縮、。 （I）60°（上パネル）を回転させ、90°（直交ビュー;下パネル）、ISの共焦点セクションの3次元デジタル再構成を表示します。 （ii）の顔専用 ISのズームビューを表示します。 （ⅲ）（ⅱ）（19から変更）で箱入りの地域の直交断面図を示します。 （IV）IS ILPSにおける代表タリンの共同濃縮（integtin /アクチンリンカータンパク質）とアクチンを。 （D）中のアクチンとTCRシグナル伝達分子、PKC-Qの代表的な同時濃縮はILPSです。各パネルには専用面図 （左下部分）と、2つの異なる直交ビュー（90°プロジェクション）を示しています。左端と右のパネルの使用は、それらのそれぞれの隣接パネルの複製であり、虹fluorescencを使用して投影（19から変更された）電子の強度スケール。スケールバー=5μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="ムービー1" src="/files/ftp_upload/53288/53288movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288movie1.mov">動画1：T細胞カルシウムシグナル伝達の生細胞の動的イメージングと免疫学的シナプストポロジ</a>内皮は、膜-YFPを発現させ、 図2Bに対応するサグを搭載したとの対話FURA2ロードされたCD4 +のTh1リンパ球のタイムラプスライブセルイメージング。 T細胞中;：（暖色系高カルシウムクールな色、低カルシウム虹）左のパネルは、細胞内カルシウムレベルを示しています。右のパネルは、内皮、APCの表面に膜-YFP蛍光を示します。リンパ球を拡散し、ILPの形成を開始するために見られている（; すなわち 、「podo-プリント&#39;; MEM-YFPチャンネルで蛍光リングを経由して見られるように、図2BIを参照してください ）、持続的な（30〜60分）は、細胞内カルシウム流動の誘導に続いて、 TCR /アクチンに類似ILPS / podo-プリントの周辺配列の形成に見合っ発生する平面二重層APCモデル（ 図2Biiを参照）に見られること「マイクロクラスタ化されたシグナル伝達」。フレーム間の間隔は20秒です。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/Movie1_finale_02_18_15.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="ムービー2" src="/files/ftp_upload/53288/53288movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288movie2.mov">ムービー2：免疫学的シナプストポロジVIの生細胞の動的イメージング</a>内皮のAPCにおける蛍光レポーター。（左DIC）、CD4 +のTh1リンパ球のタイムラプスライブセルイメージング内皮共発現する膜-YFP（緑）および可溶性細胞質ゾルのDsRed（赤色）との相互作用サグを搭載した、に対応図2D。右側のパネルには、DIC、膜と細胞質のシグナル伝達のマージを示しています。膜と細胞質の蛍光の合成信号は、敏感に複数の形成およびリモデリングを報告〜ILPの突起でプローブ配列のT細胞から生じる0.2-1ミクロンスケールの表面陥入（podo-プリント）。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/Movie2_finale_02_18_15.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K ビュー.  Harvard Medical School - BIDMC. Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

ビデオ: An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

免疫・感染学

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

生物学

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

神経科学

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

ヒト免疫シナプスのイメージング

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

要約

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合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタフェースの評価

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

ヒト免疫シナプスのイメージング

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

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合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

ヒト免疫シナプスのイメージング

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタフェースの評価