We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

注：すべてのゼブラフィッシュの研究や動物の維持管理は、メイヨークリニック研究所IACUC承認されたプロトコル＃A41213と一致して行われた。 遺伝子導入のための1。DNA構築<ol><li> DNAテンプレートとして（BACPACリソースセンター（BPRC）から）CH211-270H11 BACクローンを用いて5.2 kbのドーパミンβヒドロキシラーゼさ（dβH）プロモーター領域8を増幅する。 2分間94°C（94°C、15秒、50℃、10サイクルの30秒、68℃：長いDNA鋳型の長さの正確なPCR増幅のためのPCRシステムの適切かつPCRのための以下のサイクルプログラムを使用（94℃、15秒、53℃、30秒、68℃、8分）、68℃、4分（フォワードプライマー5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39;の30サイクル、続いてC、8分）リバースプライマー5&#39;GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;）。 </li><li> DβH-pDONRP4-P1RエントリーCLOを作成します。そのようなマルチサイトゲートウェイとして商業的組換えクローニングシステムを用いね8。 （他のゲートウェイベクトルは博士カイビンチェン、大学からの寛大な贈り物ですと共に。ユタ）を精製DβHPCR産物（172 ng /μLで）、1μL（150 ng /μLで）pDONRP4-P1Rドナーベクターの1μLを混ぜる、BPクロナーゼ酵素ミックスの2μlのTEバッファー4μlの（pH8.0）を、25℃で1時間インキュベートした後、ワンショットTOP10 コンピテントに変換大腸菌製造業者のプロトコルに従って。 </li><li> EGFP-MYCN遺伝子導入コンストラクト8ステップ1.2で述べた組換えクローニングシステムを使用して：DのβHを生成します。 EGFPは、停止コドンを欠いている、5.2 kbのDβHのプロモーターを含む各エントリークローン（150 ng /μLで）（DβH-pDONR P4-P1R構築物）の1μLを混ぜる（PME-EGFPを構築）、およびヒトMYCNのcDNA（寛大な贈り物ペンシルベニア州の小児病院のDr. Hogarty、MYCN-pDONRP2R-からI-SceIの認識部位を含有する改変デスティネーションベクター（博士C. Grabher、カールスルーエ大学、カールスルーエ、ドイツ）からの寛大な贈り物、TEバッファー4μlの（のP3構築物）、1μL（150 ng /μLで） LRクロナーゼ酵素ミックス2μlのでpH8.0）、25℃で1時間インキュベートした後、化学的にコンピテントに変換大腸菌のようなワンショットトップ10と、製造業者のプロトコルに従ってください。 </li><li> MITFを行います。MITF遺伝子導入は、PNP-MITFベクトル消化し ​​て8を構築NotIおよびSalI制限酵素で2時間室温で、およびリリース2.65-kbのをサブクローニングすることにより（博士D. Raible、大学からの寛大な贈り物をワシントンの。） MITFプロモーターおよび隣接するI-SceI制限酵素認識部位を含有する改変pBluescriptベクターのNotI及びMluI部位にゼブラフィッシュMITF遺伝子のコード配列を含むDNA断片（博士ホイ鉄からの寛大な贈り物ngの、ボストン大学）、製造業者のプロトコールに従ってT4 DNAリガーゼを用いて。 注：安定したMYCN発現性の線の発生効率を高めるために、DβH：EGFP-MYCNとMITF：MITF DNA構築物は、1細胞期真珠層の胚に同時注入された真珠層は 、神経由来の堤を欠く変異魚のタイプを指定する。開発36中にメラニン保有。このように、注入された胚における色 ​​素細胞の出現はMITFの統合を提案する：MITF DNAがゲノム中に構築する。それは、2つまたは3つの共注入DNA構築物は、魚のゲノム31に共和分できることが実証されている。 EGFP-MYCN遺伝子およびMYCN安定したトランスジェニック系統の識別を容易にするために：このように、MITF発現によって引き起こされる色素沈着は、DβHの統合のためのマーカーとして役立つことができる。 </li><li> EGFP-MYCNとMITF：MITF DNA のDβHを混ぜるI-SceI制限酵素の1μLとバッファの0.75μlの15μlの反応の総体積：1の比率3で ​​構築します。反応中のDNAの総量は750 NGを超えていないことを確認してください。 </li><li> 4時間またはO / N RTでI-SceIの消化を行ってください。二日目は、I-SceI-は DNAがマイクロインジェクションのために準備ができているか、将来的に注射のために-20℃で保存することができます消化。その酵素の効率を維持するために、少量のアリコートで-80℃で、I-SceI制限酵素を保管してください。 </li><li>博士C. GrabherからpENTRY1Aベクトル（寛大な贈り物のEcoRI及びNotI部位にpcDNA3ベクター（ダナ·ファーバー癌研究所で博士ジョージからの寛大な贈り物）7から人間ALKF1174Lと野生型ALK遺伝子をサブクローニング製造業者のプロトコールに従ってT4 DNAリガーゼを用いて技術、カールスルーエ、ドイツ）のカールスルーエ大学。 </li><li> DのβHを生成します。ALKF1174L &lt;/ em&gt;のか、DβH：プロトコル1.2で述べたように、組換えシステムを使用してALKWTジェニック構築します。簡単に言えば、3エントリークローンを組み合わせ、DβH-pDONRP4-P1R、ALKF1174L- pENTRY1A（またはALKWT -pENTRY1A）とP3E-ポリA、I-SceIの認識部位（博士C. Grabher、カールスルーエからの寛大な贈り物を含有する改変デスティネーションベクターへ工科大学、カールスルーエ、ドイツ）を、製造元のプロトコールに従って、LRクロナーゼ酵素ミックスを用いた。 </li><li>ミックスDβH：ALKF1174L（またはDβH：ALKWT）とDβH：mCherryを DNAは3で構築：1の割合とプロトコル1.5から1.6に記載されているように、I-SceIを酵素でそれらを線形化する。 </li></ol> 2.マイクロインジェクション<ol><li>すべての注射37用の1.0ミリメートル径のガラスマイクロピペットを使用してください。注射の前にカミソリの刃でガラスマイクロピペットの先端を折ります。注入により注入量のキャリブレーション鉱物油の滴中にH 2 Oをる。得られた液滴の直径を測定し、注入量は、1細胞期胚の全細胞体積の10％未満であることを確実にするインジェクター（圧力または圧力パルスの持続時間）を調整する。 </li><li> DNAは遺伝子導入38の効率を向上させるために右の注射の前に構築を含む注射液5μlの新鮮なI-SceI制限酵素の追加の0.5μL（5単位/μl）を追加します。 1細胞期胚の細胞質に線形化されたDNA構築物の50〜80頁を注入する。注射の成功を確実にするために、可視化のための0.25％フェノールレッドでサンプルを混ぜる。細胞は、注射後の赤を回す場合には、マイクロインジェクションが成功したことを示します。トランスジェニック魚を生成するための高い成功率を確実にするために、我々は、典型的には500人もの胚を注入する。 </li><li> EGFP-MYC：安定的MYCNを発現するトランスジェニック魚を生成するには、線形化されたDのβHを coinjectNとMITF：MITF DNA構築物（3：1の比率）1細胞期での色素沈着変異体真珠層のゼブラフィッシュの胚へ。 MITFの発現は、魚のゲノムにおけるトランスジェニックコンストラクトの統合のためのレポーターとして機能します。 </li><li>野生型又はMYCN遺伝子導入胚におけるALKのモザイク過剰発現のために、線形化されたDのβHを共同注入する：ALK F1174L（またはDβH：ALKWT）DβHと：1 -細胞へ：mCherryを DNAは、（1比3で）構築野生型ABの魚を有するトランスジェニック魚：F1ヘテロ接合のTg（EGFP-MYCNDβH）の繁殖から生じた胚。したがって、子孫の半分はMCYNについてトランスジェニックであり、半分が野生型である。 </li></ol>安定またはモザイクトランスジェニック魚3.画面<ol><li>トリカイン（0.02％）Aで主に注入された真珠層の胚を麻酔、安定したMYCN発現性ラインの識別の効率を高めるために、T日色素沈着のための受精後、画面の3-5。生殖細胞にEGFP-MYCN導入遺伝子：DβHを運ぶ創業者の魚のためにさらなるスクリーニングのために性的成熟にそれらを新鮮な卵の水で新しいペトリ皿に色素沈着を持つ胚を移し、上げる。 </li><li> EGFP-MYCN、さらなる遺伝子型決定のため1〜2日後に受精でのEGFP陽性胚のために、野生型ABの魚と画面との異系交配着色されたF0の成魚の生殖系列伝達との創設者を特定するには。 PCRチューブにシングルEGFP陽性F1胚を配置し、すべての液体を除去する。シングル胚に4倍の溶解バッファー12.5μlのが含まれているのgDNA抽出緩衝液50μl、35μlのH 2 Oおよび2.5μlのプロテイナーゼK（10mg / mlの）を追加します。 1Mの1Mトリス（pHは8.4）の500μlを添加、4倍の溶解緩衝液50ミリリットルを作成するにはプロテイナーゼKを不活性化するために98ºCでのインキュベーションの10分に続いて55℃、2.5ミリリットルで2〜3時間にわたって反応をインキュベート塩化カリウムトンH 2 OのO 47ミリリットル注：F0 MYCN安定したトランスジェニック魚は、野生型ABの魚と交配された後、子孫のすべてが着色されている。このため、色素沈着はMYCN-ポジティブ魚の同定のためのマーカーとして使用することはできません。 MYCN遺伝子導入魚に、EGFP-MYCN融合タンパク質は、上頸神経節や、延髄などのシーケンシャル交感神経鎖のセグメント神経節と非PSNSのドーパミン作動性ニューロンの交感神経ニューロンを含む、PSNSで表現されている間、脳神経節8。このように、EGFPの発現は、MYCN安定トランスジェニック胚の同定のためのマーカーとして役立ち得る。 </li><li> 、テンプレートとして着色されたF1胚から抽出されたgDNAを2μlのを使用して、MYCNとをプライマー-test F1：5&#39;-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3：5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 」、および次のプログラムのウィット時間GC-RICH PCRシステム：3分間95℃を1サイクル、30秒間95℃の25サイクル、30秒間58℃、3分間72℃。私たちは通常、MITFとMYCN過剰発現する、着色された胚における統合されたMYCN導入遺伝子の存在を確認するために、単一の交配から複数の6創業者の魚を14〜16着色された胚を遺伝子型は、この方法により同定した。 </li><li> EGFP陽性F1胚の残りを上げる。フィンクリップ、さらに魚にMYCN導入遺伝子の統合を確認するために、上記のプロトコルを使用して、生後2-3カ月でそれらを遺伝子型。野生型ABの魚とF1 MYCN安定したトランスジェニック魚を繁殖させる。 DβHで：ALK F1174L（ALKWTまたはDβH：）：線形化されたDのβHを共同注入PROTOCOL 2.4で説明したようにmCherryを DNAが1細胞胚に構築する。 </li><li>立体的なフッ素を使用してプロトコル2.4で説明した実験で胚を発現性MYCNをソートescence顕微鏡とPSNSにおけるEGFP-MYCNの発現のために受精後の日数1-3で主に注入した胚を選別する。その後、受精後の日の2-5の間に、トリカイン（0.02％）で胚を麻酔して、再度、立体蛍光顕微鏡を用いてPSNSにmCherryを発現に基づくものMYCN-正または負の胚を並べ替える。 mCherryをの発現はモザイク主要注入された動物の組織におけるALKの共発現のためのマーカーとして役立つ。 注：ALK F1174LとDβH：mCherryを、DβH：ALKWTとDβH：mCherryを 、またはDβH野生型の魚とMYCN安定したトランスジェニック魚の繁殖に起因〜600子孫は、DβHを含む、線状化DNA構築物でグループごとに注入した：mCherryを一人で、それぞれ。 mCherryをモザイク発現は、主に注射した魚の70〜90％で観察することができる。分の1へのワン半分注入された魚の3分の1は、腫瘍の腕時計のための幼虫段階を生き残った。 </li><li> mCherryを + MYCN +とmCherryを + MYCNのすべてを上げる-胚は、ゼブラフィッシュブック39から標準的なプロトコルに従って、および5週間の受精後から始まる腫瘍の発症を監視します。 </li></ol>モザイクトランスジェニックフィッシュ4.腫瘍の腕時計<ol><li>腫瘍の発症の証拠を5週間の受精後から始まる2週間ごとmCherry-ポジティブ主に注入された魚を監視します。 </li><li>トリカイン（0.02％）とmCherryをの存在のために画面に魚を麻酔-およびEGFPは、デジタル視覚DS-U1カメラを備えたニコンSMZ-1500立体蛍光顕微鏡PSNSに発現腫瘍。 </li><li>腫瘍がALK導入遺伝子を発現しているかどうかを確認するには、ALK遺伝子型判定PCRにmCherry-とEGFP陽性塊を分離する。 </li><li> PCRを用いて、ゲノムDNAを増幅するALK P7：5&#39;-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 &#39;およびALKの P18：5&#39;-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3&#39;および以下のPCR反応：1サイクル以下のプライマーを用いて開発された腫瘍から抽出された5分間94℃で、30サイクル（30秒間、30秒間94℃、55℃、および60秒間72°C）。その後、シーケンスALKの P7プライマーを用いたPCR産物は、さらにmCherryを陽性腫瘍における突然変異又は野生型ALKの存在を確認する。 </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+high-risk+neuroblastoma.">The genetic landscape of high-risk neuroblastoma.</a> Nature genetics. , (2013).</li><li>Berry, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK(F1174L)+mutation+potentiates+the+oncogenic+activity+of+MYCN+in+neuroblastoma.">The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma.</a> Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).</li><li>Heukamp, L. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish.">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li><li>Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

この代表的な研究では、これらの遺伝子が著しく化合物、安定したトランスジェニック魚の共発現における当社の以前の知見と一致、神経芽細胞腫の発症を加速するために協力することを示すためにトランスジェニック魚を発現性MYCNでmCherryをレポーター遺伝子で活性化ALKの一過性同時注入と同時発現を使用両方のALKとMYCN 8を活性化した。このモザイ...

癌は、経時的な病理学的突然変異、欠失、および染色体ゲインの蓄積によって特徴付けプログレッシブ疾患である。これらの遺伝的異常は、低酸素症応答を強調して細胞骨格の細胞周期、細胞死、エネルギー代謝および組立に至るまで多数の細胞プロセスに影響を与えることができる。したがって、腫瘍形成は、生物学的プロセスのスペクトルにわたって複数の遺伝子異常の集団行動を反映している。全ゲノムシーケンシング、exomeシーケンシング、目標とシーケンシング、深いシーケンシングおよびゲノムワイド関連解析を含む最近の統合的なゲノム研究の努力は、腫瘍1-4の本質的にすべてのタイプの小説遺伝子変異の数が増えを同定した。多くの場合、遺伝的病変は、疾患の病因の協力を示唆し、非ランダム様式5-8で一緒に起こる。 Fを生じた異常に発現する遺伝子の大規模な配列の発癌性の役割を解剖ロムこれらのゲノムの病変は、新たな治療戦略を考案すると、これらの薬剤に対する腫瘍細胞の応答を理解する必要があるが、これは困難な作業であることが判明している、 でハイスループット機能ゲノム解析を行うための非常に強固な動物モデル系を必要とする生体内 。 哺乳動物、特にげっ歯類は、癌生物学で好まモデルですが、ゼブラフィッシュは、かなりの注目を集め始めている。硬骨魚ゼブラフィッシュ（ ダリオフィッシュ ） は、1960年代から開発調査のためのモデル生物として使用されており、最初の1982年9-11に腫瘍病因の研究に適用した。メンテナンス、小さなボディサイズ、および高い繁殖力やすさは、ゼブラフィッシュの大規模フォワード遺伝子スクリーニングのための堅牢なモデルは、異常なおよび病理学的表現型10を付与する変異を同定することを可能にする。ゼブラフィッシュの胚の光透過性のように、この癌モデルの普及を支えるもう一つの重要な特徴であるそれは、リアルタイム9にげっ歯類12が比較的困難であるアプリケーションを、腫瘍の発達を見つけるために実施されるin vivoイメージングを可能にする。ゼブラフィッシュリファレンスゲノム（Zv9）の最近の比較ゲノム解析は、71％で82％が男性でのオンラインメンデル遺伝（OMIM）データベース13における疾患関連遺伝子と相関しているのヒトオルソログを有するとともに、26206タンパク質をコードする遺伝子を明らかにし、 14。したがって、ゼブラフィッシュは、神経芽細胞腫8を含むヒトの癌、多様なタイプの、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）15,16、17,18黒色腫、ユーイング肉腫19、横紋筋肉腫20,21、膵臓癌をモデル化するために使用されている22、肝細胞癌23および骨髄性悪性疾患24,25を 、そして異種移植研究11,26用癌モデルとして選択されている。 安定したトランスジェニックゼブラフィッシュにおけるアプローチは、一般的に、機能獲得正常な発生または疾患の病因27,28における遺伝子の影響を研究するために使用される。このようなモデル（ 図1A）を開発するためには、一細胞の野生型胚に組織特異的プロモーターにより駆動される目的の遺伝子を含むDNA構築物を注入する。注入された胚は性的に成熟する際に3〜4ヶ月の注射後、それらは創設者の魚としてそれらをライセンス供与し、それらの生殖細胞、構​​築物のDNAの組込みを示すものをスクリーニングするために、野生型の魚と外部交配されている。そのようなコピー数および導入遺伝子の組み込み部位、などの多くの要因が、安定したトランスジェニック系統における導入遺伝子の発現に影響を​​与える。したがって、トランスジェニック腫瘍モデルを開発するために、単一の癌遺伝子を過剰発現する複数の安定したトランスジェニック系統を最初に生成し、腫瘍誘発につながるかもしれないレベルで導入遺伝子を発現する線についてスクリーニングされなければならない。しかし、候補oの過剰発現ncogene生殖細胞に対して毒性であり、直接導入遺伝子29を過剰発現させることによって、安定したトランスジェニック系統を生成することは困難である。したがって、このアプローチは、適切な癌モデルを生成するために失敗のリスクが高いと、時間がかかること。 ここで、我々は、in vivoでの機能的ゲノム研究のための伝統的な安定した形質転換を介して独自の利点を提供するモザイク一過性遺伝子導入（ 図1B）に基づいて、別の戦略を示している。このアプローチでは、1つ以上の導入遺伝子構築物は、トランスジェニックまたは野生型の胚の1細胞期に注入される。導入遺伝子を含有する注入されたDNA構築物は、個々の魚30内の複数の細胞集団内の混合遺伝子型をもたらし、その後、モザイク状にランダムに一次注入した魚に統合である。また、1細胞胚における複数のDNA構築物の同時注入は、TRAに1を許可する、ランダムな部位での同じ細胞に統合を共同につながる導入遺伝子の発現で細胞をCEとモザイク動物31における疾患の病因の間に異なる遺伝子の相互作用を探る。原理の証明として、我々は一過性に、野生型魚とMYCN過剰発現するトランスジェニック魚のドーパミンベータヒドロキシラーゼ（DのβH）プロモーターの制御下に末梢交感神経系（PSNS）にmCherryをレポーター遺伝子と突然変異的に活性化ALKを（F1174L）過剰発現さ。受容体チロシンキナーゼをコードするALK、高リスク神経芽5-7,32,33において最も頻繁に変異している遺伝子である。ALK（F1174L）は 、活性化変異を最も頻繁に強力な体細胞の一つとして、で過剰表現されMYCN-高リスク神経芽腫患者を増幅し、安定したトランスジェニックマウスおよびトランスジェニックゼブラフィッシュモデル8,34,35の両方で神経芽細胞腫腫瘍形成を加速するMYCNの過剰発現と相乗作用。モザイクによって、MYCN遺伝子導入魚におけるmCherryを持つALK（F1174L）の一過性の過剰発現は、私たちはモザイク遺伝子導入戦略が急速にかつ効率的に使用することができることを示唆し、ALK（F1174L）とMYCNの両方を過剰発現する安定したトランスジェニック魚で観察された腫瘍の発症の加速を再現したin vivoでの腫瘍の開始の複数の癌遺伝子の相対的な貢献を評価する。

<table><tbody><tr><td>Expand Long Template PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>pCR-TOPO vector&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, CA</td><td>451641</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II enzyme&lt;br/&gt; Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;reg; BP Clonase&amp;reg; II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>GC-RICH PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>12 140 306 001</td><td></td></tr><tr><td>Meganuclease I-SceI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon digital sight DS-U1 camera</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

変異により活性化したALKのF1174Lまたは野生型ALKの過剰発現が神経芽誘導にMYCNと共同作業できるかどうかを調べるために、我々はMYCNを過剰発現するトランスジェニック魚のPSNSでのDβHプロモーターの制御下で活性化されたヒトALKまたは野生型ヒトALKのいずれかを過剰発現さ。 ALKF1174LまたはDβH - -以下の構築物、DβHのどちらか<e...

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腫瘍病因における候補協力遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入 |発生生物学 |ビデオ

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

腫瘍の病因に候補協同遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

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11.1K ビュー.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

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Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

がん研究

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

医学

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

発生生物学

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

生物学

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

免疫低下アダルトゼブラフィッシュへの正常および悪性筋細胞移植

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

免疫・感染学

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

エンハンサー配列を評価するためのモザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシス

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

ゼブラフィッシュ幼生の効率的なIn vivo腫瘍研究への活用

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

著者スポットライト:ゼブラフィッシュにおける腫瘍異種移植を用いたがん治療の進歩

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

腫瘍の病因に候補協同遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入

要約

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腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

免疫低下アダルトゼブラフィッシュへの正常および悪性筋細胞移植

エンハンサー配列を評価するためのモザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシス

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法