Name: use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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この作品は、バイオテクノロジー·生物科学研究会議（BBSRC）、王立協会とノッティンガム大学でサポートされています。

MANT標識ヌクレオチドの結合時に蛍光強度変化の1。決定。 <ol><li>適切な反応緩衝液中1μMのキネシン（最終濃度）に1μMのMANT標識ヌクレオチドを​​追加します。通常、微小管の成長と安定に利益をもたらすバッファが（議論を参照）が使用されます。一般的に使用される緩衝液は80mMのピペラジン-ビス-2 -エタンスルホン酸（PIPES）、pH6.9を含有し、1mMのMgCl 2および1mMのエチレングリコールビス2アミノエーテル四酢酸（EGTA）。 注：すべてのプロトコルに記載されたキネシンの濃度は、ヌクレオチド結合部位（ すなわち、モータードメイン）の濃度を意味する。別のキネシンは、単量体、二量体または四量体として存在するので、分子当たり二つ以上のヌクレオチド結合部位を含むことができる。 </li><li>インキュベーション期間（1-3分）後、標準的な蛍光光度計を使用して、マント標識ヌクレオチド、キネシン複合体について発光スペクトルを測定する。 365nmの励起波長を使用し、1nmの増分で400〜500nmの発光を測定する。 </li><li>ステップ1.1で使用したのと同じ反応緩衝液中1mMのMANT標識ヌクレオチドの溶液を作る。 </li><li>前述のように、マントヌクレオチドのみのサンプルについて、発光スペクトルを測定し（ステップ1.2参照）。 </li><li>この値で割ることを通じて（キネシンことなく、 すなわち ）溶液にマントヌクレオチドのスペクトルのピークの蛍光強度の波長の信号にスペクトルを正規化する。 </li><li> （ 例えば、 図2B）は mantATP結合および/ ​​または溶液中mantADP結合キネシンとMANTヌクレオチドの間の蛍光強度の違いを観察するために正規化されたスペクトルをプロットします。 </li></ol> mantATPための会合および解離速度定数の2。測定<ol><li>任意の適切なマグネシウムで最大20μMのキネシン（説明を参照してください）2 +フリー緩衝剤（ 例えば、80ミリメートルPIPES pH6.9、1mMのEGTA、0.1％のTween20）の溶液に、1を追加mMの（最終濃度）エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および1mM（最終濃度）ジチオスレイトール（DTT）。注：バッファへのTween20の添加が推奨され、それが減少するように/バッファー交換に使用したカラムにキネシンタンパク質の損失を防止する（ステップ2.3および3.3） </li><li> 15分間、25℃で溶液をインキュベートする。 </li><li>製造業者の指示に従って重力流G-25セファデックスゲルろ過カラムを用いキネシンとは別の自由ヌクレオチドおよびEDTA（材料のリストを参照）。 <ol><li> （ステップ2.1参照）、適切なマグネシウム2 +のない緩衝の少なくとも3カラム容量でカラムを平衡化する。カラムにキネシンを含む溶液をロードします。塩化マグネシウムの最終濃度はキネシン液の採取後1 mMであるように、空のチューブに100mMの塩化マグネシウム溶液の適切な量を添加することによって収集チューブを準備する。塩化マグネシウムの即時の追加はstabiliに役立ちますヌクレオチドフリーキネシンをSE。 </li><li>適切なマグネシウム2 +フリー緩衝液を用いて、キネシンを溶出。そう、それが迅速に作業することが重要であるとき、ヌクレオチドの自由キネシンは不安定である。氷の上のヌクレオチドの無キネシンを保存し、1〜2時間以内に使用しています。 </li></ol></li><li>中またはヌクレオチドフリーキネシンの製造に先立って、ヌクレオチドフリーキネシンの最終的な解決策として、同じ反応緩衝液中mantATP濃度シリーズを用意。 0.1〜50μM（ステップ2.5および説明を参照）に至るまでの典型的なシリーズとキネシンの利用可能な濃度に応じて必要なmantATPの濃度の範囲を決定します。 </li><li>ヌクレオチドフリーキネシンの濃度シリーズを準備します。 mantATPの各濃度（2.4ステップ）、ヌクレオチドフリーキネシンの濃度はMANT標識ヌクレオチドは、キネシンのヌクレオチド結合部位を介して5から10倍モル過剰であるように準備する必要があります。 </li><li>ストップトFLOに励起波長を設定します365nmでのwの光度とロングパスフィルタを使用して&gt; 400 nmで放射された光を集める。 </li><li>ストップフロー蛍光光度（ 図3Aおよび3B 挿入図 ） を使用して、1（v / v）の比：mantATPの最低濃度から始めて、1ヌクレオチドの無キネシンの適切な濃度のmantATPを混ぜる。注：反応物は混合時に50％に希釈する。混乱を避けるために（ すなわち、3.0 / 1.5μM）前と後の両方の混合ヌクレオチド濃度をメモしておいてください。 </li><li>指数関数プラスマント基（ すなわちの退色を考慮するために一定の負の傾斜のラインにmantATPの各濃度で測定された蛍光強度の変化を取り付け、蛍光を0 .EXP（K OBS .T）+（メートル=。トン+ 0は振幅であるc）は、k個の実測値は、速度定数であり、tは、） 図3Bおよび議論を参照の時間である。これらのフィットから決定するmantATPの各濃度の速度定数（k OBS）。各k個の OBSが会合および解離速度定数（ 図1、K 1およびk -1）の畳み込みである。 </li><li> （ 例えば 、図3C）mantATP濃度に対してk個の OBSをプロットすることによって会合及び解離速度定数をデコンボリューション。勾配とy軸切片を得るために、一次関数（ すなわち、k個の OBS = k 1は [mantATP] + K -1）にこれらのデータを合わせる。勾配は単位M -1 s -1のとmantATPアソシエーション（ 図1で、k 1）についての速度定数を表す。切片は、s -1（考察を参照）の単位を有する解離速度定数（ 図1 で、k -1）を表す。注：この方法はまた、ADPの結合および解離を決定するために適用することができる塩基としてmantADPを使用して速度定数（ 図1で、k -4およびk 4）。 </li></ol> mantADPための解離速度定数（3）測定<ol><li>適切な反応緩衝液中の2μMキネシンの溶液に（ 例えば、80 mMのPIPES pH6.9、1mMのMgCl 2を 、1mMのEGTAは、0.1％のTween20）、50μMのmantADP（最終濃度）を追加します。 </li><li> 30分間25°Cのでインキュベートする。 </li><li> G-25セファデックスカラムを用いて選択された反応緩衝液中にキネシンを交換バッファによって過剰mantADPや他のフリーのヌクレオチドを​​取り外し、製造者の指示に従って（材料のリストを参照してください）​​。キネシンモータードメインは現在、mantADPをロードする必要があります。 </li><li> 365 nmのストップフロー蛍光計で励起波長を設定し、ロングパスフィルタを使用して&gt; 400 nmで放射された光を集める。 </li><li> 50倍以上のモラでmantADP.kinesin複合体（〜1μM）をミックスストップフロー蛍光光度（ 図4Aおよび4B 挿入図 ） を使用して、1（v / v）の比：1の非標識ATPのr個の過剰。 </li><li>マントグループの光退色を考慮するために、単一の指数関数に加えて一定の負の傾斜のラインに時間をかけて観察された蛍光強度の減少（ すなわち、蛍光= 0 .EXP（K OBS .T）+（m.t +フィットc）に示すように、0は振幅であり、k個のOBSは速度定数、tは時間である、 図4Bおよびディスカッション）を参照してください。このフィットから決定のk obsは、sの単位で、ADPの解離の速度定数（ 図1、K 4）-1（説明を参照）。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

ここでは、キネシンのヌクレオチド状態間の遷移の動態の観察と分析のためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて迅速な混合方法ストップフローを利用している。このタイプの方法は、結合およびキネシン9-11,13-16のさまざまな解離ヌクレオチドを研究するために広く使用されてきた。記載されている方法は、リン酸の放出を観察します（ 図1、ステップ3）許可されていません。しかし、ストップフロー蛍光は蛍光強度の変化17に結合するために、リン酸の産生をリンセンシングタンパク質を使用することによって、この移行を観察するために使用することができる。タンパク質に結合した場合、一般的に蛍光強度の増加を呈する小フルオロフォアmethylanthraniloyl（マント）で標識された使用ヌクレオチドを​​、提示される方法。 R上の2 &#39;または3&#39;位のいずれかにコンジュゲートまた、マントのフルオロフォア、ibose、多くの場合、ヌクレオチド9-12の結合、解離または加水分解にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。マント標識ヌクレオチドは、商業的供給源（材料のリストを参照されたい）から容易に入手可能であり、単一異性体8まで精製の ​​際には迅速に再平衡として2 &#39;、3&#39;結合体の混合物として提供される。マント標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド結合および解離の動態を観察することが可能な優れたレポーター分子を作る。 蛍光標識ヌクレオチドの使用が記載されたアッセイのうち読み取りが蛍光強度の実時間変化であることを意味している。これは、試薬の迅速な混合及びその後の反応に伴う蛍光の変化をリアルタイムで観察できるストップフロー蛍光に対するこれらのアッセイに最適です。検出の方法として、混合技術と蛍光としてストップトフローの組み合わせが比較的サンプルエフあるシステムを作り出すficient。たとえば、 図3Cに示すデータを取得することは、0.8が必要- 、精製されたキネシン13の1.0 mgのMCAK、及び図4Bに示すデータを取得するために、精製〜キネシン13 0.3mgの、MCAKを必要とする。フルオロフォアとしてマントの使用の1つの欠点は、それが光退色する傾向があることである。これは、ストップフローにおいて、キネシンの非存在下で、反応緩衝液でマント標識ヌクレオチドの溶液を混合することによってキネシン反応速度から分離して観察することができる。マント基は漂白なるにつれて蛍光強度の遅い減少が観察される。マントグループの光退色を記載されたプロトコルで使用されるタイムスケールの範囲にわたってよく線形関数によって記述される。したがって、光退色のためのデータを修正する簡単な方法は、線形関数（ すなわち 、メートル+ c）のではなく、単一のパラメータによって記述より一般的な平らなベースラインにより記述ベースラインと指数関数にフィットすることである。 mantATPバインディング mantATPの会合および解離速度定数微小管の非存在下におけるキネシンヌクレオチド結合部位に結合したままで（第2節）、ADPを測定する場合、削除する必要があります。これはmantATPの会合および解離（ 図1、ステップ1）は、ADPの解離か ​​ら分離して観察することができます。これを達成するためにキネシンは、ヌクレオチド結合部位（ステップ2.1）上のEDTAの少なくとも50倍過剰とインキュベートする。 EDTAはMgが2 +、ヌクレオチド11の放出をもたらすヌクレオチド結合ポケットから解離させるのMg 2 +イオンを封鎖する。実施することは、2.1のステップしたがって、 - 2.3、それが2 +のMgを含まない緩衝液を使用することが重要です。ヌクレオチドフリーキネシンタンパク質は、遊離ヌクレオチドからおよびEDTAの両方からそれを分離するために交換されるバッファである。この分離、使い捨ての重力流れGEを達成するためにlの濾過カラム（材料のリストを参照）に十分なものであり、シンプルで使い迅速である。ヌクレオチド無料キネシンとmantATPの相互作用は、結合および解離速度定数（ステップ2.8）のデコンボリューションを可能にするためにmantATP濃度（ステップ2.4​​）の範囲で行われる。このタイプの実験の背後にある理論は、1つのウェルがmantATPの最低濃度で始まるこれらの実験を行う際の基準18に記載されている。これは、異なる濃度の間の洗浄ステップの必要性を削除します。これは、おそらくmantATP濃度が増加するにつれて、ストップフロー蛍光光度計の感度を調整する必要がある。 mantATP濃度は常に疑似一次条件下を維持するためにキネシンヌクレオチド結合部位の濃度よりも少なくとも5倍過剰に存在する必要があります。 mantATPの濃度が増加するにつれてしかし、信号の変化が減少キネシンに結合するヌクレオチドの割合として圧倒さになり得る。 Therefo再、キネシンの濃度もmantATPの濃度は、ヌクレオチド結合部位（ステップ2.6）上の10倍モル過剰よりも大きくなることはありませんようにmantATPのそれぞれの新しい濃度​​で増加している。 mantADP解離 mantADPための会合および解離速度定数はmantATP（セクション2）について記載した同じ方法によって決定することができるが。キネシンからのADPの解離を直接mantADP（ステップ3.1〜3.3）を有するヌクレオチド結合部位をプリロードすることによって観察することができるmantADP.kinesin複合体は、非標識ATP（ステップ3.5）を超えると混合される。過剰の非標識ATPはキネシンにmantADPの再結合を防止し、それによって解離反応（ 図1、K 4）mantADPの関連付けから分離して観察することができます。このアッセイにおいて、非標識ATPの濃度は、NUCの少なくとも50倍モル過剰でなければならない結合部位をleotide。このアッセイの背後にある理論は十分にこの直接法は、ステップ2.8に記載されたy軸に外挿より一定の解離速度のため、より正確な値を与える基準18に記載されている。 微小管を含める 記載された方法はまた、微小管の存在下でヌクレオチド結合及び解離の動態を決定するために用いることができる。 図3Bと4Bの下、注射器：微小管は、先行ストップフローでの混合に注射器を含むヌクレオチドに導入される （ 挿入図 ）。この構成では、キネシンは微小管を満たすと同時にヌクレオチドを​​満たす。安定化された微小管は、チューブリン重合体の寿命は、安定化化学物質、のいずれかの使用によって拡張される場合、使用されているような &#39;グアノシン-5などのタキソール、または非加水分解性GTP類似体、など - [（α、β） -methyleno]三リン酸（GMPCPPは、材料のリストを参照してください）​​。これは、液体窒素9,19で何ヶ月も保存することができる微小管を作るためにGMPCPPでチューブリン重合の2つのサイクルを使用することが可能である。あらかじめ準備された微小管の使用は、これらのアッセイを実行する際に実際的な困難を軽減します。アッセイにおける微小管を含めるためには、微小管の安定性に適した反応緩衝液を使用することが重要である。選択のバッファーは80 mMのPIPES pHを6.9、1 mMのMgCl 2および1mMのEGTA（BRB80として知られている）20,21を含む最も一般的に使用されるバッファーでベースPIPES、です。 記載の方法は、キネシンの使用に限定されないが、任意のヌクレオチド結合タンパク質に適合し、適用することができる。例えば、同様の方法は、分子モーター12,22のミオシンファミリーのメンバーのATPターンオーバーサイクルに適用されており、マント標識グアノシンヌクレオチドの使用は、さらに拡張しこのタイプの方法は、タンパク質23,24を加水GTPする。

キネシンは、高度に保存されたモータードメイン1によって特徴付けられるタンパク質のスーパーファミリーである。キネシンモータードメインは、ヌクレオチド依存的に微小管と相互作用する。キネシンファミリーのメンバーは、微小管の動態2,3を制御する非転位微小管の端結合キネシンと微小管に沿っ向かう形で貨物を運ぶトランスロケーションキネシン、、、から関数の範囲を表示します。 キネシンは微小管細胞骨格4-6との相互作用を調節するためにアデノシン-5&#39;-三リン酸（ATP）の売上高を使用しています。 ATP、ADP、ADP.Piあるいは全くヌクレオチドが結合することができます（ 図1）：微小管のためのキネシンモータードメインため、その親和性のコンホメーションは、その塩基の状態に依存します。キネシンの分子メカニズムを理解するために、ATPの代謝回転と微小管の相互作用との関係の理解が必要である。ザ·reforeは、キネシンの分野における主要な目標は、微小管の存在下および非存在下で異なるヌクレオチド状態と、それらの両方の間の遷移の動態の機能的特性を特徴付けることである。 <img alt="図1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> キネシンのための最も簡単なATPターンオーバーサイクル1図は、4つの可能な状態で構成されています。ヌクレオチドフリー（Φ）、ATP結合、ADP.P iは結合型とADP結合 4遷移のそれぞれは、前進することを特徴とすると。逆方向速度定数（k xおよびkはそれぞれ-x）。 ATP代謝回転の化学サイクルが微小管の相互作用の機械的なサイクルに連結されているかを理解するためには、microtubが存在しない場合に速度制限され、ATPターンオーバーサイクルのどの段階を決定する必要がありますその後ulesとサイクルは、微小管の存在によって変化する方法を決定します。最も単純なATPターンオーバーサイクルは4つの個別の化学物質のステップで構成されています（1）ATPが空の部位に結合する（Φは空のサイト、 すなわち、ヌクレオチドのないキネシンを表す）; （2）ATP開裂; （3）リン酸解離、（4）ADP解離（ 図1）。律速段階は完了し、ATPターンオーバーサイクルの速度定数を設定します。そのため、個別の遷移の各測定され、完全なサイクルの速度定数と比較する必要があり律速となるステップを決定する。全体的なATPターンオーバーサイクル速度定数を測定する方法がここに記載されていないが、ここでは参考7に見ることができる、個々の化学工程のための速度定数を決定することができる方法を記載している。塩基加水分解タンパク質のターンオーバーのサイクルで個別の遷移を研究するために利用可能な方法がいくつかあります。ここで紹介する方法はadvantagを取るフルオロフォアmethylanthraniloylで標識されたヌクレオチドの性質のeは、通常、タンパク質8に結合すると蛍光強度の変化を表示するマントと呼ばれる。その小さなサイズは、リボース（ 図2A）に結合されたとき、それは一般にヌクレオチド結合または加水9-12の動態にほとんど又は全く影響を及ぼさない、ことを意味するためマントグループが使用されている。ここでは、キネシンのATPターンオーバーサイクルでヌクレオチド結合および解離の観察を可能にするストップフロー蛍光と併せてマント標識ヌクレオチドの使用を記述するプロトコルを提示する。

<table><tbody><tr><td>2&amp;rsquo;/3&amp;rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&amp;rsquo;triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;/3&amp;rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&amp;rsquo;-diphosphate&amp;nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&amp;nbsp;mM in 100&amp;nbsp;mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. Concentration should be verified by absorption at 260&amp;nbsp;nm (e = 15,400&amp;nbsp;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&amp;nbsp;&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0.5&amp;nbsp;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&amp;nbsp;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td></tr><tr><td>NAP-5 column</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>nonhydrolysable analogue of GTP</td></tr><tr><td>Stopped-flow fluorimeter&amp;nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td>SX20</td><td>A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&amp;nbsp;-&amp;nbsp;100&amp;nbsp;sec to be monitored.</td></tr></tbody></table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

微小管関連モータータンパク質キネシンスーパーファミリーは、両方のは、ATPを加水分解し、微小管を結合し、特徴的なモータードメインを共有しています。キネシンは、ATP売上高のと微小管の相互作用の両方のスーパーファミリー間での違いを表示します。これらの違いは、そのような貨物輸送、微小管滑り、微小管脱重合と微小管の安定化などのさまざまな機能に対して特定のキネシンを調整。キネシンの作用機序を理解するためには、ATP代謝回転の化学サイクルが微小管の相互作用の機械的なサイクルに連結されているかを理解することが重要です。 ATPターンオーバーサイクルを分析するために、1つのアプローチは、サイクル内の個別のステップを可視化する蛍光標識ヌクレオチドを​​利用することである。 ATPターンオーバーサイクルにおける各ヌクレオチドの移行の動力学を決定することは、完全なサイクルの律速段階またはステップを識別することができる。キネシンのためには、律速段階を知ることが重要であるキネシンは、微小管と相互作用する場合、微小管が存在しないことは、このステップは、一般的に数千倍に加速されるように。微小管の非存在下でのサイクルは完全にキネシンのATPターンオーバーサイクルを理解するために、微小管の存在下でのそれと比較する。個別のヌクレオチド転移の動力学は、一般的に手動で、特に微小管の存在下で、反応物質を混合することによって観察するにはあまりにも高速である。そのような速度は数ミリ秒ほど少しの時間スケールで観察することを可能にするストップフロー蛍光光度計など、急速な混合装置は、そのような遷移を監視するために使用することができる。ここでは、ストップトフローによる試薬の迅速な混合は、キネシンのATPターンオーバー周期を分析するために蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて使用​​されるプロトコルを説明する。

マント群の蛍光強度の増加は、典型的には、キネシンにマント標識ヌクレオチドの結合の際に観察される。しかし、このような信号変化の大​​きさは、問題の特定のキネシンに依存する。したがって、動的アッセイに進む前に、蛍光強度変化の存在および大きさの両方を確認するために平衡測定を行うことが有用である。 mantATPとmantADPための代表的な蛍光スペクトルは、溶液中およびキネシン-13との複合体の両方において、MCAKは、 図2Bに示されている。これらのデータは、MCAKに結合するとmantATPとmantADP両方で表示される蛍光強度の増加を強調表示します。キネシンにマントヌクレオチドの結合時の蛍光強度の変化は、ATPとADP（セクション2および3）の両方の結合および解離を報告するために使用される。 MCAKの場合には、蛍光強度の差はmantATP.kinesinとmantADP.kinesinの間で観察され<suP&gt; 9。 図3Aは、ヌクレオチドを含まないキネシンとmantATPを混合した際に発生する反応を示している。キネシン13にmantATPの結合の際に発生する蛍光強度の増加を示す代表的なデータを、MCAKは、 図3Bに示されている。 図3Bに示されるタイプのデータがmantATP濃度の範囲で収集される。 mantATP濃度に対して決定される速度定数（k個の 実測値 ）のプロットは、 図3Cに示されている。線形関数にこれらのデータをフィッティング（ すなわち、k個の OBS = K 1 [mantATP] + K -1）は OBSを （2.8ステップ）kに貢献する速度定数のデコンボリューションすることができます。したがって、会合およびmantATPの解離速度定数（ 図1で、k 1とkの両方の決定を可能にする<eM&gt; -1それぞれ）。 図4Aは、非標識ATPを過剰のmantADP.kinesinを混合した際に発生する反応を示している。 図4Bのデータは、キネシン-13、MCAKから解離によりmantADPのために観察された蛍光強度の減少を示している。指数関数（ステップ3.6）にこのデータをフィッティングすることによりmantADPの解離のための一定の割合が直接決定される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> フルオロフォアmethylanthraniloyl（マント）で標識した図2ヌクレオチドは、ATPターンオーバーサイクルにおける個別のステップを単離するために使用される。リボース上の位置2 &#39;または3&#39;のいずれかにコンジュゲートマントフルオロフォアの位置を示すmantATPの（A）の構造図（B）の溶液（MAXP）におけるmantATPとmantADPための正規化蛍光スペクトルとmantATPキネシンMCAK（MATP + MCAKとMADP + MCAK）との複合体中のd mantADP。 mantATPスペクトルは、溶液中でmantATPための最大の蛍光とmantADPスペクトルに正規化され、溶液中mantADPのために、最大で蛍光に正規化されている。 MCAKと混合マントヌクレオチドのスペクトルは、1分後の混合で収集される。などのプロトコルに記述されている試薬および蛍光光度設定の濃度が1.1および1.2のステップ。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> mantATPの会合速度定数の図3の測定。 （A）図は、ストップフローによって適所ポストミキシング起こる反応を描いた：mantATP（MATP）は、ヌクレオチドのないようにキネシンをバインドします。タンパク質への結合の際にマント基が増加する蛍光強度（B）の蛍光シグナルの変化（黒）MCAK（5 MのνとmantATP（25 M）を混合する際に観察さcleotideフリー）。このデータは、単一指数関数プラスマントフルオロフォアの光退色を占める一定の負の傾き、（説明を参照）の行に（赤点線）適合している挿入図：前ストップフロー蛍光光度に混合するシリンジの内容。ヌクレオチドフリーMCAKとmantATPの反応のために決定され、（C）の速度定数（k個のOBS）は mantATPの濃度に対してプロットした。このプロットは、M -1 sの単位で会合速度定数（ 図1、k は1）である勾配を-1とy切片は解離速度定数である（ 図1 で、k -1）とを有する直鎖領域を有する。秒の単位で-1。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 。mantADPがプリロードキネシンは、非標識ATPの過剰に希 ​​釈されています。mantADPの解離速度定数の図4。測定は、（A）は回路図ストップフローによって適所ポストミキシング起こる反応を描いた。解離しmantADPことによりmantADPアソシエーション（説明を参照）の逆反応を防止し、未標識ATPによって置き換えられている。キネシンMCAKからmantADPの解離の際に観察マント基がタンパク質から解離により減少する。（B）蛍光の減少の蛍光強度。蛍光シグナル（ブラック）（説明を参照してください）​​マント·グループの退色を考慮するために単一指数プラス定数負の傾きの直線に適合（破線赤）です。決定された速度定数はmantADP（図1、kの解離についての速度定数である4） 挿入図 ：ストップフロー蛍光光度に混合する前にシリンジの内容<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

微小管の相互作用のサイクルに結合されたATPターンオーバーのサイクル：キネシンは微小管を有するヌクレオチド依存性相互作用によって特徴付けられる。ここでは、蛍光標識されたヌクレオチドおよびストップフロー蛍光を用いキネシンのATPターンオーバーサイクルにおける個別のヌクレオチド遷移の動態を分析するためのプロトコルを記述している。

キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.5K ビュー.  University of Nottingham. 微小管の相互作用のサイクルに結合されたATPターンオーバーのサイクル：キネシンは微小管を有するヌクレオチド依存性相互作用によって特徴付けられる。ここでは、蛍光標識されたヌクレオチドおよびストップフロー蛍光を用いキネシンのATPターンオーバーサイクルにおける個別のヌクレオチド遷移の動態を分析するためのプロトコルを記述している?...

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A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

生化学

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

工学

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic properties are adapted for the particular function they execute in cells. Myosin 5a processively walks on F-actin to transport melanosomes and vesicles in cells. Conversely, nonmuscle myosin 2b operates as a bipolar filament containing approximately 30 molecules. It moves F-actin of opposite polarity toward the center of the filament, where the myosin molecules work asynchronously to bind actin, impart a power stroke, and dissociate before repeating the cycle. Nonmuscle myosin 2b, along with its other nonmuscle myosin 2 isoforms, has roles that include&#160;cell adhesion, cytokinesis, and tension maintenance. The mechanochemistry of myosins can be studied by performing in vitro motility assays using purified proteins. In the gliding actin filament assay, the myosins are bound to a microscope coverslip surface and translocate fluorescently labeled F-actin, which can be tracked. In the single molecule/ensemble motility assay, however, F-actin is bound to a coverslip and the movement of fluorescently labeled myosin molecules on the F-actin is observed. In this report, the purification of recombinant myosin 5a from Sf9 cells using affinity chromatography is outlined. Following this, we outline two fluorescence microscopy-based assays: the gliding actin filament assay and the inverted motility assay. From these assays, parameters such as actin translocation velocities and single molecule run lengths and velocities can be extracted using the image analysis software. These techniques can also be applied to study the movement of single filaments of the nonmuscle myosin 2 isoforms, discussed herein in the context of nonmuscle myosin 2b. This workflow represents a protocol and a set of quantitative tools that can be used to study the single molecule and ensemble dynamics of nonmuscle myosins.

Presented here is a procedure to express and purify myosin 5a followed by a discussion of its characterization, using both ensemble and single molecule in vitro fluorescence microscopy-based assays, and how these methods can be modified for the characterization of nonmuscle myosin 2b.

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

生物学

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

要約

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低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

TIRF顕微鏡によるインビトロでの架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

要約

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低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

TIRF顕微鏡によるインビトロでの架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化