Name: use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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Diese Arbeit wird von der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC), der Royal Society und der Universität von Nottingham unterstützt.

1. Bestimmung der Fluoreszenzintensität bei der Bindung von Mant-markierten Nucleotide. <ol><li> 1 uM mant-markierte Nukleotid zu 1 uM Kinesin (Endkonzentrationen) in einem geeigneten Reaktionspuffer. Typischerweise ein Puffer, der Mikrotubuli-Wachstum und Stabilität profitiert verwendet wird (siehe Diskussion). Eine häufig verwendete Puffer 80 mM Piperazin-bis-2-ethansulfonsäure (PIPES) enthält pH6.9, 1 mM MgCl 2 und 1 mM Ethylenglykol-bis-2-Aminoether-tetraessigsäure (EGTA). Anmerkung: Die Konzentration von Kinesin in alle Protokolle angegeben, bezieht sich auf die Konzentration der Nukleotid-Bindungsstellen (dh Motordomänen). Verschiedenen Kinesine existieren als Monomere, Dimere oder Tetramere und so können mehr als ein Nukleotid-Bindungsstelle pro Molekül enthalten. </li><li> Nach einer Inkubationszeit (1-3 min) und mit einem Standard-Fluorimeter, messen Sie den Emissionsspektrum für die mant-markiertes Nukleotid-Kinesin-Komplex. Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 365 nm undMaßnahme emittierte Licht von 400 bis 500 nm in 1 nm-Schritten. </li><li> Einen Lösung von 1 mM mant-markierte Nukleotid in der in Schritt 1.1 verwendet gleichen Reaktionspuffer. </li><li> Messung des Emissionsspektrums für die mant Nukleotid nur Probe, wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 1.2). </li><li> Normalisierung der Spektren des Signals bei der Wellenlänge der Spitzenfluoreszenzintensität des Spektrums mant Nucleotid in Lösung (dh ohne Kinesin) von durch Dividieren dieses Wertes. </li><li> Zeichnen Sie die normierten Spektren (zB 2B), um Fluoreszenzintensität Unterschiede zwischen dem mantATP gebundenen und / oder mantADP gebundenen Kinesin und mant Nukleotid in Lösung beobachten. </li></ol> 2. Messung der Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für mantATP <ol><li> Zu einer Lösung von bis zu 20 uM Kinesin (siehe Diskussion) in jeder geeigneten Mg 2 + -freien Puffer (zB 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20), fügen Sie 1mM (Endkonzentration) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM (Endkonzentration) Dithiothreitol (DTT). Hinweis: Die Zugabe von Tween 20 in den Puffer wird empfohlen, da es reduziert / verhindert den Verlust von Kinesin-Protein auf der für Pufferaustausch verwendete Säule (Schritte 2.3 und 3.3) </li><li> Inkubieren der Lösung bei 25 ° C für 15 min. </li><li> Separate kostenlos Nukleotid-und EDTA aus der Kinesin mit einem Schwerkraft G-25 Sephadex Gelfiltrationssäule nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Liste der Materialien). <ol><li> Äquilibrieren die Säule mit mindestens 3 Säulenvolumina eines geeigneten Mg 2 + -freien Puffer (siehe Schritt 2.1). Laden Sie das Kinesin-haltigen Lösung auf die Säule. Vorbereiten einer Sammelröhrchen durch Zugabe eines geeigneten Volumens von 100 mM Magnesiumchlorid-Lösung zu der leeren Hülse, so dass die endgültige Konzentration von Magnesiumchlorid von 1 mm nach dem Sammeln der Kinesin-Lösung. Sofortige Zugabe von Magnesiumchlorid hilft StAbILISE Die Nukleotid-freien Kinesin. </li><li> Eluieren die Kinesin unter Verwendung eines geeigneten Mg 2 + -freien Puffer. Kinesinen instabil sind, wenn sie frei von Nukleotid-so ist es wichtig, schnell zu arbeiten. Bewahren Sie die Nukleotid-freien Kinesin auf Eis und innerhalb von 1-2 Stunden. </li></ol></li><li> Während oder vor der Herstellung von Nukleotid-freien Kinesin, bereiten eine mantATP Konzentrationsreihe in der gleichen Reaktionspuffer als die endgültige Lösung von Nukleotid-freien Kinesin. Bestimmen Sie den Bereich von Konzentrationen der mantATP nach den vorliegenden Konzentration von Kinesin mit einer typischen Serie im Bereich von 0,1 bis 50 um (siehe Schritt 2.5 und Diskussion) erforderlich. </li><li> Bereiten Sie eine Konzentrationsreihe von Nukleotid-freien Kinesin. Für jede Konzentration der mantATP (Schritt 2.4), sollte eine Konzentration von Nukleotid freien Kinesin hergestellt, daß die mant-markierte Nukleotid in 5 bis 10-fachen molaren Überschuß über Kinesin-Nukleotid-Bindungsstellen bestehen. </li><li> Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf der Stopped-flow Fluorimeter bis 365 nm und sammeln emittierten Lichts bei&gt; 400 nm mit einem Langpassfilter. </li><li> Beginnend mit der niedrigsten Konzentration von mantATP, mischen mantATP mit einer geeigneten Konzentration von Nukleotid freien Kinesin in einer 1: 1 v / v-Verhältnis unter Verwendung einer Stopped-Flow-Fluorimeter (3A und 3B Inset). Anmerkung: Die Reaktanten werden 50% beim Mischen verdünnt. Notieren Sie sich die Nukleotid-Konzentration sowohl vor und nach Durchmischung (dh, 3,0 / 1,5 uM), um Verwechslungen zu vermeiden. </li><li> Passen die Veränderung der Fluoreszenzintensität bei jeder Konzentration von mantATP einer Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung gemessen, um Photobleaching der mant-Gruppe ausmachen (dh Fluoreszenz = A 0 .exp (k obs .T) + (m. t + c), wobei A 0 ist die Amplitude, k obs die Geschwindigkeitskonstante und t die Zeit, siehe Abbildung 3B und Diskussion). Aus diesen Anfällen bestimmen einKonstante (k obs) bei jeder Konzentration von mantATP. Jeder k obs ist eine Faltung der Vereinigung und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, K 1 und K -1). </li><li> Entfalten, die Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten durch Auftragen k obs gegen mantATP Konzentration (zB 3C). Passen diese Daten an eine lineare Funktion (dh k obs = k 1 [mantATP] + k-1), um die Steigung und die y-Achsenabschnitt zu erhalten. Die Steigung stellt die Geschwindigkeitskonstante für mantATP Verein (Abbildung 1, k 1) mit den Einheiten M -1 s -1. Der Schnitt stellt die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, k -1) mit Einheiten der s -1 (siehe Diskussion). Hinweis: Diese Vorgehensweise kann auch angewendet werden, um die ADP Assoziation und Dissoziation bestimmenGeschwindigkeitskonstanten (1, k und k -4 4) unter Verwendung mantADP als Nukleotid. </li></ol> 3. Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantADP <ol><li> Zu einer Lösung von 2 uM Kinesin in einem geeigneten Reaktionspuffer (zB 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20) werden 50 uM mantADP (Endkonzentration). </li><li> Inkubieren bei 25 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges mantADP und andere freie Nukleotid durch Puffer Austausch des Kinesin in der gewählten Reaktionspuffer mit einem G-25-Sephadex-Säule (siehe Liste der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Kinesin-Motordomäne sollte nun mit mantADP geladen werden. </li><li> Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf der Stopped-Flow-Fluorimeter bis 365 nm und sammeln emittierten Lichts bei&gt; 400 nm mit einem Langpassfilter. </li><li> Mischen Sie die mantADP.kinesin Komplex (~ 1 uM) mit einem 50-fach oder mehr Molar Überschuss an unmarkiertem ATP in einer 1: 1 v / v-Verhältnis unter Verwendung einer Stopped-Flow-Fluorimeter (4A und 4B Inset). </li><li> Passen die Abnahme der auf eine einzelne Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung für Photobleaching der mant-Gruppe entfallen über die Zeit beobachtet Fluoreszenzintensität (dh Fluoreszenz = A 0 .exp (k obs .T) + (m.t + c), wobei A 0 ist die Amplitude, k obs die Geschwindigkeitskonstante und t die Zeit, siehe Abbildung 4B und Diskussion). Die k obs von dieser Passform bestimmt die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation von ADP (Abbildung 1, K 4) mit Einheiten der s -1 (siehe Diskussion). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Hier stellen wir Protokolle zur Beobachtung und Analyse der Kinetik der Übergänge zwischen den Zuständen für eine Nukleotid-Kinesin. Diese Protokolle nutzen die schnelle Vermischung Stopped-Flow-Methode in Verbindung mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden. Verfahren dieser Art haben ausgiebig genutzt worden Nukleotid-Bindungs ​​und Dissoziation für eine Vielzahl von Kinesinen 9-11,13-16 zu studieren. Die beschriebenen Beobachtung der Phosphatfreisetzung (Abbildung 1, Schritt 3) nicht erlauben Methoden. Jedoch kann Stopped-Flow-Fluoreszenz verwendet wird, um diesen Übergang unter Verwendung eines Phosphat Sensorprotein zu koppeln, die Produktion von Phosphat zu einem Fluoreszenzintensitätsänderung 17 zu beobachten. Die Methoden vorgestellt Verwendung Nukleotide mit kleinen Fluorophor methylanthraniloyl (mant) gekennzeichnet, die in der Regel zeigen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität, wenn an Proteine ​​gebunden. Weiterhin mant Fluorophor konjugiert, wenn entweder die 2 &#39;oder 3&#39;-Position an der Ribose, hat oft eine geringe oder keine Wirkung auf die Bindung, Dissoziation oder Hydrolyse des Nukleotids 9-12. Mant-markierte Nukleotide sind leicht aus kommerziellen Quellen erhältlich (siehe Liste der Materialien) und Mischungen der 2 &#39;und 3&#39;-Konjugat, wie sie schnell wieder ins Gleichgewicht, wenn auf ein einziges Isomer 8 gereinigt ist. Mant-markierte Nukleotide sind ausgezeichnete Reportermolekülen, durch die die Kinetiken der Nukleotid-Bindung und Dissoziation beobachtet werden. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden bedeutet, dass das Auslesen der beschriebenen Tests ist eine Echtzeit-Veränderung der Fluoreszenzintensität. Dies macht diese ideal für Assays Stopped-Flow-Fluoreszenz, die schnelle Vermischung der Reagenzien und Echtzeit-Beobachtung von Veränderungen in der Fluoreszenz mit der anschließenden Reaktion verbunden werden können. Die Kombination der Stopped-Flow als Mischtechnik und Fluoreszenz als Verfahren zur Detektion erzeugt ein System, das relativ Probe efreichend. Um beispielsweise die in Figur 3C gezeigten Daten erwerben erfordert 0,8 bis 1,0 mg gereinigtes Kinesin-13, MCAK, und die in 4B gezeigten Daten erwerben erfordert ~ 0,3 mg gereinigtes Kinesin-13, MCAK. Ein Nachteil der Verwendung von mant als Fluorophor ist, dass sie anfällig für Photobleichung ist. Dies kann getrennt von Kinesin Reaktionskinetik durch Mischen einer Lösung von mant-markierte Nukleotid mit Reaktionspuffer, in Abwesenheit von Kinesin in der Stopped-Flow zu beobachten. Eine langsame Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet, wie die mant-Gruppe wird gebleicht. Über den Bereich der Zeitskalen in den beschriebenen Photobleaching der mant-Gruppe Protokolle verwendet wird, auch durch eine lineare Funktion beschrieben. Daher ist ein einfacher Weg, um Daten für Photobleaching zu korrigieren, um zu einer exponentiellen Funktion mit einer durch eine lineare Funktion (dh mt + c) eher als die gemeinsame Grundlinie flach, durch einen einzigen Parameter beschrieben beschriebenen Grundlinie passen. mantATP verbindlich Bei der Messung von Geschwindigkeitskonstanten für Assoziation und Dissoziation mantATP (Abschnitt 2) die ADP, die mit der Kinesin-Nukleotid-Bindungsstelle in der Abwesenheit von Mikrotubuli verbunden bleibt, müssen entfernt werden. Dies ermöglicht mantATP Assoziation und Dissoziation (Abbildung 1, Schritt 1) isoliert von ADP Dissoziation beobachtet werden. Um dies zu erreichen Kinesin mit mindestens einer 50-fachen Überschuß an EDTA mehr Nukleotid-Bindungsstellen (Schritt 2.1) inkubiert. Die EDTA-Mg 2 +-Ionen maskiert verursacht Mg 2 + aus der Nukleotid-Bindungstasche, die bei der Freisetzung von dem Nukleotid 11 Ergebnisse distanzieren. Deshalb, wenn die Durchführung Schritte 2,1-2,3, ist es wichtig, einen Puffer frei von Mg 2 + zu verwenden. Das Nukleotid-kostenlos-Kinesin-Protein-Puffer ausgetauscht, um sich sowohl aus freien Nukleotid und von EDTA zu trennen. Um diese Trennung, eine Wegwerfgravitationsströmungs ge volll Filtrationssäule ist ausreichend und ist einfach und schnell zu bedienen (siehe Liste der Materialien). Das Zusammenspiel von mantATP mit Nukleotid kostenlos Kinesin wird bei einer Reihe von mantATP Konzentrationen (Schritt 2.4) durchgeführt, um Entfaltung der Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten (Schritt 2.8) zu ermöglichen. Die Theorie hinter Experimente dieser Art ist auch in Bezug 18 beschrieben Bei der Durchführung dieser Experimente mit der niedrigsten Konzentration von mantATP beginnt. Dies beseitigt die Notwendigkeit für die Waschschritte zwischen verschiedenen Konzentrationen. Wird es wahrscheinlich notwendig sein, die Empfindlichkeit der Stopped-Flow-Fluorimeter einzustellen als die mantATP Konzentration erhöht wird. Die mantATP Konzentration muss immer mindestens 5-fachen Überschuß über die Konzentration der Kinesin-Nukleotid-Bindungsstellen auf Pseudo Bedingungen erster Ordnung aufrecht zu erhalten. Da jedoch die Konzentration von mantATP erhöht wird, die Signaländerung kann als Anteil der Nucleotidsequenz, die abnimmt Kinesin bindet überschwemmt zu werden. Therefore wird die Konzentration des Kinesin auch für jedes neue Konzentration mantATP erhöht, so dass die Konzentration des mantATP ist niemals mehr als 10-fachen molaren Überschuß über Nukleotid-Bindungsstellen (Schritt 2.6). mantADP Dissoziation Obwohl Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für mantADP kann durch das gleiche für mantATP (Abschnitt 2) beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Dissoziation von ADP aus einem Kinesin kann direkt durch Vorspannen der Nukleotid-Bindungsstelle mit mantADP (Schritte 3.1-3.3) Die mantADP.kinesin Komplex wird dann mit einem Überschuss von unmarkiertem ATP (Schritt 3.5) gemischt beobachtet werden. Der Überschuss unmarkierten ATP verhindert erneute Bindung von mantADP auf die Kinesin und ermöglicht die Spaltungsreaktion (Abbildung 1, K 4) isoliert von Verband der mantADP beobachtet werden, wodurch. In diesem Assay wird die Konzentration von unmarkiertem ATP mindestens einem 50-fachen molaren Überschuß von Nuk seinleotide Bindungsstellen. Die Theorie hinter diesem Test ist gut in Bezug 18 beschrieben Diese direkte Methode gibt einen genaueren Wert für die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante als die Hochrechnung auf das in Schritt 2.8 beschrieben y-Achse. Einbeziehung der Mikrotubuli Die beschriebenen Verfahren können auch verwendet werden, um die Kinetik der Nukleotid-Bindungs ​​und Dissoziation in Gegenwart von Mikrotubuli zu bestimmen. Mikrotubuli sind an das Nukleotid enthaltenden Spritze vor dem Mischen in der Stopped-Flow eingeführt: die untere Spritze in 3B und 4B (Einlagen). In dieser Konfiguration wird die Kinesin die Nukleotidsequenz gleichzeitig erfüllen, da sie die Mikrotubuli erfüllt. Mikrotubuli stabilisiert werden verwendet, wo die Lebensdauer des Tubulin-Polymer durch die Verwendung entweder einer chemischen Stabilisierung, verlängert, wie Taxol oder einem nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon, wie Guanosin-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] Triphosphat (GMPCPP, siehe Liste der Materialien). Es ist möglich, zwei Zyklen der Tubulin-Polymerisation mit GMPCPP verwenden, um Mikrotubuli, für viele Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden 9,19 tätigen. Die Verwendung von vorgefertigten Mikrotubuli reduziert deutlich die praktischen Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Tests. Mikrotubuli in den Assays schließen, ist es wichtig, einen Reaktionspuffer für die Mikrotubuli Stabilität zu verwenden. Der Puffer der Wahl ist PIPES basiert, mit dem am häufigsten verwendeten Puffer, der 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl 2 und 1 mM EGTA (als BRB80 bekannt) 20,21. Die beschriebenen Verfahren sind nicht darauf beschränkt, mit Kinesin, sondern kann angepasst und einem Nukleotid-Bindungsprotein verwendet werden. Zum Beispiel wurden ähnliche Verfahren wie die ATP Umsatz Zyklus von Mitgliedern der Familie von Myosin molekularen Motoren 12,22 und die Verwendung von markierten mant Guanosinnukleotiden erstreckt sich weiter angewendetVerfahren dieser Art GTP hydrolysierende Proteine ​​23,24.

Die Kinesin-Superfamilie sind für Proteine, die durch eine stark konservierte Motordomäne 1. Die Kinesin Motordomäne in Wechselwirkung mit Mikrotubuli in einer Nukleotid-abhängige Weise. Mitglieder der Kinesin-Familie zeigen eine Reihe von Funktionen aus translozierenden Kinesinen, die Fracht in einem gerichteten Art und Weise entlang von Mikrotubuli zu tragen, nicht-Translokation Mikrotubuli-bindenden Ende Kinesinen, die die Dynamik der Mikrotubuli 2,3 regulieren. Kinesinen verwenden Sie den Umsatz von adensosine-5&#39;-Triphosphat (ATP), um ihre Interaktion mit dem Mikrotubuli-Zytoskelett 4-6 regulieren. Die Konformation des Kinesin-Motordomäne und somit seine Affinität für Mikrotubuli hängt von ihrer Nukleotid Zustand: ATP, ADP kann, ADP.Pi oder keine Nucleotid gebunden werden (Abbildung 1). Den molekularen Mechanismus eines Kinesin verstehen, ist ein Verständnis der Beziehung zwischen der ATP-Umsatz und die Mikrotubuli-Wechselwirkung erforderlich sind. DieDaher liegt ein Hauptziel in der Kinesin-Feld, um die funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Nukleotid Zustände und die Kinetik der Übergänge zwischen diesen beiden in der Gegenwart und Abwesenheit von Mikrotubuli zu charakterisieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Die einfachste ATP Umsatz Zyklus für eine Kinesin besteht aus vier möglichen Zuständen: Nukleotid-freie (Φ), ATP-gebundenen ADP.P i -gebundenen und ADP-gebundenen Jeder der vier Übergänge von einem vorderen und charakterisiert. Rückwärtsgeschwindigkeitskonstante (k x und k x beziehungsweise). Um zu verstehen, wie sich die chemische Zyklus der ATP Umsatz der mechanischen Kreislauf der Mikrotubuli-Interaktion gekoppelt, muss man die Stufe in der ATP-Umsatz Zyklus zu bestimmen, ist Ratenbegrenzung in der Abwesenheit von microtubModule und dann bestimmen, wie der Zyklus wird durch die Anwesenheit von Mikrotubuli verändert. Die einfachste ATP Umsatz-Zyklus besteht aus vier einzelnen Chemikalien Schritten: (1) ATP-Bindung an die leere Stelle (Φ bezeichnet das leere Seite, dh, Nukleotid-freien Kinesin); (2) ATP-Spaltung; (3) phosphat Dissoziation und (4) ADP-Dissoziation (Abbildung 1). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt setzt die Geschwindigkeitskonstante für die komplette ATP Umsatz-Zyklus. Deshalb, um zu bestimmen, welche geschwindigkeitsbestimmende Schritt jedes der einzelnen Übergänge müssen gemessen und verglichen, um die Geschwindigkeitskonstante für den gesamten Zyklus ist. Methoden, um die Gesamt ATP Umsatz Taktrate konstant werden hier nicht beschrieben zu messen, kann aber in Bezug 7. hier gefunden werden, beschreiben wir Methoden, mit denen Geschwindigkeitskonstanten für einzelne chemische Schritte bestimmt werden kann. Es gibt eine Reihe von Verfahren zur Verfügung, um individuelle Übergänge in dem Umschlagszyklus eines Nukleotids hydrolysierende Protein zu untersuchen. Die hier vorgestellten Methoden nehmen Advantage der Eigenschaften der Nucleotide mit dem Fluorophor markierten methylanthraniloyl, die üblicherweise als mant, die eine Änderung in der Fluoreszenzintensität nach der Bindung an Protein 8 Anzeige bezeichnet. Mant der Gruppe verwendet wird, da seine geringe Größe bedeutet, dass, wenn sie auf die Ribose (2A) gekoppelt ist, hat es im allgemeinen wenig oder keine Wirkung auf die Kinetik der Nukleotid-Bindungs ​​oder Hydrolyse 9-12. Hier stellen wir Protokolle beschreiben die Verwendung von mant-markierten Nukleotiden in Verbindung mit der Stopped-Flow-Fluoreszenz, um die Beobachtung der Bindung und Dissoziation Nukleotidsequenz der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>2&amp;rsquo;/3&amp;rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&amp;rsquo;triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;/3&amp;rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&amp;rsquo;-diphosphate&amp;nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&amp;nbsp;mM in 100&amp;nbsp;mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. Concentration should be verified by absorption at 260&amp;nbsp;nm (e = 15,400&amp;nbsp;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&amp;nbsp;&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0.5&amp;nbsp;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&amp;nbsp;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td></tr><tr><td>NAP-5 column</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>nonhydrolysable analogue of GTP</td></tr><tr><td>Stopped-flow fluorimeter&amp;nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td>SX20</td><td>A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&amp;nbsp;-&amp;nbsp;100&amp;nbsp;sec to be monitored.</td></tr></tbody></table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

Die Kinesin-Superfamilie der Mikrotubuli-assoziierten Motorproteine ​​teilen einen charakteristischen Motordomäne, die sowohl hydrolysiert ATP und bindet Mikrotubuli. Kinesinen anzuzeigen Unterschiede innerhalb der Superfamilie sowohl in Umsatz und ATP in Mikrotubuli-Interaktion. Diese Unterschiede anpassen spezifischen Kinesinen, um verschiedene Funktionen wie Luftfrachtbeförderung, Mikrotubuli-Gleiten, Mikrotubuli-Depolymerisation und Stabilisierung von Mikrotubuli. Um den Mechanismus der Wirkung eines Kinesin verstehen, ist es wichtig zu verstehen, wie der chemischen Zyklus der ATP Umsatz der mechanischen Zyklus der Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Um den ATP Umsatz-Zyklus zu sezieren, ist ein Ansatz, um fluoreszenzmarkierte Nukleotide zu nutzen, um einzelne Schritte des Zyklus zu visualisieren. Bestimmung der Kinetik der Übergang jedes Nukleotid in der ATP-Umsatz Zyklus ermöglicht die geschwindigkeitsbestimmende Schritt oder Schritte zur vollständigen Zyklus zu identifizieren. Für Kinesin, ist es wichtig, den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt zu kennen,die Abwesenheit von Mikrotubuli, da dieser Schritt im allgemeinen beschleunigt mehrere Tausendfache, wenn das Kinesin Wechselwirkung mit Mikrotubuli. Der Zyklus in Abwesenheit von Mikrotubuli wird dann zu der in Gegenwart von Mikrotubuli zu einer Kinesin ATP Umsatz Zyklus verstehen verglichen. Die Kinetik der einzelnen Nucleotid-Übergänge sind in der Regel zu hoch, um durch manuelles Mischen von Reaktanten, insbesondere in Anwesenheit von Mikrotubuli zu beobachten. Eine schnelle Mischvorrichtung, wie einer Stopped-Flow-Fluorimeter, die Kinetik auf Zeitskalen von nur wenigen Millisekunden beobachtet werden kann, kann verwendet werden, um solche Übergänge zu beobachten. Hier beschreiben wir Protokolle, in denen eine schnelle Vermischung der Reagenzien durch stopped-flow in Verbindung mit Fluoreszenz-markierten Nukleotiden verwendet werden, um die ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin sezieren.

Ein Anstieg der Fluoreszenzintensität des mant Gruppe wird typischerweise bei Bindung mant-markierten Nukleotids zu einer Kinesin beobachtet. Jedoch ist das Ausmaß einer solchen Signaländerung abhängig von der jeweiligen Kinesin in Frage. Daher ist es sinnvoll, Gleichgewichtsmessungen durchzuführen, um sowohl das Vorhandensein und das Ausmaß einer Änderung der Fluoreszenzintensität vor voran kinetische Assays bestätigen. Repräsentative Fluoreszenzspektren für mantATP und mantADP, sowohl in Lösung als auch im Komplex mit der Kinesin-13, MCAK, sind in 2B gezeigt. Diese Daten unterstreichen die Fluoreszenzintensität Anstieg sowohl mantATP und mantADP bei der Bindung an MCAK angezeigt. Die Veränderung der Fluoreszenzintensität bei der Bindung von mant Nukleotid zu einem Kinesin wird verwendet, um über die Assoziation und Dissoziation von ATP und ADP-Bericht (Abschnitte 2 und 3). Im Fall von MCAK wird ein Fluoreszenzintensitätsdifferenz zwischen mantATP.kinesin und mantADP.kinesin beobachtet <sup&gt; 9. 3A zeigt die Reaktion, die beim Mischen mit mantATP Nukleotid-freien Kinesin auftritt. Repräsentative Daten, die die Erhöhung der Fluoreszenzintensität, die bei der Bindung an die mantATP Kinesin-13 auftritt, wird MCAK in 3B gezeigt. Daten des Typs in 3B gezeigt wird in einem Bereich von Konzentrationen mantATP gesammelt. Ein Plot der Geschwindigkeitskonstanten (k obs) ermittelt gegen die mantATP Konzentration ist in 3C gezeigt. Montage dieser Daten an eine lineare Funktion (dh k obs = k 1 [mantATP] + k-1) können Dekonvolution der Geschwindigkeitskonstanten, die obs (Schritt 2.8) k beitragen. Deshalb, so dass die Bestimmung sowohl des Vereins und der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantATP (Abbildung 1, K 1 und K <em&gt; -1 beziehungsweise). 4A zeigt die Reaktion, die beim Mischen mantADP.kinesin mit einem Überschuß von unmarkiertem ATP stattfindet. Die Daten in Abbildung 4B zeigt die für mantADP bei der Dissoziation von Kinesin-13, MCAK beobachtete Abnahme der Fluoreszenzintensität. Durch den Einbau dieser Daten an einer e-Funktion (Schritt 3.6) die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation von mantADP direkt bestimmt wird. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Die Nukleotide mit dem Fluorophor methylanthraniloyl (mant) markiert werden verwendet, um einzelne Schritte in der ATP-Umsatz-Zyklus zu isolieren. (A) Struktur des mantATP, die die Position des Fluorophors mant entweder die 2 &#39;oder 3&#39; Position der Ribose gebunden ist. (B) Normalisierte Fluoreszenzspektren für mantATP und mantADP in Lösung (MaxP) und eine mantATPd mantADP im Komplex mit dem Kinesin MCAK (MATP + MCAK und MADP + MCAK). Die mantATP Spektren normiert auf die Fluoreszenz bei max für mantATP in Lösung und der mantADP Spektren normiert auf max für mantADP in Lösung Fluoreszenz. Die Spektren der mant Nukleotide mit MCAK vermischt werden zu 1 min nach dem Mischen gesammelt. Die Konzentration von Reagenzien und Fluorimeter Einstellungen werden als in Protokoll beschriebenen Schritte 1.1 und 1.2. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Die Messung der Assoziationsgeschwindigkeitskonstante von mantATP. (A) Schematische Darstellung der Reaktion, die Stelle nach Mischen durch Stopped-Flow nimmt: mantATP (MATP) bindet an Nukleotid-freien Kinesin. Die Fluoreszenzintensität bei der Bindung an das Protein die mant-Gruppe steigt. (B) Fluoreszenzsignaländerung (schwarz) beim Mischen mantATP (25 M) mit MCAK (5 M nu beobachtettid-frei,). Diese Daten sind fit (rot gestrichelt) auf eine einzige Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung, die für die Photobleaching der mant Fluorophor-Konten (siehe Diskussion). Einschub: Inhalt der Spritzen vor dem Mischen auf der Stopped-Flow-Fluorimeter. (C) Geschwindigkeitskonstanten (k obs) für die Reaktion von mantATP mit Nukleotid-freien MCAK bestimmt aufgetragen gegen die Konzentration von mantATP. Dieses Grundstück wird eine lineare Region mit der Gradient der Assoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, K 1) mit Einheiten der M -1 s -1 und die y-Achse als die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, k -1) haben Einheiten von s -1. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> . Abbildung 4. Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantADP (A) Schematische Darstellung der Reaktion, die Stelle nach Mischen durch Stopped-Flow nimmt: Kinesin mit mantADP vorgespannt ist in einen Überschuss von unmarkiertem ATP verdünnt. Distanziert mantADP durch unmarkierte ATP ersetzt, wodurch die Rückreaktion von mantADP Verein (siehe Diskussion) zu verhindern. Die Intensität der Fluoreszenz des mant-Gruppe nimmt bei der Dissoziation aus dem Protein. Nach der Dissoziation von mantADP vom Kinesin MCAK beobachtet (B) Fluoreszenzabnahme. Das Fluoreszenzsignal (schwarz) ist fit (rot gestrichelt) zu einem einzigen exponentiellen zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung für Photobleaching der mant-Gruppe (siehe Diskussion) zu berücksichtigen. Die Geschwindigkeitskonstante bestimmt ist, die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation mantADP (1, k4). Einschub:. Inhalt der Spritzen vor dem Mischen auf einem Stopped-Flow-Fluorimeter <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Kinesine von Nukleotid-abhängige Wechselwirkung mit Mikrotubuli aus: ein Zyklus von ATP Umsatz zu einem Zyklus von Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Hier beschreiben wir Protokolle, die Kinetik der einzelnen Nukleotid-Übergänge in der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden und Stopped-Flow-Fluoreszenz analysiert.

Verwendung von Stopped-Flow-Fluoreszenz und markierte Nukleotide ATP, um die Umsatz-Zyklus von Kinesine Analysieren

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.5K Aufrufe.  University of Nottingham.  Kinesine von Nukleotid-abhängige Wechselwirkung mit Mikrotubuli aus: ein Zyklus von ATP Umsatz zu einem Zyklus von Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Hier beschreiben wir Protokolle, die Kinetik der einzelnen Nukleotid-Übergänge in der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden und Stopped-Flow-Fluoreszenz analysiert. 

Serie: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Forschung

Biochemie

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Ingenieurwesen

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic properties are adapted for the particular function they execute in cells. Myosin 5a processively walks on F-actin to transport melanosomes and vesicles in cells. Conversely, nonmuscle myosin 2b operates as a bipolar filament containing approximately 30 molecules. It moves F-actin of opposite polarity toward the center of the filament, where the myosin molecules work asynchronously to bind actin, impart a power stroke, and dissociate before repeating the cycle. Nonmuscle myosin 2b, along with its other nonmuscle myosin 2 isoforms, has roles that include&#160;cell adhesion, cytokinesis, and tension maintenance. The mechanochemistry of myosins can be studied by performing in vitro motility assays using purified proteins. In the gliding actin filament assay, the myosins are bound to a microscope coverslip surface and translocate fluorescently labeled F-actin, which can be tracked. In the single molecule/ensemble motility assay, however, F-actin is bound to a coverslip and the movement of fluorescently labeled myosin molecules on the F-actin is observed. In this report, the purification of recombinant myosin 5a from Sf9 cells using affinity chromatography is outlined. Following this, we outline two fluorescence microscopy-based assays: the gliding actin filament assay and the inverted motility assay. From these assays, parameters such as actin translocation velocities and single molecule run lengths and velocities can be extracted using the image analysis software. These techniques can also be applied to study the movement of single filaments of the nonmuscle myosin 2 isoforms, discussed herein in the context of nonmuscle myosin 2b. This workflow represents a protocol and a set of quantitative tools that can be used to study the single molecule and ensemble dynamics of nonmuscle myosins.

Presented here is a procedure to express and purify myosin 5a followed by a discussion of its characterization, using both ensemble and single molecule in vitro fluorescence microscopy-based assays, and how these methods can be modified for the characterization of nonmuscle myosin 2b.

Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Biologie

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...