著者は、この研究を支援するため、NIHから次の助成認めることを望む：K08DK082783（AR）、P30DK56465（BTS）、U01HL099993（BTS）、T32HL00715036（SKS）、およびK12HL0806406（SKS）を。とJPマッカーシー財団（AR）。

フレッド·ハッチンソンがん研究センターの治験審査ボードと子どもの &quot;sフィラデルフィアの病院で承認され、インフォームドコンセントを書かれ、末梢血サンプルを採取する前に、患者から得られた。すべての施設のガイドラインが観察された。MEF生成を含む全ての動物実験と奇形腫形成は施設内動物管理使用委員会によって承認された。 PBMCおよび赤芽球の拡大1.フィコール分離 - 0日<ol><li>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で1：末梢血1に希釈する。 15ミリリットル丸底ポリスチレンチューブでは、慎重に室温フィコール - ハイパックの3ミリリットルに希釈した血液7mlのレイヤ。 </li><li> 30分間400×gでサンプルを遠心。 </li><li> PBMCをプラズマと曇った白色層として見フィコール - ハイパックとの間のインタフェースに定住しているでしょう。滅菌したトランスファーピペットを使用して、PBを収集1 15ミリリットルコニカルチューブにMCを。 DPBSを用いて10 mlにボリュームを持参してください。 </li><li>血球計を使用して、PBMCをカウント。 </li><li>ピペットで5分間300×gで別々の15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に2×10 6のPBMC。 90％ウシ胎児血清（FBS）/ 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）中で2×10 6のPBMC / mlの濃度で残存する細胞凍結スピンダウンする。 </li><li> QBSF 60無血清培地（光から保護）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+アスコルビン酸（50 ng / ml）を+細胞因子（SCF、50 ng / ml）を+インターロイキン3（IL-幹：増殖培地を準備3、10 ng / ml）を+エリスロポエチン（EPO、2 U / ml）を+インスリン様成長因子1（IGF-1、40 ng / ml）を+デキサメタゾン（1μM、光から保護し、新鮮なアリコートを解凍し、各メディア変化する）。 </li><li>作りたての拡張培地2mlおよび再懸濁2×10 6 PBMCを12ウェル組織培養プレートの1ウェルに置き、5の雰囲気を37℃の加湿インキュベーター中でインキュベート％O 2、5％CO 2、90％N 2。 </li><li> 3日目と6日目に、培地を交換してください。 <ol><li>細胞を回収し、残りの細胞を収集するためにQBSF-60の2ミリリットルとよく洗う。 </li><li> 5分間300×gで細胞懸濁液を遠心し、上清を吸引除去する。 </li><li>新しい増殖培地2mlに細胞を再懸濁し、同じ12ウェルプレートに戻す。 </li></ol></li></ol>ヌクレオ2.リプログラミング細胞 - 9日目<ol><li>滅菌した1.5mlのエッペンドルフチューブ（ 表1）に再プログラミングプラスミドをピペット。 </li><li>滅菌1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに補足（メーカーにより供給）とピペットでヌクレオソリューションを混ぜる。 </li><li>ピペット2加湿37℃インキュベーター中で12ウェルプレートの場所の1つのウェルに増殖培地（5％O 2、5％CO 2および90％N 2）の前に細胞を添加する平衡化のための溶液。 </li><li>集める培養した細胞と、残りの細胞を収集するためにQBSF-60の2ミリリットルとよく洗う。 </li><li> 5分間300×gで細胞を遠心し、上清を吸引除去する。 </li><li> DPBS 5mlに再懸濁し、5分間300×gで遠心分離して細胞を洗浄する。 </li><li>上清を吸引除去する。 </li><li>生成気泡を避けるように注意しながら、クレオ液+サプリメント100μlの細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 、リプログラミングプラスミドを含有するチューブに細胞懸濁液をピペットピペット上下回、およびヌクレオキュベットの底にサンプルをピペット。 </li><li>クレオマシンにキュベットを配置し、プログラムのT-019を実行します。 </li><li>クレオキュベットに（ステップ2.3で平衡化プレートから）予め温め拡大培地100μlを移す。 </li><li>すぐに予め温め増殖培地のウェルにサンプル全体と預金を集める。白、フローティング死んだ細胞の破片を集めることは避けてください。 </li&gt; <li>成長のために加湿した37℃インキュベーター（5％O 2、5％CO 2、90％N 2）にプレートを置き。 </li></ol> 3.メッキフィーダー細胞 - 10日または11 <ol><li> 10日目に、プレートフィーダー細胞。 <ol><li>ゼラチンコート1 6ウェル組織培養プレート。 <ol><li>プレートの各ウェル中にハンクス緩衝生理食塩溶液（HBSS）中の0.1％ゼラチンのピペットから1m </li><li>少なくとも5分間、加湿した37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 </li><li>使用直前に、プレートからゼラチン溶液を吸引する。 </li></ol></li><li>予め温めMEF培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ FBS（10％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％））の10ミリリットルに3000 cGyをで照射し、2×10 6マウス胚線維芽細胞の1バイアルを解凍する。 </li><li> 5分間300×gで細胞を遠心し、上清を吸引除去する。 12 MEF培地mlのピペット2mlに細胞を再懸濁Iゼラチンコート6ウェルプレートの各ウェルNtoの。 12日目まで、加湿した37℃インキュベーター（5％O 2、5％CO 2、90％N 2）にプレートを置き。 </li></ol></li></ol> 4.フィーダー細胞上で細胞をプレーティングし、培地を交換 - 12日目<ol><li> 1 15ミリリットルコニカルチューブにヌクレオフェクト細胞を収集し、QBSF-60の2ミリリットルとよく洗浄することにより、残った細胞を収集します。 5分間300×gでサンプルを遠心。 </li><li>準備再プログラミング中：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）+ FBS（10％）+非動物L-グルタミン（1mM）を+非必須アミノ酸（NEAA、1％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+β β-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）+塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、摂食、10ng / mlの新鮮な追加）+アスコルビン酸（摂食、50μg/ mlの新鮮な追加された）。 </li><li>上清を吸引し、リプログラミング培地12ミリリットルで細胞を懸濁します。細胞懸濁液をウェルあたりピペットを2mlにフィーダー細胞の6ウェルプレート（セクション3で調製した）。室温で30分間、50×gでプレートを遠心する。 </li><li>成長のために加湿した37℃インキュベーター（5％O 2、5％CO 2、90％N 2）にプレートを置き。 IPSCコロニーは（1-2週間）に出現し始めるまで、一日おきにリプログラミングミディアムに変更します。 </li><li>準備したhESC培地：DMEM / F12 1：1 +ノックアウト血清代替（20％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+ NEAA（1％）+非動物L-グルタミン（1mM）を+ピルビン酸ナトリウム（1％） +炭酸水素ナトリウム（0.12％）+βメルカプトエタノール（0.1 mM）の+のbFGF（給餌、10ng / mlの新鮮な追加） </li><li> HDAC阻害剤を準備します（給餌で​​新鮮な追加、100μM）酪酸ナトリウム、suberanilohydroxamic酸（SAHAは、200 nMの、給餌で新鮮な追加された）。 IPSCコロニーが出現したら、毎日培地を交換、hESCの培地+ HDAC阻害剤で細胞を供給し始める。 NOTE：ナトリウム酪酸プラスチックチューブに吸着する小分子であり、tはherefore 4℃でホウケイ酸ガラス管に入れて保管してください。 </li></ol> 5.切り分けIPSCクローン<ol><li> IPSCのコロニー（20-25細胞）を単離するのに十分な大きさになったら、P20ピペットでそれらを選ぶ。 </li><li> HDAC阻害剤の準備：酪酸ナトリウム（給餌、100μMで新鮮な追加された）を、SAHAは（摂食、200 nmで新鮮な追加） </li><li>のhESC培地+ HDAC阻害剤+クローニングとリカバリサプリメントを含む個々の35mm皿でiMEFs上に分離したコロニーを置きます。 </li><li>コロニーをピッキングした翌日には、ヒトES細胞培地+ HDAC阻害剤に培地を変更します。 </li><li> IPSCコロニーは継代のために準備が整うまで、毎日培地を変更してください。 </li><li>コロニーが継代2-3で安定いったん媒体からHDAC阻害剤を除去します。 </li></ol>

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	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Koche, R. 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L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells.">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li><li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells.">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes.">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li><li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines.">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li><li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector.">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li><li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines.">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li><li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors:+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs.">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

このプロトコルを使用するときに成功したIPSCの生成のために、考慮すべきいくつかの重要な注意事項があります。偏差が目標前駆細胞集団の非効率的な刺激およびIPSCの生成の低い効率につながる可能性がある赤芽球の膨張段階で、培地交換スケジュールは厳密に従わなければならない。各培地交換新鮮デキサメタゾンで新しい増殖培地を作ることが重要である。そしてQBSF-60基本培地およびデキサメタゾンは、貯蔵中に光から保護されるべきである。ヌクレオ中、DPBS洗浄は広範な細胞死を生じる、アークヌクレオから電流が発生することがあり、細胞懸濁液から過剰の溶質を除去することが重要である。約10日後にヌクレオ、プレートはIPSCコロニーの外観のために毎日検査しなければならない。いくつかの小さなコロニーが存在していると、リプログラミング培地はprolongeとして（HDAC阻害剤で）のhESC中]に変更する必要があります血清に対するdの曝露は、自発的な分化を誘導することができる。 実験用のセットアップおよび使用可能なリソースに応じて、プロトコルへの変更が考えられる。低酸素状態は、IPSCの生成13の効率を高めることが示されているので、我々は、低O 2インキュベーターを好む。しかし、我々は、5％CO 2で正常酸素条件を用いて末梢血からiPS細胞を生成する成功を収めている。したがって、標準的な加湿CO 2インキュベーターを使用することもできる。このプロトコルで使用されたMEFは、生命科学のベンダーから購入することができる。しかし、商業バッチの変動のために、我々は、MEFの分離、文化、照射14の公表プロトコルに従って、CF-1マウスからiMEFsを生成することを好む。エピジェネティックなリモデリングは細胞の再プログラミング9,15の重要な側面であるようなHDAC阻害剤の包含は、このプロトコルの好ましい態様である。 HDAC阻害剤は、FULのしかし数を省略することができるLyはIPSCコロニーが削減される再プログラム。最後に、不要追加の修飾を有する骨髄サンプルをこの方法を用いてiPS細胞を生成した。 要約すると、このプロトコルは、ランダムな宿主ゲノムへの挿入および組換えウイルスの取り扱いに関する安全性の問題を含む組込みベクター、とIPSC世代の欠点のいくつかを回避するプラスミドベースのリプログラミングシステムを使用しています。プラスミドの生成と比較した場合、さらに、小規模のウイルス産生および特徴付けは比較的労働集約的である。品質のプラスミドのいずれかの大規模生産が経時的一貫IPSCの生成をもたらすことができるが、再プログラミング効率はまた、原因ウイルス産生に固有のバッチの変動に大きく変化することができる。 HDAC阻害剤と組み合わせることで、このプロトコルは、無料の統合を生成し、幹細胞研究のための無料のiPS細胞をフットプリント、効率的な方法を提供しています。

iPS細胞は、多能性遺伝子の最小限のセットの異所性発現を介して細胞組織から誘導される。この技術は、最初に非常に多能性状態1で表現されるOCT4、SOX2、KLF4、およびcMYCはヒト線維芽細胞のレトロウイルス形質導入によって実証された。これらの一時的に発現「再プログラミング因子」は、ヒト胚性幹細胞2に、標的細胞のエピジェネティックな風景や遺伝子発現プロファイルが類似して変更する。作成後は、性IPSCは、潜在的に、さらなる調査のための任意の組織型に分化させることができる。したがって、それらは、再生医療、疾患モデル、および遺伝子治療用途において使用するための有望。しかし、統合ウイルスのゲノムを破壊することは、内因性遺伝子発現、細胞の表現型の影響を変化させる可能性があり、最終的に科学的な結果にバイアスをかける。さらに、ランダムウイルス統合は有害な携帯電子につながる可能性悪性形質転換3または発癌導入遺伝子4の再発現の可能含めffects、。将来の臨床応用は、非組み込みIPSCの生成が必要になります。 染色体外環状DNA分子であるエピソーム、効果的なコストを発生させるための戦略を提供し、統合のないiPS細胞5。 表1に示したエピソームベクターの組み合わせは、再プログラミングは、OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、およびLIN28A因子発現する。 pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-Fプラスミドは、細胞リプログラミング6を強化するため、TP53の一時的な抑制のためのp53 shRNAを含まれています。複製欠損pCXWB-EBNA1ベクターは、EBNA1式 7の一過性の増加を提供することで、初期化因子の増幅および増加初期化の効率を促進する。 pCXLE_EGFPプラスミドはDETEの目的のためにヌクレオ混合物に加えることができるトランスフェクション効率をrminingまたはセルソーティングアプリケーションに最適です。 p個のCXWB-EBNA1を除いて、このプロトコルで使用されるエピソームプラスミドは、宿主細胞の分裂8中エピソームの複製およびパーティションを媒介する、ウイルス複製およびEBNA1遺伝子のエプスタイン-バーウイルス起点を含む。エピソームは自然に連続したIPSC拡張7で失われます。サブクローニングおよびeGFP発現の損失から推測できるエピソームベクターの損失を有するiPS細胞の特徴付けは、将来の臨床応用のための完全に統合フリー性IPSCをもたらすことができる。 IPSCの生成のプロセスに固有の系統特異的遺伝子および多能性関連遺伝子の再活性化の抑制である。遺伝子発現の調節は、転写因子、調節DNAエレメント、およびRNAポリメラーゼのアクセスが対象とすることを可能にするDNAとクロマチンの修飾を含む、核内の複数のレベルで生じる遺伝子。グローバルクロマチン修飾を介したエピジェネティックな風景のリモデリングは、多能性遺伝的プログラムの再発現に重要なコンポーネントです。遺伝子発現の調節に重要である特定のクロマチン修飾は、ヒストンDNAコイルの減少緊張を通して遺伝子を標的とするためのアクセスを許可する特定のリジン残基でのヒストンのアセチル化である。 HDAC阻害剤は、アセチル化状態11を支持する可能性が、IPSCの再プログラミングおよびhESCの自己再生9,10を増強することが示されている小分子である。統合レンチ12を用いて、公開前から適合以下に記載されるプロトコルは、エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて、末梢血から最適化IPSCを生成するためのステップバイステップの方法を提供する。ここで使用されるHDAC阻害剤の濃度は、ウェアによって記載されたものの半分であるら 9、日常標準にわたって完全に再プログラムIPSCコロニーにおける2倍の増加につながっているHDAC阻害剤なしでエピソーム再プログラミングプロトコル。再プログラミングのこのレベルは、我々は、レンチウイルスの方法で観察する効率と同等である。このプロトコルを用いて、効率的に年齢87歳と同じくらい古い個人からのIPSCを生成した。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Warm to room temperature before use.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>Store at -20 &amp;deg;C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>QBSF-60 serum-free medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>2% gelatin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>Store at 4 &amp;deg;C, liquify in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>non-essential amino acids (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Store at 4 &amp;deg;C, away from light.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham&#039;s F12, 1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>sodium pyruvate, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate, 7.5%</td><td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C. Once thawed, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>sodium butyrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C. Once thawed, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>hES Cell Cloning &amp;amp; Recovery Supplement</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>Store at -20 &amp;deg;C until needed. Once thawed, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>ESC-qualified BD matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td><td>Thaw overnight on ice at 4 &amp;deg;C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 &amp;deg;C until needed. Thaw at 4 &amp;deg;C, use immediately.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>ascorbic acid, powdered</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>recombinant human stem cell factor (SCF)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>Make 100 &amp;mu;g/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C. Once thawed, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>recombinant human interleukin 3 (IL-3)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>203-IL-010</td><td>Make 100 &amp;mu;g/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C. Once thawed, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>erythropoietin (EPO)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C. Once thawed, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>291-G1-200</td><td>Make 100 &amp;mu;g/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C. Once thawed, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Make 1000x stock (100 mM) in DPBS.</td></tr><tr><td>dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Make 50x stock (50 &amp;mu;M) in DPBS, sterile filter, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 &amp;deg;C. Once thawed, store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>12 well tissue culture plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 well tissue culture plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>35 mm tisue culture plates</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml disposable serological pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>5 ml disposable serological pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>2 ml disposable serological pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l pipette tips, barrier tips</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>glass Pasteur pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>pipette aid</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

efficient ips cell generation from blood using episomes and hdac inhibitors

この原稿を効率的にエピソームプラスミドおよびヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤を用いて末梢血からの統合を含まないヒト誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を作成するためのプロトコルを示す。このアプローチの利点は、（1）原料として、末梢血の最小量の使用。 （2）リプログラミングベクター非統合。 （3）ベクトルフリー性IPSCを生成するための費用効果的な方法。 （4）シングルトランスフェクション。 （5）小分子の使用は、エピジェネティックな再プログラミングを容易にする。簡単に述べると、末梢血単核細胞（PBMC）ルーチン瀉血サンプルから単離し、次いで、再プログラミングに著しく適している、高度に増殖性の赤血球前駆細胞集団を得た定義された成長因子の中で培養される。非統合、OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、LIN28A、およびp53の短いヘアピン（SH）RNAを発現する非伝播エピソームのプラスミドはintroduですシングルクレオによって派生赤芽球へのced。強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するエピソームの同時トランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞の容易な同定を可能にする。エプスタイン-バー核抗原1（EBNA1）を発現する独立した複製欠損プラスミドはまた、エピソームのタンパク質の増大した発現のための反応混合物に添加される。トランスフェクションされた細胞は、その後の継続的再プログラミングのために照射したマウス胚性線維芽細胞（iMEFs）の層上にメッキされている。否やIPSC様コロニーはヌクレオ後約12日目に現れるように、HDAC阻害剤は、エピジェネティックなリモデリングを促進するために培地に添加される。我々は、HDAC阻害剤を含めることが日常的に2倍にすることによって完全に再プログラムIPSCコロニーの生成を増加させることを見出した。 IPSCのコロニーは典型的なヒト胚性幹細胞（hESCの）形態を示したら、それらを穏やかに継続的な成長および増殖のための個々のiMEFコーティングした組織培養プレートに移す。

三日後、およびヌクレオiMEFsにヌクレオフェクト細胞を播種する前に、成功したヌクレオの効率は、eGFPのために蛍光顕微鏡によって推定されるべきである。 図1のeGFPを発現する全細胞集団の約5〜10％の典型的なヌクレオ実験を示す。 再プログラムIPSCコロニーは約2週間後にヌクレオ表示されるようになります。コロニーが明確に定義された境界線を有するほぼ円形であり、高い核-細胞質比、（2）可視小体（ 図2、明視野）（1）小さい、密に詰まった細胞を含む特徴的なhESC形態によって同定することができる。不完全に再プログラムされた細胞が劣化したり、容易に真のIPSCコロニーとは区別される不均一な細胞塊を形成することになるのどちらか。 我々は完全に特徴づけるために選択した代表的な株のうち、すべては、sを表現tandard多能性マーカー（ 図2）、（図2）の内因性多能性遺伝子を再活性化、およびフォーム奇形腫NOD-SCIDマウスに注射した場合。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52009/52009fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、EBNA1、p53のshRNAを、及びeGFP（スケールバーは100μmである）を含むプラスミドと3日後にクレオヌクレオフェクト細胞刺激したPBMC。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52009/52009fig2highres.jpg" width="500" /> 図2：IPSCキャラ IPSCはiMEFアルカリホスファターゼ活性のための陽性（明視野）、テスト（AP）上に成長させたときに、このメソッドを呈するのhESC様形態を使用して生成し、陽性である。多能性マーカーTRA-1-60、TRA-1-81、およびSSEA4のための免疫組織化学による。さらに、多能性遺伝子の内因性発現のOct4（O）、Sox2の（S）、Klf4の（K）、およびCMYC（M）は、RT-PCRによって検出可能である。 （すべてのスケールバーは100μmである）。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52009/52009fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="275"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:132px;"> エピソーム </td><td style="width:143px;"> 反応当たりの質量（NG） </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> pCXLE-hOct3 / 4-shp53-F </td><td align="right"> 830 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> pCXLE-HSK </td><td align="right"> 830 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style= &quot;高さ：20pxの;&quot;&gt; pCXLE-HUL </td><td align="right"> 830 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> pCXLE-EGFP </td><td align="right"> 500 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> pCXWB-EBNA1 </td><td align="right"> 500 </td></tr></tbody></table> 表1：リプログラミングプラスミド6の最適な比率は、これらのプラスミドは、Addgeneを通じて注文するために利用可能である。

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Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

ここでは、再プログラミング戦略とヒス​​トンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

efficient-ips-cell-generation-from-blood-using-episomes-hdac

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K ビュー.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. ここでは、再プログラミング戦略とヒス​​トンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。 

ビデオ: Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

発生生物学

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

生物学

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

生物工学

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...