ヒト多能性幹細胞から血液細胞を作製しています。この技術の主な利点は、我々は、ヘモ原性内皮細胞の一貫した、正確な収量を得るということです.当社のプラットフォームは、疾患モニタリングおよび治療薬化合物のスクリーニングに幅広いアプリケーションを提供することを期待しています。
この技術は、血液学および免疫学の研究に特に有益である。この方法は、ヒト血液細胞の遺伝子介入または遺伝子編集に適用することができる。これは、ヘモ原性内皮細胞のベクターの容易な誘導を可能にする。
最も重要なポイントは、PSCコロニーを入力するためのLM511-E8コーティングです。コーティングをスキップしたり、別のマトリックスに置き換えたりすることはお勧めしません。細胞を解離バッファでリンスする方法や、LM511-E8でプレートをコーティングする方法を示すため、視覚的なデモンストレーションは重要です。
ヒト多能性幹細胞またはhPSCを、mTeSR1培地中のLM511-E8コーティングされた6ウェルプレート上で70〜80%の合流まで成長させます。ヘモ原性誘導の4日前に、培地を吸引し、PBSで2回洗浄する。解離液で細胞をリンスし、摂氏37度で15分間インキュベートする。
PSC維持培地中の細胞を再懸濁し、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに懸濁液を移す。細胞をGの200倍で3分間遠心分離する。上清を吸引し、PSCめっき培地中の細胞を再懸濁した。
原稿の指示に従ってPSC懸濁液を微細加工されたプラスチック容器にプレートし、一晩インキュベートします。ヘモジェニック誘導の3日前に、PSCスフェロイドを15ミリリットルの円錐管にそっとピペットし、室温で2分間放置して重力で沈殿させる。上清を吸引し、スフェロイドめっき培地中のスフェロイドを再懸濁する。
サスペンションをLM511-E8コーティングされた10センチメートルの培養皿に1平方センチメートル当たり4回転楕円体の密度で分配し、3日間インキュベートします。3日後、培地を吸引し、分化培地をゼロ日に添加し、細胞を低酸素インキュベーターで2日間培養した。次いで、培地を1日ゼロ吸引し、2日目の分化培地を加え、さらに2日間培養する。
2日後、培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄する。解離液で細胞をリンスし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を1ミリモルEDTAで穏やかに再懸濁して解体する。
懸濁液を50ミリリットル円錐形チューブに移し、200倍Gで細胞を3分間遠心分離する。上清を吸引し、300マイクロリットルの磁気分離バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。100マイクロリットルのCD34陽性マイクロビーズを細胞に加え、ピペットで軽く混ぜます。
室温で30分間インキュベートし、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを使用して懸濁液をひずみ、磁気セパレータを使用してCD34陽性細胞を分離します。24ウェル培養プレートの各ウェルに1ミリリットルフィブロネクチンコーティング溶液あたり5マイクログラムの0.5ミリリットルを分配し、室温で30分間プレートをインキュベートします。一方、200倍Gで並べ替えられたCD34陽性細胞を3分間遠心し、1ミリリットルのEHT培地でペレットを再懸濁した。
セルカウンターで生存細胞密度を決定し、EHT培地を添加して細胞密度を1ミリリットル当たり200,000個の細胞に調整します。フィブロネクチン被覆ウェルからコーティング液を吸引し廃棄し、各ウェルに0.5ミリリットルのCD34陽性細胞懸濁液を分配する。細胞を低酸素インキュベーターに1週間インキュベートします。
浮遊細胞を集めるために、培養培地を15ミリリットル円錐管に移し、遠心分離機を200回Gで3分間移動させる。その後、上清を吸引します。接着性細胞を回収するには、0.5ミリリットルのPBSで2回洗浄し、解離バッファーで洗い流します。
余剰液を吸引し、5分間摂氏37度でプレートをインキュベートする。Facsバッファーの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、浮遊細胞と付着細胞を混合する。混合細胞をGの200倍の3分間遠心分離し、その後上清を吸引し、50マイクロリットルのFacsバッファーで細胞を再懸濁する。
50マイクロリットルのFacsバッファーで抗CD34抗体と抗CD45抗体を希釈し、細胞に加え、暗闇の中で室温で1時間培養します。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、各洗浄後3分間G200倍で遠心分離する。上清を吸引し、1ミリリットルダッピーあたり0.5マイクログラムのFacsバッファーの0.5ミリリットルで細胞を再懸濁します。
フローサイトメトリーによりCD34およびCD45発現を測定する。造血細胞を収集するには、培養液を15ミリリットル円錐管に移す。残りの細胞をPBSで2回やさしくすすいで回収します。
細胞を200倍Gで3分間遠心分離し、上清を吸引し、1ミリリットルのEHT培地で再懸濁する。細胞を数えた後、メチルセルロース間隔培地の3ミリリットルに10,000細胞を加え、抗生物質を補い、16ゲージの注射器を使用して5回混合します。メディアのサスペンション全体を6ウェルプレートの各ウェルに分配します。
細胞を湿らせた状態に保つには、プレート上の空の井戸に水またはPBSを加えます。コロニーが動きに敏感であるように皿を邪魔しないように、2週間細胞をインキュベートします。2週間後、顕微鏡下でコロニーを数えます。
細胞は、造血カクテルを刺激すると、内皮細胞から造血細胞に形態的に変化する。造血細胞コロニーが培養物に出現する。造血前駆細胞はCD34およびCD45を発現するので、フローサイトメトリーはCD34およびCD45の発現を解析することによって造血細胞コロニーの存在を確認するために使用される。
コロニー形成ユニットアッセイは、CD34陽性およびCD45陽性造血前駆細胞からの顆粒球またはマクロファージコロニーの生成を実証した。コロニー数は、10,000細胞当たり38コロニー形成単位であると推定した。最も重要なステップはPSCスフェロイドを集計することです。
表面メトリックがこのプロトコルの効率において最も決定的な要因であることがわかった。この手順は、天然細胞およびマクロファージなどの細胞の既製化を続けることができる。このプラットフォームにより、研究者は人造血の開発における重要な決定要因を探求することができます。
