Name: single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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このプロジェクトは、土地バーデン=ヴュルテンベルク州が資金提供だけでなく、欧州連合（EU）による、ユーロぺッシャーフォンエリーゼオルシEntwicklungダイた。著者らは、熟練した技術支援のためのU251-MG-L106-Grx1-roGFP2細胞株とクラウディアヒンツェを提供するためのライナー·ウィッティヒ（ILMウルム）をお願いいたします。

1。細胞スフェロイドの成長とインキュベーション<ol><li>実験1：化学療法薬とインキュベートした細胞のスフェロイド<ol><li> （6プレートのために十分な）の30ml培地にアガロース物0.45gを添加することによって培養培地中で1.5％アガロースを準備する。 </li><li>随時、それを攪拌しながら、ステップ1.1.1から少なくとも80℃まで混合物を加熱する。 </li><li> 96ウェルプレートの各ウェルにステップ1.1.2からの加熱混合液50μlを記入し、それが1〜2時間以内に固化してみましょう。使用するまで5℃で冷蔵庫に閉じられ、覆われたプレートを保管してください。 </li><li>ハム10％ウシ胎児血清（FCS）を補充したF-12培地と1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で調製し、96ウェルプレートの各ウェル中150 MCF-7乳癌細胞についてのシード。 </li><li> 5％のCO 2、37℃のインキュベーター中で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる76; C。 </li><li> 5％のCO 2、37℃のインキュベーター中で2μMおよび（培養液中の）8μMの範囲の濃度で6時間、アントラサイクリン系抗生物質塩酸ドキソルビシンによる細胞スフェロイドを培養する。 </li><li>前顕微鏡に培養液またはアールの平衡塩類溶液（EBSS）を有する細胞スフェロイドを洗ってください。 </li></ol></li><li>実験2：酸化還元センサーを発現しているスフェロイドにおける酸化プロセス<ol><li>永久にDMEM中で96ウェルプレートのアガロースゲルでコーティングされたウェル（ス​​テップ1.1.1-1.1.3に記載された手順）でグルタチオン敏感な緑色蛍光レドックスセンサーGrx1-roGFP2でトランスフェクトした400 U251-MG-L106神経膠芽腫細胞についての種子10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよびハイグロマイシンB（150μgの/ ml）を補充した培地。 </li><li> 5％のCO 2、37℃のインキュベーター内で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる。 </li><li> 10＆＃を追加します。181は、100 mMのストック溶液を作成するために990μlの再蒸留水に過酸化水素水（purum年率、≥30％）のlは12時間以内に使用する。 </li><li>右の実験前にEBSS中、50μMのステップ1.2.3から原液を希釈する。 </li><li>レドックスセンサーの酸化のためEBSS中50μMの過酸化水素と、測定中にマイクロ流体システムを介して細胞スフェロイドを培養する。 </li></ol></li><li>実験3：開始およびスフェロイド内の細胞壊死のラベリング<ol><li>補充したDMEM培地中で96ウェルプレートのアガロースゲルでコーティングされたウェル中の種子約400細胞（ 例えば、U251-MG-L106-Grx1-roGFP2の神経膠芽腫細胞）（手順のステップで説明1.1.1-1.1.3） 10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよびハイグロマイシンB（150 mg / mlで）。 </li><li> 5％のCO 2、37℃のインキュベーター内で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる。 </li><li>細胞をインキュベート細胞壊死を誘導する培地中の1μMの濃度で3時間、ミトコンドリア電子伝達阻害剤であるロテノンでスフェロイド。さらに、壊死細胞を標識するための1mlの培養培地中で1μlの濃度で3時間、緑傷害性色素と共インキュベートする。 </li><li>前顕微鏡に培養培地またはEBSSを用いて細胞スフェロイドを洗ってください。 </li></ol></li></ol> 2ライトシート調整注：最良の結果を達成するためには、シート光のビームウエストは、対物レンズの焦点面にあることを保証しなければならない。ビームウェストの位置は、（ - 2.8手順2.5を参​​照）、キャピラリーに対して垂直な位置にシート光を観察することによって整列させることができる。 <ol><li>文献に記載されているように、倒立顕微鏡を使用し、SPIMの励起モジュールをマウントします。 16、位置決めテーブルのベースプレートに（ 図1Aを参照）。 </li><li> 1と顕微鏡を装備0X / 0.3または20X / 0.5顕微鏡対物レンズや顕微鏡の検出経路の適切なロングパスフィルタ（ 例えば、λ≥515 nm）を。 </li><li>顕微鏡の検出ポートに統合するカメラをマウントします。 </li><li>優先的に470nmの励起波長でレーザーまたはレーザーダイオードを並列にコリメートされたビームを使用し、SPIMモジュールに適用する。 </li><li>シート光のビームウエストの軸調整のための垂直位置に光シートを転送する、90度の円柱レンズを回転させます。 </li><li>サンプルホルダー内の蛍光色素で液体を含むキャピラリーを置きます。 </li><li>顕微鏡の位置決めテーブルに毛細管で試料ホルダーを取り付け、それを中心とし、シート光のビームウエストにフォーカスがあるされるように、キャピラリの位置を合わせる。 </li><li>シリンドリカルレンズ自体の軸方向の位置の変化によってビームウエストを調整します。広告の後にレンズを引き返すjustment。 </li></ol> 3セルスフェロイドアプリケーションおよび顕微鏡フィードの同期<ol><li> 600ミクロン×600ミクロンの内側断面および120μmの壁の厚さとは別に、または長方形のホウケイ酸ガラスキャピラリー16内のグループにおける細胞スフェロイドを置きます。細胞スフェロイドの適用のための2つの技術が成功することが証明されている。 <ol><li>親指と中指で直立空のキャピラリーを取り、あなたの人差し指で上部開口を密閉する。その周囲の液体（EBSSまたは培地）における細胞スフェロイドの下部開口の近くを持参してください。上部の開口部から人差し指を離します。その中の細胞スフェロイドを持つ液体は毛管力によって、すぐに浸されます。キャピラリーのそれぞれの直立した状態で重力により充填キャピラリー内の回転楕円体の位置を調整します。 </li><li>代わりに、ピペッティングを経由して毛細血管への細胞スフェロイドを適用します。介護THAしてくださいピペットの先端の開口トン毛細管の内径の大きさ一方、以下、一方では、スフェロイドの大きさのために十分な大きさと。 </li></ol></li><li>顕微鏡検査のための特別なサンプルホルダーに、その中に回転楕円体と毛細血管を配置します。 </li><li>顕微鏡の位置決めテーブルに毛細管とサンプルホルダーを取り付け、それを中心にして集中していることをこのような細胞回転楕円体の位置を合わせる。 </li><li>光学シート及び反射ミラーの位置と、シリンドリカルレンズを調整することにより、検出経路における顕微鏡対物レンズの焦点面との間のマッチングを設定し（ 図1Bの調整ねじを参照）。 </li><li>マイクロメータねじを調整して屈折率及びfishtank効果を補償する対物レンズの開口数に応じて（ 図1Bを参照）。 注：異なる屈折サンプルのインデックスとtを取り巻くメディア彼対物レンズは、対物レンズのシフトと焦点面のずれの差につながる。光シートは、対物レンズタレットによって移動されるので、光シート（対物レンズのシフトに相当）のシフトと焦点面の移動との間の不一致は、レバーアーム（ 図1Bを参照）によって補償される。マイクロメータねじは、対物レンズの開口数および屈折指数に応じて光のシートのずれを調整するために、上下のピンの間の距離を適合させるために使用される。 </li></ol><img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> 単一平面照明の図1（A）倒立顕微鏡の位置決めテーブルのベースプレートに取り付けられた単一平面照明モジュールの写真、（B）設定モジュールと焦点面と照射面との間のリフティングミスマッチ（fishtank効果）を補正する顕微鏡フィードの同期化。 Δzはoは焦点面のずれや光シートF対物レンズとΔzはのずれを示しています。インレーは毛細血管を含む回転楕円体の断面を示している。左：長方形のキャピラリー600ミクロン（壁120ミクロン）の内径。右：回転のために使用されるセットアップ。インナーラウンドキャピラリー（内径400μmの外径550μm）を、外側の長方形のキャピラリー内で回転させる。つの毛管との間の空間が液浸流体で満たされている。 動的液体環境での4。測定注：前のプロトコルは、前の細胞スフェロイドが以前にインキュベートし、次いで、単純な重力によってキャピラリー内で所定の位置に保持された測定値に静的インキュベーションのために使用される。さらにfixatiを必要としない上。ただし、動的インキュベーションとは、したがって、動的な環境を取り込み動態を測定することが望ましいメディアを流れる中の測定のために、人は、このサブプロトコルを達成することができます。 4.5から4.9のサンプルに達する気泡を避けるために重要である、ステップ。 <ol><li>内側のガラス表面への細胞スフェロイドの後の細胞接着を支持するために30分間FCSでキャピラリーを満たす。 </li><li>枯渇毛細血管内の残りのFCSコーティングは、少なくとも12時間、完全に乾くしましょう​​。 </li><li>ステップ3.2で説明したように、FCSコーティングされたキャピラリーへの細胞スフェロイドを紹介。 </li><li>回転楕円体の細胞接着を引き起こすために追加の2-4時間、5％CO 2、37℃のインキュベーター内毛細血管のままにしておきます。 </li><li>マイクロ流体システムの流入部分を設定します（ 図2を参照）。蛍光染料、薬剤または薬剤を含む培地で：チューブ（0.89ミリメートル内径）の流入を埋めるために、蠕動ポンプを使用してください。 </li><li>接気泡トラップへのマイクロ流体システムの流入部CT（ 図2を参照）。 </li><li>まず流入管に気泡のない毛細管をクランプした後、ドレーンチューブにキャピラリーの反対側をクランプします。 </li><li>チューン所望の値（ 例えば、37℃）の水浴の液温。 </li><li>希望のポンプ速度に蠕動ポンプを調整し（ 例えば、流速：9μL/分;ポンプ速度をキャピラリー中：25ミリメートル/分）。 </li><li> 、受信者（オープンループ設定）での圧送液体のいずれかを収集し、そのソース（クローズド·ループ設定）に戻すことを養うか、蠕動ポンプ（タイトクローズドループ·セットアップ）のチューブに直接供給されています</li></ol><img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> 図2マイクロ流体セットアップ（オープンループとタイトなクローズドループ）;インレイ：SPHのイルミネーション倒立顕微鏡に接続された光シートベースの蛍光顕微鏡を用いたマイクロキャピラリー内eroid。 5。データ収集と解析<ol><li>レーザパワーと画像取得のための積分時間を設定する。 </li><li>ステップ5.1で定義されたパラメータは、ネイティブ細胞または蛍光色素でインキュベート以降に蛍光タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした10〜20 J / cm 2のために50〜100 J / cm 2程度の光線量値を超えないように注意してください（詳細は参考文献12を参照）光毒性を避ける。 </li><li>光シートの厚さは約10μmであるように3次元データ解析のために望ましい= 5〜10μmでΔzのにzスタックのための増分を設定します。 </li><li>細胞スフェロイド内の焦点面を変化させることによって、単一の画像またはz-スタックの測定を実行します。 </li></ol>

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Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

利害関係が宣言されていない。

現在の原稿は、光シートまたは3次元細胞システム用に最適化され、単一の平面照明顕微鏡（SPIM）デバイス、 例えば、多細胞腫瘍球（MCTS）について説明します。 3つの例示的な用途は、（1）細胞増殖抑制剤の取り込みおよび（化学療法剤の有効性への寄与はまだ評価されたまま）の分解生成物への部分的変換、遺伝的にコード化されたグルタチオンセンサの使用時によりレドックス状...

十分に確立された方法（共焦点又は多光子レーザー走査顕微鏡1-4、構造化照明顕微鏡5,6）光シート又は単一平面照明顕微鏡（SPIM）に加えて、3D撮像7,8の有益な方法であることが証明され、 9。特に興味深いのは、創薬研究10,11のためにますます使用されている3次元細胞培養、 たとえば、多細胞腫瘍球（MCTS）、への応用である。さらに、SPIMも長期暴露または反復測定値に低光用量のみ、この面が光に曝露されたサンプルの各平面を測定するためのので、サンプルの生存性を維持するために必要とされる優先的な方法である。アップ多数の面光線量和の記録時と試料12を損傷することができるように、これは、各焦点面の検出のための試料全体が点灯している他の顕微鏡技術とは対照的である。 </P&gt; シート光顕微鏡またはSPIMは、シリンドリカルレンズを使用することによって、または励起用レーザビームを走査することにより、いずれかの観察光路（総説については参考文献8を参照）に直交する方向の試料の照射に基づいている。これは多くの場合、特別なサンプルチャンバ13,14または行列を必要とし、 例えば、アガロース7,15、特別な高コスト顕微鏡で実装。これらのシステムに代わるものとしてSPIMための比較的簡単な照明装置は開発され、従来の倒立顕微鏡16（ 図1参照）に適合。約100μmの被写界深度を超える6-10ミクロンの厚さのシート光には、8mmの直径に拡張し、シリンドリカルレンズ（0.08：50ミリメートル、開口数、焦点距離）により集光されたレーザ光から構成され。サンプルは、顕微鏡対物レンズのlenの前方に配置600-900ミクロンの内径の長方形のキャピラリーに配置されている蛍光検出のための。これらの主な機能は、現在完了して保持するための蛍光検出（同一の光路に使用される（軸方向）のサンプル、照明光シートの同期調整と、対物レンズを回転させるための高度なマイクロキャピラリーアプローチを使用することによって最適化されている変位の長さは、このように、必要な数量と費用を最小限に抑え、機械的な飼料の補正）、および蛍光色素、医薬品または薬物の適用のためのマイクロ流体システムの適応を必要とする。

<table><tbody><tr><td>Microtiter plate</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>For cell spheroid growing</td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>For cell spheroid growing</td></tr><tr><td>MCF-7 cell line</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td>Cell line</td></tr><tr><td>U251-MG-L106 cell line</td><td></td><td></td><td>Cell line</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>DMEM/Ham&#039;s F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>Cell culture supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA Laboratories&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P02-015</td><td>Antibiotic</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>E3024</td><td>Cell culture supplement</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D1515</td><td>Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Green cytotoxicity dye</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Capillary</td><td>VitroCom&amp;nbsp;</td><td>8260-050</td><td>Sample preparation</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD-camera</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD-camera</td></tr><tr><td>AxioVision data aquisition software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>version 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>Used with driver PDL800-B</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone tubes</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

簡単に、反転広視野顕微鏡に適合し、3次元細胞培養に最適化されて記述されている光シートまたは単一平面照明顕微鏡（SPIM）のためのモジュール、例えば、多細胞腫瘍スフェロイド（MCTS）。 SPIM励起モジュールの形状や試料が顕微鏡の検出経路に垂直なシート光によって照らされるように光を偏向する。システムは、照明光シートの同期調整と同様に蛍光検出のために使用される対物レンズにより、試料（また、回転用マイクロキャピラリーアプローチによって、高度なバージョンで）保持するための長方形のキャピラリーを使用することを特徴とする蛍光色素、少量の薬剤または薬物の適用のためのマイクロ流体システムの適応による。このシステムを操作するためのプロトコルが与えられ、いくつかの技術的な詳細が報告されます。代表的な結果は、最大の（1）測定値を含む酸化剤の添加により細胞増殖抑制薬物（ドキソルビシン）と、分解生成物への部分的変換の遺伝的にコードされるグルタチオンセンサを使用することにより、（2）酸化還元測定を行い、（3）開始との阻害の際に細胞壊死のラベリングミトコンドリア呼吸鎖。既存のシステムと比較して現在のSPIMモジュールの違いおよび利点は、説明されています。

実験1：化学療法薬とインキュベートした細胞のスフェロイド 以前にインキュベートしたMCF-7細胞スフェロイド（8μMドキソルビシン、6時間）のzスタックスキャンは、図3に示されている。それは、細胞取り込みおよびドキソルビシン17の分布とその分解物18,19に関する詳細な情報を提供します。内側の回転楕円体領域に分解生成物...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

単一平面照明顕微鏡法のためのモジュール（SPIM）を容易に反転広視野顕微鏡に適合し、3次元細胞培養に最適化されて記載されている。試料は、長方形のキャピラリー内に配置され、マイクロ流体システムを介して蛍光色素、薬剤または薬物は、少量で適用することができる。

単一平面照明モジュールと広視野顕微鏡用マイクロキャピラリーアプローチ

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

9.7K ビュー.  Aalen University. 単一平面照明顕微鏡法のためのモジュール（SPIM）を容易に反転広視野顕微鏡に適合し、3次元細胞培養に最適化されて記載されている。試料は、長方形のキャピラリー内に配置され、マイクロ流体システムを介して蛍光色素、薬剤または薬物は、少量で適用することができる。 

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

生物工学

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

チップ上Lensless蛍光顕微鏡

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

生化学

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

免疫・感染学

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living cells in real time. In this protocol, we cover the fundamental steps to realize an iSCAT microscope and complement it with additional imaging channels to monitor the viability of a cell under study. Following this, we use the method for real-time detection of single proteins as they are secreted from a living cell which we demonstrate with an immortalized B-cell line (Laz388). Necessary steps concerning the preparation of microscope and sample as well as the analysis of the recorded data are discussed. The video protocol demonstrates that iSCAT microscopy offers a straightforward method to study secretion at the single-molecule level.

We present a protocol for the real-time optical detection of single unlabeled proteins as they are secreted from living cells. This is based on interferometric scattering (iSCAT) microscopy, which can be applied to a variety of different biological systems and configurations.

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

工学

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

高傾斜の構築ガイド拡張ビュー フィールドの単一分子イメージング用タイル顕微鏡を掃引

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

単一平面照明モジュールと広視野顕微鏡用マイクロキャピラリーアプローチ

要約

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高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

チップ上Lensless蛍光顕微鏡

マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

高傾斜の構築ガイド拡張ビューフィールドの単一分子イメージング用タイル顕微鏡を掃引

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

単一平面照明モジュールと広視野顕微鏡用マイクロキャピラリーアプローチ

要約

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高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

チップ上Lensless蛍光顕微鏡

マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

高傾斜の構築ガイド拡張ビュー フィールドの単一分子イメージング用タイル顕微鏡を掃引

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

高傾斜の構築ガイド拡張ビューフィールドの単一分子イメージング用タイル顕微鏡を掃引