Name: single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers at JoVE.com

MAは行財政支援のためのオーストリア科学基金（FWF、J3086-B11）と感謝のシュレーディンガーの交わりマックスプランク協会によってサポートされていました。 GSは、ウィーン科学技術基金（WWTF、LS13-030）によってサポートされていました。 JHは、ウィーン科学技術基金（WWTF、LS14-031）によってサポートされていました。

1.生成と平面のSLBの機能化<ol><li>脂質の混合<ol><li> 10％DGS NTA-Ni系/ 90％POPC脂質組成に到達するには、250ミリリットルの丸底フラスコに、クロロホルム中のPOPCおよび6.9 mgのDGS NTA-Niを45 mgを溶解します。次のステップでそれを蒸発させ、クロロホルム低い（ちょうどいくつかのミリリットル）のボリュームを維持します。 1％DGS NTA-Ni系/ 99％POPC脂質組成は49.5ミリグラムPOPCおよび0.69 mgのDGS NTA-Ni系を使用してください。 </li><li>ゆっくりロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを削除 - 周囲温度を超える上昇は必要ありません。代替的に、窒素またはアルゴンなどの不活性ガス気流中で化学フード内側に吹き飛ばします。これをやっている間、常に丸底フラスコの下半分に乾燥脂質の同等の堆積を可能にするために、フラスコを回します。 </li><li>クロロホルムの大部分が蒸発されると、定量的にクロロホルムを除去するために、O / Nを真空フラスコを接続します。 注：この手順は、汚染を避けるために重要です後の段階では毒性クロロホルムでタンパク質や細胞の脂質二重層の流動性を確保します。 </li></ol></li><li>乾燥した脂質の単層小胞（SUVの）の生成 注：小型単層小胞（SUVの）直径は20nmと100nmの間であり、容易に浴超音波処理することにより製造することができます。脂質押出し、別の方法では、押出成形のために適用されるフ​​ィルターの細孔サイズに応じて、SUV車を生じさせることができ、また、大単層小胞（LUVを）、サイズが100ナノメートル〜1000ナノメートルです。しかし、SUVがのSLBを形成するのに最適です。 <ol><li>バス超音波処理を通じてのSUV（ビデオに示されています）： <ol><li> PBS Degass。 10 mlの250 mlの乾燥した脂質混合物を懸濁さ丸底フラスコに、PBSを脱気しました。 </li><li> 、窒素やアルゴンなどの不活性ガスでフラスコを記入ストッパーで、それを閉じ、オートクレーブテープでフラスコを密封します。 </li><li>バス超音波処理器に密封されたフラスコを置き、脂質懸濁液aを超音波処理トン120 170 Wにそれが透明になるまで。これは、30〜60分かかります。 </li><li>小胞形成の分光測光法の進行状況を監視します。PBSと比較して、未希釈エマルジョンの吸収が（脂質濃度のおおよその指標として）234 nmで一定のまま、まだ原因を経由して減少し、光散乱（550nmで著しく低下する必要があることを結果として起きますより大きな粒子）。 </li><li>連続したSLBの形成を妨げる重い非単層小胞を、ペレットに、25℃で1時間150,000×gで遠心分離によって小胞懸濁液をペレット化した後、288,000×gで、4℃で8時間。 </li><li>孔径0.2μmのシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。 </li><li>小胞の準備の明快さと脂質の残量を監視するために、234 nmおよび550 nmでODを測定します。 </li><li>アルゴンまたは窒素下で4℃で小胞を保管してください。必要に応じて、二層の製造のための小胞懸濁液を使用数ヶ月のために。 </li></ol></li><li>脂質押し出しを通じてのSUV： <ol><li>簡潔には、孔径0.1μmのフィルターを介して脂質懸濁液を数回通過します。かかわらず、製造方法、遠心ベシクル懸濁液の二倍（1H、15万グラム、25℃、その後8時間、4℃、288000グラム）重く、非単層小胞をペレット化します。 注：不活性ガス下で4℃で保存したとき、小胞は、数ヶ月のための二層の調製のために使用することができます。 </li></ol></li></ol></li><li> SLBの形成とタンパク質と充電<ol><li>濃硫酸と30分間、30％過酸化水素水の3：1混合物で24×50mmの＃1.5ガラススライドを処理します。 注：これにより、混合物の積極的な性質のために特別な注意を払うビデオに示すように、すなわち白衣や安全ゴーグルを着用！ </li><li>噴出ボトルのうちのddH 2 Oの流れの下でガラススライドを洗浄します。テフロンスタンドにそれらを配置し、それらを乾燥させ10〜30分間。 </li><li> 、8または16ウェルチャンバーの底のガラススライドを削除するエポキシ接着剤で底を記入し、慎重に接着剤で覆われたチャンバーの底部に清潔で乾燥したスライドガラスを配置します。接着剤は、約10分間硬化してみましょう。下から余分な接着剤を除去します。 注：スライドガラスとチャンバとの間の気密シールはまた、容易に10〜30分以内に硬化する歯科用二成分シリコーンモデリングペーストを使用して達成することができます。このシールはエポキシ接着剤のようにしっかりとではなく、定期的な歪みに耐えます。実験後には容易に将来の実験において、次に再利用可能である、チャンバから除去することができます。 </li><li> 8（16）の各ウェルに10倍のPBSで希釈された脂質懸濁液のピペット120μL（60μL） - 20分とさせて二層形式（上記のように調製した）ウェルチャンバー。慎重に15ミリリットルPBSで2回二重層をすすぎます。二重層が形成されると、それは常にバッファ内に沈めなければならず、空気にさらされることはありません。 </LI&gt; <li> 330μl（8ウェルチャンバー）または165μl（16ウェルチャンバー）を脱いで、その後、PBSで各ウェルのすべての方法を入力します。ウェル内に残って（175μl）350μlのがあります。各ウェル（400または200μlの最終）にPBSで希釈したHisタグ化タンパク質を含むカクテル50μlの（25μlの）を追加し、暗所で60分間室温でインキュベートします。表面タンパク質の濃度は、このインキュベーション工程の間にタンパク質濃度を変えることによって調整することができます。 </li><li> 15ミリリットルPBSで2回各ウェルを洗浄します。 注：一般的には、SLBのは、彼らがタンパク質で充電した後、もはや6時間以上の実験で使用されるべきではありません。この期間中、光退色後の蛍光体回収率は95％まで残り、二重層関連タンパク質には損失を検出することはできません。タンパク質濃度は、（下記参照）は、実験に先立って決定されるべきです。 </li><li>オプションのステップ：SLBを含むタンパク質DGS NTA-Ni系の非特異的結合について試験するために、PBSを300mMのイミダゾールを含有する一回SLBを洗います。プロテインは完全にオフに来る必要があります。 </li></ol></li></ol> 2.顕微鏡のセットアップ<ol><li>単一蛍光色素の蛍光を検出することができる顕微鏡システムを構築するための導入に記載された勧告を参照してください。 </li></ol> 3.パワー測定注意：フルオロフォアは、容易に過剰な励起光を飽和させることができます。これは、発光の無い、さらにゲインで退色加速ので、避けるべきです。試料照明を最適化するために、励起パワー密度は、試料において直接測定されるべきです。このような測定は、将来の実験のための基準として機能することができます。光は撮像システムで失われる場合に評価する際にさらに、入力および出力のレーザパワーとの比を知ることは有用です。 <ol><li>それは90°角度で目標を残すように直立位置に励起ビームを移動します。 </li><li>トップOに電力計のヘッドを配置ビームfおよびビーム（= P）の電力を測定します。その結果を文書化します。 </li><li>潜望鏡を使用して、全反射位置とイメージそのまま均質な蛍光二重層にビームを向けます。漂白およびCCD信号飽和の場所を回避するために、中性密度（ND）励起光路内に2〜3の光学密度（OD）を用いて濾過します。 <ol><li>全体の照明視野（=私は合計 ）の統合されたカウント数を測定します。また、照明領域（= 合計 ）の大きさを測定します。最大限に照らさ中心スポットだけでなく、スポット（= 中央 ）のサイズの積算計数値（= I・センター）を測定します 。 </li></ol></li><li>ピクセルあたりの背景信号を測定する（= B）のいずれか照射領域外またはサンプル照明なし。 </li><li> 3での測定結果）からのバックグラウンド信号を減算します。背景に質問（全体照明領域または中央スポット）内の領域の画素数を乗じてこれを行いますピクセル当たりのカウント。 （=私は合計 - 総 .Bと私の中心 - 中心 .B）を。 </li><li>割り統合されており、背景には、照明のフィールド全体の統合とバックグラウンド補正された信号によって中央スポットの信号を修正しました。 注：結果は、中心スポット（=（I センター - センター .B）/（私は合計 - 総 .B））内に位置する総電力の割合を示しています。 2で測定された電力Pと、この結果の乗算）光照射の中心スポットのパワーの結果。 </li><li>スポットμm² の中央のサイズを決定します。これは、対物レンズの倍率によってμm単位でカメラの画素サイズを分割するために、ピクセルあたりμm²として結果の二乗を取ります。 <ol><li>あるいは、顕微鏡上に配置されたマイクロメータスライドを使用して、画像内のピクセルサイズを測定し、画素あたりの面積と結果の二乗を取ります。 MULTiplyセンタースポット内に位置する画素数で、この値は、照射スポットのエリアに到達します。 </li></ol></li><li>センタースポットセンターの大きさで、中心スポットを照射する電力Pを分割し、μmの2あたり照明強度を計算するμm²。一例が図6に示されています。 </li><li>非TIRF照明で測定された電力密度の値は、典型的には、レーザ光 ​​が全反射される正確な角度に依存するTIRF照明13内に存在するものよりも低いです。 TIRF照明下で現在の電力密度に到達するには、画像非TIRFとTIRFの両方では0.1μm径の蛍光ビーズをキャリブレーション。 TIRF非TIRFモードで測定されたビーズの蛍光強度の比は、TIRF照明（式1）の下で効果的なものに測定された電力密度値の変換を可能にする変換係数Cに達します。 電力密度 </eM&gt; TIRF = C•電力密度非TIRF（式1） Cと=ビーズ強度T IRF /ビーズ強度非TIRF </li></ol> 4.密度測定<ol><li>二層に位置して、個々の蛍光体の平均信号を決定します。蛍光性ペプチドを負荷した二層付MHC分子は、タンパク質ので、この目的のために理想的である：ラベルの化学量論は、1つのです。視野内の二層に必要な漂白剤は、すべてのラベルの場合、蛍光は、単一の蛍光色素分子を可視化するために回復しましょう​​。 <ol><li>立て続けに記録する画像（例えば、ストリーミング取得プロトコルを適用）と、複数のフレームの上に単一分子の移動を監視します。詳細については、図7を参照してください 。 </li></ol></li><lI&gt;マークROIとして二重層内の中央照明スポット。 ROIを測定し、（蛍光強度に比例する）照明の電力密度の分散は15％以上、理想的に小さくする必要があります。 <ol><li>これだけROI内の単一分子とバルク蛍光を決定します。単一エミッタの点広がり関数の99％以上を捕捉するのに十分な大きさのROIの信号を統合します。 （メーカーのカメラ仕様に記載された）16-20ミクロンの画素サイズを有するカメラを用いる場合、100倍の倍率に等しいまたは1.45より大きい開口数を有する対物レンズを備えた7画素で7領域を取ります広場の中央に位置する強度ピーク。 </li><li>バックグラウンド信号を決定するために、蛍光シグナルが含まれていない隣の7 7ピクセルの正方形の数を統合します。単一分子フッ素ための補正値を決定するために、単一分子のシグナルからバックグラウンドを差し引きますescence。まだ次のフレームに表示されている信号のみを選択します。 </li></ol></li><li>数百倍に手順を繰り返し4.2 50。バックグラウンド補正された信号を平均します。所望の場合、ヒストグラムとして単一分子強度値をプロットします。オプション：オープンソース・ソフトウェア・パッケージの適切なプラグイン（例えば、ImageJの）を利用するか、市販のソフトウェア（例えばをMetamorph、Molecular Devices）を使用してデータを処理します。経験豊富なユーザーは、MATLABなどのソフトウェアパッケージで、独自の解析プログラムを書き込むことができます。 </li><li>励起経路に2以上の減光フィルタを配置し、同じフルオロフォアで標識されたタンパク質を含む蛍光二重層の画像を撮影します。単一分子の強度の測定に使用されるのと同じROI内の平均ピクセル強度を記録します。バルク蛍光測定の露光時間を記録します。バックグラウンド減算のための照明なしで同じ場所を測定します。 </li><li> BI内のタンパク質濃度を決定するために、層は、平方ミクロン当たりのピクセル（例えば41.5）、100（2のODとNDフィルターを使用した場合）、または千数（場合によりステップ4で決定した背景補正されたバルク蛍光平均画素強度を掛けるND 3のODのフィルタを使用した）と露光時間がステップ2で使用し、ステップ3で決定された平均一分子信号で割り、露光時間は、ステップ2で使用され、タンパク質あたりの蛍光体の数。 </li></ol> 5.テスト二層の整合性<ol><li>蛍光二重層を準備し、上記のように顕微鏡のステージ上に置きます。 </li><li>フォーカスを調整し、全反射モードでの二重層の画像を取ります。小さな円盤状のROI内の蛍光を除去するために、非TIRFモードで短いが強烈な漂白剤パルスを適用します。 </li><li>蛍光回復の速度を監視するために、すぐに漂白し、その後、5〜10秒後に低強度のTIRFモードで二重層の画像を取ります。 </li><li>モー二層の異なる領域にVEの、ステップ2と3は、漂白剤のパルスの後に低強度TIRFモードで5分を別の画像を取るに従ってください。次のように不動の割合（IF）を計算するために（何の漂白が発生していないはずです）、実験の開始時に、I 0を漂白する前に、私は漂白剤領域に漂白剤を投稿強度を決定し、強度にそれを比較します： 不動の分画（％）=（I 0 -私は漂白剤を投稿 ）IF /（I 0 -背景）は、×100 適用されていない励起光のROI内の背景=測定された強度を持ちます IFは、10％未満（理想的には5％未満）であるべきです。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利害関係を有していないことを宣言します。

単一分子顕微鏡は、それらの天然の細胞環境内のタンパク質の挙動を研究するユニークな機会を提供します。分子イメージングは​​、広範な科学界に、したがって、ますます魅力的になり、まだ多くの生命科学者はまだ離れて技術とノウハウの初期投資を敬遠。自分のイメージングシステムの組み立てに起因する主な利点は、それが容易に誰の特定のニーズに合わせることができるということです。 本明細書に示唆されるように、非TIRF励起光が容易に既存のTIRF光路に加えて実施することができ、フルオロフォアおよびリガンドの迅速で定義された光退色（または-活性化）が望まれる場合、例えば実行FRAPまたはリガンドアンケージング実験14 。放射ビームスプリッタの導入は、少なくとも二つの、いくつかのケースでは4つの蛍光チャンネルまでの同時録音が可能になります。拡張子のリストは、本質的にのみによって制限されています自分の想像力。 例えば、放射パスに電動式発光フィルタホイールを実装する最大10個の異なる蛍光チャネル間の高速スイッチングが可能になります。直列に（それぞれ10フィルタスロットを装備した）は、2つの電動発光フィルタホイールを組み合わせる場合、最大18の蛍光チャネルを読み出すことができます。 TIRFベースのイメージングは​​、キセノンまたは水銀ランプ励起経路の統合後のカルシウム動員の測定値と干渉反射顕微鏡（IRM）で補完することができます。 IRMは、ガラス表面またはSLBに結合している細胞及びTIRFベースの撮像データを解釈するとき、従って、重要な情報を提供することができる程度を視覚化するために選択される方法です。シンプルなダイクロイックミラーを使用すると、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）または確率的光学再構築顕微鏡（STORM）を実施できますnmで405の追加のレーザー、すなわち2 superresolutに広がった励起ビームの確立可視光15,16の回折限界以下の位置精度でイオン方法。 しかし、実験の成功だけでなく、適切なハードウェアの問題です。ノイズ低減TIRFベースのイメージングを最大限に活用するために、細胞は、細胞表面上の制約を課すか、それはその形質膜の生理機能に干渉しないやり方で表面に接触する必要があります。すべてのSLB-埋め込みリガンドは、横方向に、移動され、結合および分離ダイナミクスを受容体に応答して、二重層内での横方向の位置を調整するため、細胞接着のための適切なタンパク質で官能のSLBは、この目的によく適している超えます。 再現可能な方法でのSLBを製造するためには、高純度のSUV車でスタートするのがベストです。本明細書に記載されるように、これらのIのような2つの超遠心分離工程においても、超音波処理の間に生成された多重膜小胞を除去することが重要です高い流動性を特色に連続するのSLBの形成とnterfere。唯一のきれいなガラス表面上に高品質のフォームののSLB。一度洗浄したガラススライドは、直ちに使用または真空に格納する必要があります。これは彼らの混乱につながるとして重要なのは、SLBのは、空気にさらされてはなりません。 SLBの洗浄はこの保存はなく、時間を節約する手順だけではないように、バッファは血清学的ピペットを使用してすすぎ、示されるように、関与します。 SLB常駐タンパク質の回収および精製中に界面活性剤の使用は避けるべきです。ときに微量に存在する界面活性剤があっても有意にタンパク質の移動性が低下するからです。すべて一緒に洗剤の必要性を回避するために、分泌されたポリヒスチジンタグを搭載したリガンドの可溶性発現は、哺乳動物細胞や昆虫細胞で推奨されています。大腸菌封入体からのリフォールディングが必要な場合は、注意が彼らの不およびリフォールディングの前に封入体から効果的に界面活性剤を除去するために適用する必要があります。 具体的には、細胞活性化および細胞接着のために与えられた受容体 - リガンド相互作用の役割を分析することができ、それらのモジュール式reconstitutive自然からのSLB結果を採用する主な利点は、。これに関して、DGS NTA-NiはNTA-NI結合部位について競合するタンパク質を防止するために、SLB内の10％に存在するべきであることを言及することは重要です。わずか1％または2％のDGS NTA-Ni系、与えられたポリヒスチジンタグ融合タンパク質種は未発表（第2ポリヒスチジンタグ付きタンパク質種の量の増加を同時インキュベートする場合は特に、気づいたことができるの関連の減少を保有するSLBを使用する場合観察）。 10％DGS NTA-Ni系を搭載したのSLBで作業する場合、この現象は見られません。 我々はDGS NTA-Niを含むのSLBに試験したいずれのポリヒスチジンタグ融合タンパク質の非特異的結合を観察したことがないものの、初めてのタンパク質を導入する際に、この可能性をテストする必要があり、この目的のために、我々はDGS NTA-Ni系（タンパク質が結合してはならない）を欠いているのSLBの使用をお勧めします。 DGS NTA-Niを含むSLBを使用した場合第二に、タンパク質は、PBSを300 mMイミダゾールを含有するSLBを洗浄した後、完全にオフに来る必要があります。 SLBを採用する別の重要な利点は、一時的な相互作用およびシグナル伝達事象を高める時空間解像度17-19で監視することができるということです。三次元的な結合プロセスは、本質的に2つの撮像寸法に縮小されるので、これはノイズ弱毒TIRFモードで記録する場合は特に、少なくとも部分的にあります。 SLBを使用すると、単一分子信号検出、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）または確率的光学再構築顕微鏡（STORM）の前提条件と、回折限界15,16以下の解像度を持つ、すなわち超解像顕微鏡と互換性があります。これらの特別なイメージングモダリティは、単一分子フェルスター共鳴エネルギートラを有効にシナプス環境20内の個々のタンパク質-タンパク質相互作用を可視化するために設計さnsfer実験。このアプローチは、21「FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して結合TCR-のpMHCの測定」と呼ばれるJoveの出版にかなり詳細に説明されています。 SLBベースの実験を解釈すると1は常に生細胞の形質膜のないすべてのプロパティは、SLBのことで紹介されています心に留めておくべきであり、欠けている資質のいくつかは調査中の生理機能に影響を与える可能性があります。結局、SLB-埋め込 ​​まれたタンパク質は、自由に拡散し、その細胞カウンターパートのほとんどは5,6,22であるため膜マイクロドメインに組織化されていません。ある程度の生細胞の細胞膜構造を節約する接着性細胞に由来する固定化された原形質膜シートは、正常Bリンパ球23によって膜に埋め込 ​​まれた抗原の取り込みを研究するために使用されてきました。しかし、このような膜は、非常に動的な細胞骨格と相互作用し、それらは硬質ガラス面でサポートされているとして何の柔軟性を備えていません。これらの不一致を考慮して調整可能な柔軟性の面で、または局所的に適用される光パルスに応じてその剛性を変更する面でサポートされている定義された方法でタンパク質を区分するための手段を提供し、エンジニアリングのSLBの必要性が明らかに存在します。

<table><tbody><tr><td>#1.5 glass slides</td><td>VWR</td><td>631-0853</td><td></td></tr><tr><td>250ml round bottom flask</td><td>VWR</td><td>201-1357</td><td></td></tr><tr><td>50:50 beam splitter cubes</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td></td></tr><tr><td>Acousto-opitcal modulator C1205-2</td><td>Isomet</td><td>-</td><td>only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20009</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>autoclave tape</td><td>VWR</td><td>489-1312</td><td>or any other heat-stable sticky tabe</td></tr><tr><td>Avanti Mini-Extruder</td><td>Avanti Lipids</td><td>610000</td><td>alternative to the bath sonicator</td></tr><tr><td>bath sonicator QSONICA Q700</td><td>QSONICA</td><td>Q700</td><td></td></tr><tr><td>beam splitter</td><td>Cairn</td><td>P280/210/MLS</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi rotary evaporator</td><td>VWR</td><td>531-0837</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td>see manuscript text for alternatives</td></tr><tr><td>concentarted hydrogenperoxide</td><td>Roth</td><td>9683.1</td><td></td></tr><tr><td>concentrated sulfuric acid</td><td>Roth</td><td>X944.2</td><td></td></tr><tr><td>epoxy glue</td><td>Uhu</td><td>45705</td><td>Uhu plus sofortfest 2min</td></tr><tr><td>filter wheel</td><td>Sutter instruments</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>LabTek chambers</td><td>VWR</td><td>734-2062</td><td></td></tr><tr><td>laser&amp;nbsp;</td><td>Toptica</td><td>-</td><td>different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available</td></tr><tr><td>lens</td><td>Thorlabs, Newport</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DGS NTA-Ni (lipid)</td><td>Avanti Lipids</td><td>790404C</td><td>already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended</td></tr><tr><td>POPC (lipid)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850457C</td><td>already in Choroform-solved delivered version is recommended</td></tr><tr><td>microscope Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>mirrors</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>optical filters</td><td>AHF, Chroma, Semrock</td><td>-</td><td>filter sets are available for many different combinations of dyes</td></tr><tr><td>oscilloscope</td><td>BK Precision&amp;nbsp;</td><td>2120C</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>degas before usage</td></tr><tr><td>periscope</td><td>Thorlabs</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>alternative to the epoxy glue</td></tr><tr><td>power meter Lasermate-Q</td><td>Coherent</td><td>-</td><td>any powermeter sensitive in the used spectral range will do</td></tr><tr><td>pulse generator</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SRS DG535&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>spatial filter</td><td>Thorlabs</td><td>KT310/M</td><td></td></tr><tr><td>syringe filter 0.2&amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46</td><td>Zeiss</td><td>440782-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>trichloromethane/chloroform</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>45237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>RC M150GX</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge rotor</td><td>Thermo Fisher</td><td>S120-AT2</td><td></td></tr><tr><td>UV spectrophotometer Nanodrop 2000c</td><td>Thermo Fisher</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>vacuum pump</td><td>VWR</td><td>181-0248</td><td></td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

単一分子蛍光顕微鏡システムのアーキテクチャは 、図2にかなり詳細に概説されている。このような光学部品やその他のハードウェアコンポーネントなどの個々の部品は、導入部で説明されています。 TIRFと非TIRF照明に定義された方法で生じる光学的励起ビーム経路は、示され、5〜図3で説明されています。に位置する第1のペリスコープ鏡の前で50:50のビームスプリッタの位置に注意してください。マイクロメートル翻訳可能な段階（ 図5）。このビームスプリッタは、（緑色で表示）イメージングに使用TIRFビームと（赤で示した）非TIRFビーム（ 図3で説明したように）漂白またはローカル開口定義の光媒介サンプルの活性化のために使用を重畳します。 （オレンジ色で示された図5）合成された光路が反転MICRの背面ポートに二潜望鏡のミラーを介して反射され、oscope。 図4で説明し、 図2に概説したように、2つ、または3つの凸レンズの実装では、レーザビームプロファイルを広げ、TIRFで試料を照射する2平行ビームを生じさせるために対物レンズの後焦点面にレーザ光 ​​を集光しそれぞれ、非TIRFインチ試料上の電力密度を計算するために必要な測定された強度値の一例は、図6に示されている。平均背景信号（画像化のために使用される）照明され、中央部に測定された強度から減算されるように、内の領域において決定されますレーザー光（ ここでは7089カウント）によって照明されていない視野。点灯（1684カウント）、中央エリア（4830カウント）のバックグラウンド補正後の平均強度が、その後積分強度を生じさせるために対応する領域のサイズを乗算している（1.471照射された領域のための ×10 8カウントと中央エリアの3.424×10 7カウント）。中央と照らされた領域内の積分強度の比は、中央エリア（0.23または23％）を照明する全体の電力の割合をもたらします。映画の中で示されるように、全体的なパワーは、非TIRF照明モードでパワーメータを用いて客観的に決定されなければなりません。この例では、このように中央領域内の5ミリワットのx 0.23 = 1.15ミリワットの電力を生じさせる、5ミリワットに調整されます。 1〜2μm程度の例で41.5ピクセル量は、中央領域が7089ピクセル/41.5ピクセル×μmの2 = 170.8 平方 μmの大きさを有しています。このエリア（170.8 平方 μm）により中央エリア（1.15 MW）を照射する光のパワーを分割すること、平均電力が得られ中央エリア内の0.7キロワット/ cm 2の密度。 図7は 、画像や（すなわち10ミリ秒の時間枠で、毎秒100フレーム）迅速に連続して取得し、単一の蛍光色素分子の対応する強度結果を提供しています。強度の定量化のための蛍光シグナルをカバー7（= 49）画素、7つの矩形領域の平均信号は、決定されます。また、バッ​​クグラウンドの平均シグナルは、単一分子信号に近接して7 7ピクセルの矩形領域内で決定されます。バックグラウンド補正された平均値信号（太字で示される）単一分子シグナルを生じる領域内の画素の数（= 49）が乗算されます。 SLBに関連した蛍光標識タンパク質の移動度を評価するために設計された代表的なFRAP実験は図8に示されている。 図8Aに repeti注広がった低強度のイメージングビームと0秒の時点でより狭く、迅速な蛍光色素の切除のための開口部に定義された高強度の光第二の単回使用の的を使用。前漂白剤パルスに初期の平均強度値で規格化された黄色の円内のバックグラウンドを差し引いた平均強度は、蛍光が回復した先の速度と程度を記録するための時間に対して、図8（b）にプロットされています。図に示すように、最初の二層強度の90％以上が（緑の線で示される）蛍光色素アブレーション、次の75秒以内に回復しました。結果として示さSLBに埋め込まれたタンパク質の10％未満は不動です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> SLBシステムの概略1.概要図。 （A）のSLBは、POPC（百分の90から99）と合成脂質DGS NTA-Nで作られていますI（1〜10％）。きれいなガラス表面は、対応する脂質からなるSUV車で充電しているとき、彼らが自発的に形成される。（B）一旦形成されると、これらのSLBは、簡単に可溶性タンパク質で装飾することができますいずれかのCまたはのための12個のヒスチジン（12Hを含むN末端 ​​タグで拡張例共刺激分子B7-1および接着分子ICAM-1）または6個のヒスチジン各（2x6H、例えばαβMHCクラスII二量体）を含む二つのタグで拡張タンパク質二量体。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> 励起および発光ビーム経路の図2の概要。ガスイオンレーザー（例えば、アルゴンやKr + +）は、音響光学MOを用いて高速遮断する動作させることができます<html> dulators。レーザーダイオードは、多くの波長で、今日利用可能であり、それらが電子的にマイクロ秒、怒りに変調することができるような優れた代替手段を表します。レーザビームは容易に2つ（ダイクロイック）ミラーと分割して調整し、二つ以上のビーム経路を生じさせるために、単純なビームスプリッタの使用と組み合わせることができます。この例では、TIRFイメージングビーム（イベントを監視するため）および（漂白剤フルオロフォアまたは開口部に定義された方法で、フォトアクティブケージ分子のいずれかに）漂白ビームが使用されています。両方の励起経路は、追加のシャッターを使用することによって互いに独立して動作させることができます。ペリスコープは、サンプルのTIRF照明を生成するために、対物レンズの後焦点面内で集束レーザ光を変換することができます。蛍光画像は、分光超高感度カメラ（例えば、EM-CCDまたは科学CMOSカメラ）を用いて取得する前に放射ビームスプリッタを使用して分割することができます。.COM /ファイル/ ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> 図3の対物の後焦点面内で集束ビームを変換することによってTIRF照明を調整するレーザ光 ​​の焦点位置を示すように、ビームの移動を介して周囲の中心から対物レンズの後焦点面内でずれています（潜望鏡ミラー構成を使用して）。臨界角は、全内部反射が起こるに到達するまで、結果として平行ビームが傾いた照明で対物レンズを残します。エバネッセント場は、全反射が生じるガラス・メディア・インターフェースで生成される。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">このFiのの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a><html>グレ。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> 図4.単純な光学系は、対物レンズの後焦点面にレーザビームを集束させる。3つまたは二つのレンズは、レーザビームを広げるとTIRF対物レンズの後焦点面上に焦点を合わせるために必要とされます。二つのレンズシステムは、三レンズ系よりも少ないレンズに関連するエラーを含むとTIRFイメージングビームを生成するために適している可能性があります。定義されたビームの広がりとシャープなエッジを持つ照明スポットを目指したときに光活性化または-bleachingを採用した研究のために必要とされるであろうように、3つのレンズは、望ましいかもしれない。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; 図5は、蛍光顕微鏡の背面にあるビーム経路の写真を注釈付き。既に図2に 1杖を概説するように簡単に示されている（非TIRFモード（緑色で示されている）他の2つの励起光、TIRFに1を実装赤）。これらは、50：50ビームスプリッタ（B​​S）を使用して重ねなります。凸面レンズ（L1及びL2）は、対物レンズの後焦点面にそれらを集中するために、それぞれのビームに配置されている（図示せず）。二つのミラー（M1とM2）からなる潜望鏡は、顕微鏡へのエントリのポートを介して両ビームを案内します。第1のミラー（M1）は、TIRF位置にビームの一方を移動させるための（示されるようにマイクロメータねじを回すことにより）平行移動ステージ（TS）を使用して移動させることができます。 TIRFが確立されると、（ここでは赤で示される光退色または - 活性化のために使用される）第2のビームは、非TIRF対物を残す独立TIRFビームを調整することができモード。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> 図6は、照明スポットの中央領域内の電力を測定する。示されたようなイベントは、後に記録される背景を反映して、関心の適当な領域、全体の照明領域（IA）および中央エリア（CA）を、選択しました。 IAおよびCAの記録されたものからバックグラウンド値を減算し、各領域（=積分強度）内に存在する画素数で補正平均強度を乗じて強度を統合します。 CA（：23％この例では）を照射するビームパワーの割合に到達するために、IAのそれによってCAの積分強度を分割します。 5メートル：ここで全体的なビームパワーを（乗算して、CAを照射​​する光のパワーを決定します0.23）：CA（ここでは照明割合はW）。 （：1 / 41.5μmの2ピクセル-1ここ）ピクセル・ツー・エリアサイズ変換係数で：中央領域のサイズを決定するために（7089ピクセルここ）面積を掛けます。 CAを照射励起光の平均電力密度に到達するために、電力分割：（ここで：170.8μmの2）は、CAの大きさ（ここでは1.15 MW）を。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> 単一分子信号の図7.定量。（A）SLB上の単一のフルオロフォアの時間経過。関心領域（ROI、イエロー）の7×7画素サイズの領域を定量するための信号の周りに配置されています。バックグラウンドは、隣接する7×7画素から決定されます。ROI（緑）。（B）定量化し、平均ピクセル強度が表示されます。単一分子の信号を決定するために、バックグラウンド値（緑ROI）が1の蛍光体の単一分子強度を時間に対してプロットされた信号値（黄色ROI）から減算し、49（C）で乗算されます。フルオロフォアが漂白の過程にあるよう90ミリ秒の時点が省略されていることに注意してください。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> SLBの完全性を決定するために（FRAP）解析を光退色後蛍光回復8.図。 （A）に示した実験の（A）は、FRAP実験の全ての10番目の画像が表示されているIEK / MCC-アレクサフルオロ647を担持する二重層について実施した。（B）FRAP定量。値は、漂白前の初期強度（I 0）で割った値（A）に示す黄色のROI内の平均強度（I）を示しています。レッドデータポイントは緑色の線は、元の強度の0.9回復を示し、（A）に表示されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

single-molecule-fluorescence-microscopy-on-planar-supported-bilayers

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K ビュー.  Vienna University of Technology. Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution. 

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Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

工学

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

生物学

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

生物工学

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

生化学

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

神経科学

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

要約

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1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

要約

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1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合