Name: a method for microinjection of patiria minata zygotes
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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同じくらい実用的であるように、15℃ですべての海水や人工海水（SW）、大人の動物、および文化に保管してください。卵と接合体は、SWに浸漬保持されることを確認してください。 蒸留水または逆浸透水で再構成し、商業的に調製された海の塩は、SWの供給源として十分に機能する。比重計を使用して塩分濃度を確認し、最適なレベルを達成するために、塩や水を調整します。 1.020から1.025の比重レベルを保持します。化学物質による汚染を避けるために、他のすべての実験器具から離れたすべてのガラス製品やプラスチック製品を保管してください。脱イオン水または水で数回すすぎ、続いて希次亜塩素酸ナトリウム中で時折浸漬ですすぐことによって、クリーン胚グレードの実験器具。 1 Patiria miniata大人から配偶子の入手方法および成熟<ol><li>生殖腺を切除する動物を選択します。 P.ので卵巣や精巣の存在を探すことによって、切除後のセックスを決定miniataはそれ自体ではありませんxually二形。 </li><li>手術用メスの刃（ 図1A）と海のスターのアームの側面に沿って1センチメートルより大きくない小さな開口部を、カットします。小平滑末端鉗子を使用すると、生殖腺組織にアクセスし、切開を通して生殖腺組織を引き出すために戻っ切開の端を引っ張る。 注：緩い灰色や茶色組織（ 図1B）は、腸組織を、引き出すことは避けてください。精巣は白やベージュで、破壊された時に海水が外観が乳白色または曇った（ 図1D）になることになりますしながら卵巣を、一般的に、オレンジ、黄色、ライトブラウン（ 図1C）である。 </li><li>水槽にメスを返します。処理からストレスが産卵を誘発する可能性があるのでSWの容器内に1〜2時間、男性を分離します。動物は、切開部位に沿って癒し、数ヶ月間、配偶子を提供し続ける。 </li><li>できるだけSWを1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに精巣を収集し、使用するまで氷上で保存する。いずれの精巣を格納しないでくれ週間まで4℃で収集の日にエド。 </li><li> SWの数ミリリットルの小さなガラス培養皿において卵巣を収集します。大きな片がなくなるまで卵巣組織から卵母細胞を解放するには、鉗子の二対で組織を離れていじめる。 注：最適には、卵母細胞の大部分は完全に開発されている。このような卵母細胞は小さく、未開発の卵母細胞のサブセットで、茶色、粒子の粗い、不透明（ 図2B）と比較して、大きな丸い、および卵母細胞における明確な卵核胞（ 図2A）と透明な黄色または淡褐色である。大きな卵母細胞の約25％以上が未発達、さまざまである場合には、卵母細胞を得るために別の女性を選択します。 </li><li> 200ミクロンの孔サイズを有するメッシュフィルターカップを通して卵母細胞および残りの組織を注ぎ、フロースルーを収集します。これは卵母細胞のすべての品種が含まれているが、卵巣組織を削除します。 wを噴霧することにより、フィルタによって捕捉組織から残りの卵母細胞を取り除く噴出ボトルからi番目のSW。フィルターカップを50 mlコニカルチューブ（ 図3A-A &#39;）を用いて行われる。 </li><li>ステップ1.6から100μmのメッシュフィルターカップを通して通る流れを注ぐ。フロースルーの小さな卵母細胞を捨てる。成熟のための準備ができている大規模な完全に発達した卵母細胞をフィルター上に滞在します。清潔な200ミリリットルビーカーに卵母細胞を洗い流す。 </li><li>卵母細胞の200ミリリットルのガラス製ビーカーにSWの95ミリリットルを追加します。 10μMの最終濃度200μMの1 - メチルアデニンの5ミリリットルを追加します。 </li><li> 15℃での大きな浅い培養皿や場所に卵母細胞を転送します。ボリューム培養皿に高い表面積は、酸素交換を可能にする。卵母細胞は成熟していないか、彼らがこの成熟段階の間に超満員のであれば十分に発達しないことがあります。文化が200未満の卵母細胞/ mlになるまで、SWプラス10μMの1 - methlyadenineのいくつかの皿に分割します。 </li><li>卵母細胞は、45〜90分間、成熟することを許可しないが、もはやこのようなfをすることができませんでした卵母細胞をレンダリングしますertilized。成熟が完了したかどうかを判断するには、解剖顕微鏡下で卵母細胞を見てください。卵核胞は向かって移動し、成熟の間に細胞膜と融合する。その後、故障しないため、成熟した卵母細胞（ 図2C）に見えなくなる。 </li></ol>成熟した卵母細胞の受精2。 <ol><li>精巣組織、おおよそ豆粒大、およびSWの約1ミリリットルの小さなガラス製培養皿内のミンチの小規模なクラスタを選択しました。 </li><li>成熟した卵母細胞の周り100mlに得られた乳白色海水の2〜3滴を転送し、混合する培養皿を旋回するパスツールピペットを使用してください。精巣組織片を転送することは避けてください。多精子とその後の現像不良を生じ得る。このように精子のより大量を追加することは避けてください。 </li><li>数分後解剖顕微鏡下で卵母細胞を観察します。受精卵、または接合体は、セルの電源をオフに上昇する明確な泡で受精エンベロープを持つlの膜（ 図2D）。 注：貧しい受精率もよく発達しないことが不健康な文化を示すものであるため、卵の90％未満では受精した場合、培養を続行しないでください。 </li><li>受精が完了した後、100μmのメッシュフィルターを通して注ぐと新鮮なSWを含む培養皿にすすぐことにより接合体で南西に変更します。これは、酸素の欠乏を防止するために、過剰な精子を除去することが重要である。 15〜30分間、15℃で培養皿を置きます。 </li></ol> 3デjellying＆ボートレース受精卵<ol><li> 60×15mmのポリスチレンペトリ皿から蓋を取ることによって、注射の料理を準備します。 <ol><li>マイクロインジェクション顕微鏡での視野と一致する領域の周囲に、皿の裏に油性マジックペンラインを描画します。これは、すべての漕い胚は顕微鏡の視野内にあることが保証されます。 </li><li>サークルに、pを介してラインを獲得するためにガラスパスツールピペットを使用して、参照可能に円形（ 図3B）の一方の側にオフ。注射針（ステップ4.5）を破る後でこの行を使用します。 注：一般的にウニ胚を接着するために使用する試薬、 例えば硫酸プロタミンまたはポリLリシンは、不要である。 P.デ·ゼリー状miniata接合体は、コーティングされていないプラスチックに非常によく付着する。彼らはガラス皿にうまく付着しないように注意してください。 </li></ol></li><li>表面が覆われているように、各皿に周囲の10ミリリットル南西に加えるが、これは行分割胚を乱す可能性がある水が皿に過度に飛散しません。 </li><li> Pを削除する前漕ぎ、酸SWとminiata受精卵ゼリーのコート。このゼリーのコートは、モデルウニ種で観察されるものよりも広範囲である。 <ol><li> pHが4.0から4.2の範囲の酸南西に準備します。 pHは正常な発達を可能にしながら、ゼリーコートの効率的な除去を可能にする非常に重要です。 </li><li> SWの1Lのストックに1 Nのシングル滴（1 M）SW中のHClを追加します。各ドロップが完全に混合させるよりHClを添加する前にpHを監視します。 注：適切なpH中のHCl結果の数mlに対する一つが、一度にボリューム全体を追加しないでください。 注：SWおよび12 ​​N（12M）とヒュームフード中のHClを1NのHClを準備します。 </li><li> 100ミクロンメッシュフィルターにドラッグ注ぐことにより、接合体にSWを取り外します。 （約10ml）可能なSWの最小量で、200ミリリットルのビーカーにすすいでください。酸SW（pH値4.0）と150ミリリットルのビーカーを上に記入し、受精卵は3分間酸SWに座ってすることができます。 </li></ol></li><li> 2 200ミリリットルのビーカーの間を行ったり来たり、それらを注ぐことにより、接合体からゼリーコートをはがし、200ミクロンメッシュフィルターを通して接合体​​を渡すたびに。約2分間の時間窓にわたって5〜10倍の周りのフィルタを介して接合体​​を注ぐ。 </li><li> 100ミクロンメッシュフィルター上に接合体を注ぐことにより、酸南西に削除します。 SWと小さなガラス培養皿に接合体を洗い流す。脱ゼリー状接合体をプラスチック皿に付着することがあります。直ちに行胚;彼らはよりjで生成し始める時間をかけてプラスチック皿に接着不良につながるエリーコート。 </li><li>ガラス培養皿から受精卵をピックアップし、注入皿上の直線にそれらを配置するために口のピペット（ 図3C-C &#39;）を使用してください。ガラスが柔らかくなるまで、炎の上にパスツールピペットの細い辺の中央メルト。すぐにガラスの非常に薄いストレッチを生成するために離れてガラスの端を引っ張る。ガラスがクールになると、（口のピペットを準備する方法の詳細については、ヴェッセルらを参照してください。2004 17または甘いら 、2004 18）パスツールピペットの小端を断つ。 <ol><li>単一の受精卵を一度にピペットを出入りするように、直径が胚の直径よりもわずかに大きいことを漕ぎ、ピペットなどを確認します。これは、単一の行が形成することを可能にします。小径ピペットは、受精エンベロープを除去し、Pとして接合体を崩壊させる可能性miniata接合体ヒアリン膜aを持っていないNDはかなり柔らかいです。 </li><li>接合体は、プラスチックシャーレに付着しない場合は、（さらに数分まで）酸SWで追加の時間のためにそれらを保持します。あるいは小径ピペット接合体をより効果的に固執することを可能にするためにゼリーコートを除去するのを助けることができる。 </li><li>受精卵は、わずかにプラスに浮揚され、浮動小数点型またはちょうど皿の底の上に置く傾向がある。彼らはピペット（ 図3D）を終了として接合体を穏やかに皿の表面に押し付けているように、この場合には、ローイングピペットを配置。 注：これらの皿に多くの行に合わせて許されるP.。 miniata胚性膜は、時間をかけて浸透することがより困難になることはないので、1は、単一の皿の上に接合体の数百を注入することができる。 </li></ol></li></ol>接合体の4インジェクション<ol><li>最終濃度で、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（MASO）の適切な濃度の注射液を準備したmRNA、またはDNAを200のKClのentration。 400-800μMMASOおよび2.5ngのDNA /μlの毒性を最小限に抑えながらモルファントの表現型を生成する傾向がある。卵中の最終濃度は、出発濃度14番目 1/125になります。 5分間65℃にMASOs、熱を含有する注射液に使用し、常温で保存する直前。 <ol><li>注入した胚を選別を容易にするために、0.1％の濃度を得るために、注射液にローダミンデキストラントレーサーを加える。 </li></ol></li><li>製造者の指示に従って機器を引っ張っ針でガラスキャピラリーチューブ（1.0ミリメートル外径×0.75 mm内径、長さ100mm）を引いて、注射針を準備します。ウニ内注射に適した針は、海の星のために働くので、同様のパラメータ19を使用しています。 </li><li> microloaderピペットチップを使用して注射針への注入溶液約2μlのをロードします。 </li><li> Mに針の鈍端を差し込みanipulator。 100ミリ秒パルスと40 PSIの空気圧にpicospritzerを設定してください。 </li><li>顕微鏡ステージ上に漕いだ胚の皿を置き、視野内の全ての胚を持っている。割線が針に最も近い側になるように、料理を方向付ける。先端がラインの中央付近に、ちょうど水面より上になるように約60°の角度で針を配置します。 </li><li>得点ラインに焦点を当て、先端が焦点になるまで針を下ろします。もう少しヒントを下げ、ゴールラインの尾根にゆっくりと実行して開いたそれを破る。皿の表面から先端部を持ち上げ、受精卵の最初の行の一番上にそれを置き、接合体に焦点を当てています。 </li><li>それが60度角の周囲から入ってくる受精卵の中心を突き刺すするような先端を下げます。針は簡単にPを貫通するminiata接合体。麟蹄のボーラスを紹介するフットペダル（または注射針から物質を強制的に他の手段）の手順胚へのctionソリューション。 </li><li> 20〜30％の胚の直径であり、または25〜80 plのボーラスを目指す。ボーラスがこれより大きいか小さい場合、picospritzer上の注入の持続時間を調整し、次の胚を注入する。希望ボーラスサイズを得るために継続時間を調整して続行します。 100ミリ秒の期間で開始します。約200ミリ秒より大きく、適切なボーラスを導入するために必要な場合は、針を再分割します。針を破棄し、針のサイズが大きすぎて正常な発達を混乱させる可能性がある未満15〜20ミリ秒、このボーラスサイズを取得するために必要とされる場合は、新しいものを用意します。 </li><li>注射皿に残った受精卵を注入するに進みます。胚は容易に劈開が開始されるまで第一の切断後の単一割球に注入することができる。定期的に針の上に付着した接合体を除去するために水の表面から針を持ち上げます。必要に応じて、針の先端を再ブレークや閉塞が発生した場合、新しい針をロードします。 </li></ol><ol><li>胚は、SWで15℃で開発することができます。酸素交換を可能にするために培養中で体積に対する高い表面積を維持します。胚が混雑していないことを確認。 200胚/ mlで以下に文化を保持します。胚の所望の段階に応じて、周囲の20〜24時間後に受精時に注入された胚を収集するために計画しています。 注：これは、多くの場合、ソートし、収集するための理想的な時間であり、通常、発生中の胚を容易に形態的に区別されているので、まだ泳いでいません。 </li><li>胚は孵化している場合は、ゆっくり水泳を防ぐためにショックを塩。優しく南西に旋回しながら、注射皿にSWの10mlに5M NaClを200μlのを追加します。数分後、胚は皿の底に落ちる。これらを収集し、通常の塩分SWに移動します。 </li><li> injectiで使用トレーサーと互換性の適切な蛍光光源の下で注入した胚を収集ソリューションの。何トレーサーを使用しなかった場合は、正常な形態を選択するために胚を並べ替える。 </li><li>口のピペットを用いて、SWの最少量の蛍光胚を策定し、SWで満たされた小さな培養皿にそれらを吹き飛ばす。理想的な口のピペットは、それらを損傷することなく、内外に引っ張られる胚のための十分な大きさの開口部を持っていますが、望ましくない胚および外来のSWはまた、プルアップされているほど大きくはない。 </li><li>一旦全ての目的の胚のは、新たな皿に収集された、蛍光灯の下で胚を観察し、あらゆる非注入胚または未発達の胚を取り除く。 </li><li>文化インキュベーター内で目的の段階に胚を選別し、イメージングまたは他の所望のプロトコルを進める。 </li></ol>

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著者によって公表された関心の競合はありません。

この技術の初心者ユーザーにとっては難しいですが、成功したモルファント胚を作成するために不可欠であるつの重要なステップがあります。最初は成熟し、適切に受精されます健康的な卵母細胞を選択している。培養中の正常な発達の割合は季節によって異なり、動物の健康、および卵母細胞は、単一の個体から採取された回数。卵母細胞は、10月まで4月から、より良い品質のものになる傾向があります。それは、大部分が、図2Aのではなく、 図2Bのように見えることを保証するために進む前に、卵母細胞を注意深く見ることが重要である。それは、卵母細胞が処理されるようにフィルタリングするのに十分に小さい場合は特に、成熟していないであろう卵母細胞の数が少ないために許容される。時折、未開発である卵母細胞の成熟の準備ができている、完全に発達した卵母細胞とほぼ同じ大きさである。彼らは、粒子の粗い、茶色colorinによって区別されグラム（ 図2E）。ろ過は未開発の卵母細胞から十分に発達した卵母細胞を分離せず、彼らはしばしば、図5に見られる欠陥を発揮する可能性が高い異常な胚培養につながるため、この種の卵母細胞のバッチを使用しないでください。 他の重要なステップは、注入ボーラスサイズです。効果を発揮するのに十分に大きいが、非特異的効果を引き起こすほど大きくない摂動試薬の量を導入する。摂動試薬が最初に使用されるとき、それは試薬のいくつかの濃度が試行される滴定を行うことが有用である。予想される表現型、または遅延の開発（ 図5A）とは無関係な発達異常を生じない最も高い濃度とのその後の微量注入を実行します。これは正常な発達を混乱させる可能性がある胚の直径30％以上であるボーラスを注入することは避けてください。共同による過度の小さなボーラスサイズ、ntrast、視覚的に複製物全体の摂動の表現型の過剰な範囲につながる可能性が一貫してサイジングを検査するのが困難である。 摂動試薬は、有効濃度範囲で発達の遅れまたは非特異的表現型を引き起こすことがある。したがって、そのような標準コントロールMASO、標準的なDNA構築物、またはローダミントレーサーとして良性試薬と兄弟コントロールを注入するために、非常に重要である。これらのコントロールは、正常な発達を示した場合にのみ、アッセイモルファント胚。コントロールを含む注入された胚は、、時にはしわの胞胚表現型を示すが、それらはしばしば、通常、開発の残りの部分を続行します。特定の試薬が一貫して得られたモルファント胚で発達の遅れが発生した場合に加えて、彼らが経験しているどのように多くの遅延時間を決定するために胚を制御するためにこれらの胚を比較します。 s内のその有用性を制限する可能性が、この方法のいくつかの属性があります。重特異実験的なシナリオ。このような問題の1つは1つが唯一の受精卵または初期卵割段階での試薬を導入することができるという事実である。目的の遺伝子または経路は、生存不能初期発生し、得られたモルファントの胚において特に重要であるか、または意味のある研究にすぎ発達異常である場合、これは特に問題である。時には、この問題は、穏やかな、不完全なノックダウンをもたらし、摂動試薬の少ないコピーを注入することによって解決されます。標的遺伝子または経路のために適切な細胞透過性薬剤が存在する場合、それは後に、より適切な段階で、薬剤で処理胚を受精卵の段階で試薬を注入した胚の表現型を比較す​​ることが有用である。 MASOsまたはmRNAの注射は、より大きな特異性を提供するので、薬物治療に有利にマイクロインジェクションを放棄とは対照的に、薬物治療の研究に関連してこの方法を用いることがより強力である。 最後に、このマイクロものの注入法は、せいぜい、数百から千健康な、正常に注入した胚を生成し、下流の広範囲の用途のための胚の十分な量を生成する。いくつかの目的の実験はこれよりもかなり多くの材料が必要な場合があります。この方法は新規であり、まだ広く使用を獲得していないが、正常ウニシステムで使用される他の方法は、そのような汎親和性レトロウイルス20モルファントヒトデ胚のより大きな数を作成するために修正されてもよい。

（一般的にバットのスターとして知られている）、海の星、Patiria miniataは 、6〜8の進化の4,5発達セルラー1-3さまざまな、、、と生態研究の9〜11のために興味深く、汎用性の高いモデル系として浮上している。大人P. miniataバハカリフォルニア州から12のシトカ、アラスカから太平洋岸に沿って分布していると容易に海洋水槽で維持される。卵母細胞を得一年中であり、それぞれの女性は、数万の卵万のを流すことができます。卵母細胞は、容易に成熟し、外部から13受精されている。生じた胚は容易な観察を可能にする透明であり;彼らは同期的に開発し、開発のための唯一の海水を必要とします。全ゲノムアセンブリおよび複数のトランスクリプトームはまた、P.ご利用いただけますminiata（ <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ）。このような利点は、研究の範囲に最適ですおよび教育目的。 近年では、P。 miniataが発生遺伝子制御ネットワークのモデル系が14〜16を分析するとなっています。このような研究の目的は、調節遺伝子の全体の賛辞を特定し、それらの相互作用のネットワークを決定することです。この仕事の多くは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入によって、またはインビトロ合成されたmRNA の遺伝子発現を乱すことを伴う。さらに、 シス調節因子の分析は、調節DNA 15の機能を特徴付けるために使用される。これらの分析は、摂動試薬および/またはDNAレポーターは胚に構築の導入を必要とします。さらに、これらの摂動の下流効果を特徴付けるために、一つの潜在的標的の遺伝子発現の変化のために多くの胚を分析しなければならない。受精卵の数百のマイクロインジェクションのための技術は、この作品のための中心である。 P.含む棘皮動物、 miniata </em&gt;の、性的に成熟するために何ヶ月を必要とします。このために、実験のためのこれらの動物のトランスジェニック系統を開発し、維持するために、一般的には実用的ではない。したがって、トランスジェニック大人の繁殖を効率的に修正された胚を作成することはできません。その代わりに、摂動は、マイクロインジェクションを介して新たに発生する必要があります。マイクロインジェクションは細胞透過性ではない試薬で胚を修正する機会を提供しています。以下のプロトコルは、マイクロインジェクションを介して座って1〜3時間で受精卵の数百にDNA、mRNAは、細胞トレーサー、およびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​導入する方法を説明している。これは、in situハイブリダイゼーション 、RNA-配列、およびウェスタンブロットで 、含む下流の実験のさまざまな十分な材料を生成するが、これらに限定されない、定量PCR。

<table><tbody><tr><td>1-Methyladenine</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>For pulling microinjection needles</td></tr><tr><td>Model P-97 Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Also available in many pet stores</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

棘皮動物は、長い生殖と発達の研究のための好みのモデルシステムであって、より最近では発生過程の遺伝子調節と進化の研究のためにしている。海の星、Patiria miniataは 、以前にウニ、StrongylocentrotusのpurpuratusとLytechinus variegatusでほぼ独占的に実施された研究は、これらのタイプのためのモデル系としての有病率を集めています。これらのモデル系の利点は、特定の遺伝子がアップまたはダウンレギュレートされている修飾された胚、細胞群を標識する、またはレポーター遺伝子を導入することを生産する容易さである。単一のマイクロインジェクション法は、そのような改変された胚の多種多様を作成することが可能である。ここでは、Pから配偶子を得るための方法を提示miniata、接合体の生産、およびマイクロインジェクションを介して、摂動の試薬 ​​を導入する。健康なモルファント胚はその後、GEの定量的および定性的研究のために隔離されているNEの機能。この生物のためのゲノム及びトランスクリプトームデータの利用が行われた研究し、それらを実行の容易さの種類が増加している。

このプロトコルの目的は、胚に試薬を導入することである。私たちは、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を駆動するDNAレポーター構築物を注入することにより、プロトコルの有効性を示す。 DNAは初期の切断中に組み込んだとして注入した胚は、クローン性のパッチ（ 図4A-B）に、GFPを発現する。胚に導入することが望ましいです多くの試薬が大量にかつ胚の次善のバッチに有毒である。毒性は早期の切断や受精卵の段階で、または（ 図5A-C）異常 ​​な開発を課すことによって進行を止めること、開発を遅らせることによって現れる。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig1highres.jpg" width="500" /> Pから図1の取得配偶子miniata大人。 A）生殖腺を切除するアームの近位側の切開を作るこの切開部から引き出され、暗褐色物質）動物。Bの中央に腸組織である。卵巣組織が ​​ここに示されているように、通常、色はオレンジ色ですが、また、黄色や明るい茶色でもよい）、C。は、動物を傷つけるよう腸組織を引っ張ることは避けてください。D）精巣示すように、カラーで白やベージュです。スケールバーはすべて1cmに示す。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig2highres.jpg" width="500" /> 図2の成熟と卵母細胞の受精。 A）成熟のための準備ができている健康的な卵母細胞は、目に見える卵核胞を持つ大規模かつ明確である。B）成熟のための準備ができていない卵母細胞は、外観、小さい茶、粗くている。C）1-メチルアデニンで成熟してきた卵母細胞。卵核胞が故障した。D）FERTに囲まれた受精卵をilizationエンベロープ。E）は、これらの卵母細胞は濾過により除去されないために成熟することができない大規模な卵母細胞と培養液を避けてください。このような卵母細胞は、Aのものよりわずかに小さく、暗い茶色と粒子の粗い質感のです。 A中のスケールバーは、50μmを示し、画像のAEのスケールを表します。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig3highres.jpg" width="500" /> 組み立てに3の装置の図。 AA &#39;）を50mlのコニカルチューブに固定メッシュフィルタ。 60×15mmのポリスチレン培養皿の蓋から構成され、管のテーパー端と蓋の中央には、培養物は、チューブ及びフィルターを通して注ぐことができるように切 ​​り出す。B）注射ディッシュ。中心の周りに描かれた円は、注射用顕微鏡の視野を概説し、ローイング胚のためのガイドとして役立ちます。行は、int型を獲得料理は注射針を壊すのに便利です。C-C &#39;o）の口ピペットセットアップ。いくつかの足の長いゴム管の一端にマウスピースを取り付けます。簡単に溶融により成形されたパスツールピペット、もう一方の端を取り付け、回路図は、胚にダメージを与えることなく、付着し促進するための理想的なローイングパスツールピペットの形状や幅を示す）は 、ガラス、Dの狭い方の端を引っ張る。引っ張らピペットの外端を壊すときに端が皿から離れて浮遊から出現受精卵を防止するために、先細になっている場合に便利です。スケールバーはすべて3センチメートルを示している。 <img alt="図4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig4highres.jpg" width="400" /> 図4：試薬に成功マイクロインジェクションによって導入されました。 A）GFPレポータープラスミドを注入した胞胚期胚のDIC。胚が正常な形態を持っています。B）のGFP expreCからのA. Cに示した胚におけるssion）2形態学的に正常胞胚期胚のDIC画像。D）ワン胚はテキサスレッドデキストランの導入から赤色の蛍光を発する。他の胚は、非注入され、蛍光を示さない。スケールバーは50μmでを示している。 A中のスケールバーは、C、AとBのスケールバーのスケールを表し、CとDのスケールを表し、 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig5highres.jpg" width="500" /> 図5オーバーインジェクションや逮捕または異常な開発中の試薬 ​​の毒性結果。すべての画像が同じ注入バッチから胚24時間後の注射である。A-A &#39;）1細胞期で逮捕overinjected受精卵。B-B&#39;）胚が逮捕初期の切断を。この胚は逮捕されている間、健康な胚は、対称的に分割します異常な細胞分裂に起因する。C-C &#39;）毒性による乱暴に異常な開発に胚。この胚は、胞胚おおよそ胚（D）のような形をしているが、それは非対称で異常に肥厚している。DD &#39;）Aは、適切に開発胞胚期胚に注入した。 A中のスケールバーは50μmでを示し、すべてのパネルのスケールを表します。

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。

のマイクロインジェクション法<em&gt; Patiria minata</em&gt;接合体

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K ビュー.  Carnegie Mellon University. モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。 

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

遺伝学

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

発生生物学

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

生物学

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

アノフェレスガンビア胚の微小注入法

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

モデル遺伝生物として使用するためのメダカ胚のマイクロインジェクション

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュへのマイクロインジェクション法

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

のマイクロインジェクション法

要約

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この動画の章

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

アノフェレスガンビア胚の微小注入法

モデル遺伝生物として使用するためのメダカ胚のマイクロインジェクション

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

ウニ接合体のハイスループットマイクロインジェクション

ゼブラフィッシュへのマイクロインジェクション法

のマイクロインジェクション法

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家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

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最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

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マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

ゼブラフィッシュへのマイクロインジェクション法

ウニ接合体のハイスループットマイクロインジェクション