Name: a method for microinjection of patiria minata zygotes
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע IOS 0844948 וIOS 1024811

<ol>
	<li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens,+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes.">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li><li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes.">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li><li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization.">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li><li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development.">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li><li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning.">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li><li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms.">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17 (2012).</li><li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star.">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68 (2013).</li><li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae.">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li><li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin.">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li><li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species.">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li><li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential.">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li><li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).</li><li>Dor&#233;e, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+meiosis:+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes.">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution.">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+evolutionary+act:+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins.">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li><li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos.">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li><li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes.">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li><li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomere+isolation+and+transplantation.">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li><li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים שהוכרזו על ידי המחברים.

ישנם שני שלבים קריטיים שקשה עבור משתמשים מתחילים בטכניקה זו, אך הם חיוניים ליצירת הצלחת עוברי morphant. הוא הבחירה הראשונה ביציות בריאים שתבשלנה ולדשן כראוי. אחוז של התפתחות נורמלית בתרבות תלויה בעונה, על בריאותם של בעלי החיים, ואת מספר פעמים שביציות כבר נקצרו מאדם אחד. ביציות נוטות להיות באיכות טובה יותר מאפריל עד אוקטובר. חשוב לבחון בזהירות את הביציות לפני שתמשיך כדי לוודא שהרוב נראה כמו איור 2 א ולא איור 2. מותר לי מספר קטן של ביציות שאינם בשלות, במיוחד אם הם קטנים מספיק כדי לסנן כביציות מעובדות. מדי פעם, ביציות שאינן מפותחים כמעט גדולות כמו ביציות שפותחו באופן מלא כי הם מוכנים להתבגרות. הם נבדלים על ידי colorin המגורען, החום שלהםg (איור 2E). אל תשתמשו בקבוצות של ביציות מסוג זה, כי סינון לא לבודד ביציות שפותחו באופן מלא מביציות לא מפותחות והם לעתים קרובות תוצאה בתרבויות עובר לא נורמליות שיש סיכוי גבוה יותר להציג את הפגמים ניתן לראות באיור 5. השלב הקריטי האחר הוא גודל בולוס ההזרקה. להציג את הסכום של מגיב מדאיג כי הוא גדול מספיק כדי להפעיל השפעה, אבל לא כל כך גדולה כמו לגרום לתופעות שאינן ספציפיות. בפעם הראשונה שמגיבה מדאיג משמש, כדאי לבצע טיטרציה שבכמה ריכוזים של מגיב הם ניסו. בצע microinjections הבא עם הריכוז הגבוה ביותר שאינו גורם למומים התפתחותיים שאינם קשורים לפנוטיפ הצפוי, או פיתוח עיכוב (איור 5 א). הימנע מהזרקת בולוס כי הוא גדול יותר מ30% הקוטר של העובר כמו זה עלול לשבש את ההתפתחות תקינה. גדלי בולוס יתר על המידה קטן, על ידי שיתוףntrast, קשה לבדוק מבחינה ויזואלית לשינוי גודל עקבי אשר יכול להוביל למגוון מוגזם של פנוטיפים ההפרעות פני משכפל. ריאגנטים מדאיגים עלולים לגרום לעיכובים התפתחותיים או פנוטיפים שאינם ספציפיים בטווחי ריכוז יעילים. זה מאוד חשוב, ולכן, כדי להזריק בקרות אח עם מגיב שפיר כגון שליטה סטנדרטית Maso, בונה DNA סטנדרטית, או נותב rhodamine. עוברי morphant assay רק אם בקרות אלה מראות התפתחות תקינה. עוברים מוזרקים, לרבות בקרות, לפעמים להפגין פנוטיפ blastula מקומט אבל הם לעתים קרובות ימשיכו דרך שאר התפתחות בדרך כלל. בנוסף, אם מגיב מסוים גורם באופן עקבי עיכובים התפתחותיים בעוברי morphant וכתוצאה מכך, להשוות עוברים אלה כדי לשלוט עוברים כדי לקבוע כמה שעות של עיכוב שהם חווים. יש כמה תכונות של שיטה זו שעלולה להגביל את השימושיות שלה ביםתרחישים ניסיוניים pecific. נושא אחד כזה הוא העובדה שאחד יכול רק להציג את חומרים כימיים בביצית מופרה או שלבי מחשוף מוקדמים. זו היא בעייתית במיוחד אם הגן או המסלול של ריבית הוא קריטי במיוחד בהתפתחות מוקדמת ועוברי morphant הנגזרים inviable מדי או מבחינה התפתחותית נורמלי למחקר משמעותי. לפעמים בעיה זו נפתרה על ידי הזרקת כמות עותקים קטנים של המגיב המדאיג, וכתוצאה מכך מציאה עדינה, לא שלמה. אם תרופת תא חדיר מתאימה לגן המטרה או מסלול קיימת, כדאי להשוות את הפנוטיפ של עוברים מוזרקים עם ריאגנטים בשלב הביצית המופרה עם עוברים שטופלו בתרופה בשלב מאוחר יותר, מתאים יותר. בגלל זריקה של משוש או mRNAs מציעה לפרט יותר, הוא חזק יותר להשתמש בשיטה זו בשילוב עם מחקר תרופה לטיפול בניגוד לנטישת microinjection לטובת טיפול תרופתי. לבסוף, למרות שמייקרו זהשיטת הזרקה תפיק כמות מספקת של עוברים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם, זה במקרה הטוב יהיה לייצר כמה 100-1000 עוברים בריאים, שהוחדרו בהצלחה. כמה ניסויים רצויים עשויים לדרוש הרבה יותר חומר מזה. שיטות אחרות המשמשות בהצלחה במערכת קיפודי הים עשויים להיות שונה כדי ליצור מספרים גדולים עוד יותר של עוברי כוכבים ים morphant, כגון רטרווירוסים pantropic 20, למרות ששיטה זו היא חדשנית ועדיין לא זכתה לשימוש נרחב.

כוכב הים, Patiria miniata, (הידוע בכינויו כוכב העטלף) מסתמן כמערכת מודל מעניינת ותכליתית עבור מגוון רחב של 1 סלולארי 3, התפתחותיות 4,5, אבולוציוני 6 8, ומחקרים אקולוגיים 9- 11. פ למבוגרים miniata מופצים לאורך חוף האוקיינוס ​​השקט מסיטקה, אלסקה לאחה, 12 קליפורניה ונשמר בקלות באקווריום ימי. ביציות הן ימות השנה ברת השגה וכל נקבה יכולה לשפוך עשרות אלפי ביצים. ביציות הבשילו בקלות ומופרה חיצוני 13. העוברים וכתוצאה מכך הם שקופים ומאפשרים להתבוננות קלה; הם מפתחים באופן סינכרוני, ודורשים מים ים רק לפיתוח. הרכבה הגנום כולו וtranscriptomes מרובה זמינות גם עבור P. miniata <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">(Echinobase.org).</a> יתרונות כגון להפוך אותם אידיאליים עבור מגוון רחב של מחקרומטרות הוראה. בשנים האחרונות, פ &#39; miniata הפך מערכת מודל לרשת רגולציה גן התפתחותי מנתחת 14- 16. מטרת מחקרים מסוג זה היא לזהות את כל המחמאה של גני רגולטורים ולקבוע את הרשת של יחסי הגומלין שלהם. חלק ניכר מהעבודה כרוכה בביטוי גנים מדאיג דרך כניסתה של oligonucleotides antisense או בmRNAs מבחנה מסונתזת. בנוסף, ניתוחי רגולציה cis משמשים כדי לאפיין את הפונקציה של DNA הרגולציה 15. ניתוחים אלה דורשים הקדמה של חומרים כימיים ההפרעות ו / או כתב הבונה DNA לעוברי. יתר על כן, כדי לאפיין את ההשפעות במורד הזרם של הפרעות אלה, יש assay עוברים רבים לשינויים בביטוי הגנים של מטרות פוטנציאליות. טכניקות לmicroinjection של מאות רבות של zygotes הן מרכזיות לעבודה זו. Echinoderms, כולל P. miniata </em&gt;, דורש חודשים רבים כדי להגיע לבגרות מינית. בגלל זה, זה בדרך כלל לא מעשי לפתח ולשמר קווים מהונדסים של בעלי חיים אלה לניסויים. לכן, גידול של מבוגרים מהונדסים לא יכול ביעילות ליצור הותאם עוברים. במקום זאת, צריכה להתרחש ההפרעות דה נובו באמצעות microinjection. Microinjection מציע הזדמנות לשנות עוברים עם ריאגנטים שאינם תא חדיר. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה להציג את DNA, mRNA, קליעים נותבים תא, וoligonucleotides antisense morpholino למאות ביצים מופרות בשעה אחת 2-3 יושבת דרך microinjection. זה מייצר חומר מספיק עבור מגוון רחב של ניסויים במורד הזרם כולל, אך לא מוגבל ל, qPCR, הכלאה באתר, RNA-Seq, ומערבי סופג.

<table><tbody><tr><td>1-Methyladenine</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>For pulling microinjection needles</td></tr><tr><td>Model P-97 Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Also available in many pet stores</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Echinoderms כבר זמן רב מערכת מודל מועדף למחקרים של רבייה והתפתחות, ולאחרונה לחקר ויסות הגנים והאבולוציה של תהליכים התפתחותיים. כוכב הים, Patiria miniata, הוא צובר שכיחות כמערכת מודל למחקרים מסוג שבוצעו באופן כמעט בלעדי בעבר בקיפודי הים, purpuratus Strongylocentrotus וvariegatus Lytechinus. יתרון של מערכות מודל אלה הוא הקלות של יצירת עוברים שונה שבגן מסוים הוא למעלה או downregulated, תיוג קבוצה של תאים, או החדרת גן כתב. שיטת microinjection בודדת מסוגלת לייצר מגוון רחב של עוברים שונה כגון. כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תאי רבייה מפ miniata, הפקת zygotes, והחדרת חומרים כימיים מדאיגים באמצעות microinjection. עוברי morphant בריאים מבודדים לאחר מכן למחקרים כמותיים ואיכותיים של geפונקצית ne. הזמינות של נתוני הגנום וtranscriptome לאורגניזם זה הגדילה את סוגי מחקרים שמבוצעים ואת הקלות של ביצועם.

המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את חומרים כימיים לעוברי. אנו מדגימים את היעילות של הפרוטוקול על ידי הזרקה לבנות כתב DNA שמניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). עובר מוזרק להביע GFP בתיקונים משובטים (איור 4A-B) כDNA משלב במהלך המחשוף מוקדם. ריאגנטים רבים הנמצאים רצויים להציג לעוברי הם רעילים בכמויות גבוהות וקבוצות לא טובות של עוברים. מניפסטים רעילות על ידי עיכוב התפתחות, שעצר את הפיתוח במחשוף מוקדם או בשלב הביצית המופרה, או על ידי הטלת פיתוח חריג (איור 5A-C). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 תאי מין קבלת מפ מבוגרים miniata. ) כדי לכרות בלוטות מין עושים חתך בצד של הפרוקסימלי זרועלמרכזו של בעל חיים. B) חומר החום הכהה משך מהחתך הזה הוא רקמת מעי. הימנע ממשייכת רקמת מעי כפי שיפגע בבעלי החיים. C) רקמת שחלה היא בדרך כלל בצבע כתום כפי שמוצג כאן, אבל יכול להיות גם צהוב או חום בהיר. אשכי D) הם לבנים או בז&#39; בצבע, כפי שמוצגים. כל הברים בקנה מידה נסמן 1 סנטימטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig2highres.jpg" width="500" /> איור התבגרות .2 והפריה של ביציות. ) ביציות בריאים כי הם מוכנים להתבגרות הן גדולות וברורות עם שלפוחית ​​נבטיה גלויה. B) ביציות, כי הם לא מוכנים להתבגרות הם קטנים יותר, בצבע חום, ומגורענים במראה. C) ביצית שכבר התבגרה עם 1-methyladenine . השלפוחית ​​הנבטיה התקלקלה. D) הזיגוטה המוקפת FERTמעטפת ilization. E) הימנע מתרבויות עם ביציות גדולות שלא ניתן התבגרו כי ביציות אלה לא יוסרו על ידי סינון. ביציות כאלה הן מעט קטנות יותר מאחד בא &#39;והם בצבע חום כהה ומרקם מגורען. סרגל קנה המידה במציין 50 מיקרומטר ומייצג את קנה המידה עבור תמונות AE. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 מכשירים להרכבה. AA &#39;) מסנן רשת המחובר לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל. מחודד הקצה של הצינור ואמצע המכסה נחתכים החוצה כדי לאפשר לשפכו תרבויות דרך הצינור ומסנן. צלחת הזרקה בנויה מהמכסה של צלחת תרבות קלקר 60 x 15 מ&quot;מ B). מעגל נמשך סביב המרכז מתאר את שדה הראייה של המיקרוסקופ ההזרקה ומשמש כמדריך לעוברי חתירה. שורת הבקיע into הצלחת שימושית לשבירת מחטי הזרקה. הגדרת פיפטה הפה CC &quot;). תתאים שופר לקצה אחד של צינור גומי ארוך ברגל כמה. התאם את הקצה השני לפיפטה פסטר, שעוצב על ידי התכה בקצרה ומושך את הקצה הצר של זכוכית. D) סכמטי הוכחת חתירה צורה אידיאלית פסטר פיפטה ורוחב כדי לקדם את דבק מבלי לפגוע בעוברים. כאשר שוברים את הסוף את של פיפטה משכה, זה מועיל אם הסוף הוא מחודד כדי למנוע zygotes מתעורר מצף מהצלחת. כל הברים בקנה מידה נסמן 3 סנטימטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig4highres.jpg" width="400" /> ריאגנטים .4 איור הציג בהצלחה על ידי Microinjection. ) DIC של עובר שלב blastula מוזרק עם פלסמיד כתב GFP. יש עובר מורפולוגיה נורמלית. expre B) GFPssion בתמונה DIC של שני עוברי מורפולוגית נורמלים שלב blastula. ד) העובר אחת מC העובר מוצג בC א) פולט קרינה אדומה מההקדמה של dextran טקסס האדום. העובר השני הוא מוזרק האו&quot;ם ומציג שום הקרינה. ברים סולם לציין 50 מיקרומטר. סרגל קנה מידה במייצג את קנה המידה ולB. סרגל קנה מידה בC מייצג את קנה המידה לC וד <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5 Overinjection ותוצאת רעילות מגיב בנעצר או פיתוח חריג. כל התמונות הן של עוברים 24 שעות שלאחר הזרקה מאותה אצווה הזרקה. AA &#39;) הזיגוטה overinjected נעצרה בשלב אחד התא. BB &quot;) נעצר עובר במחשוף מוקדם. עובר בריא יחלק באופן סימטרי, ואילו נעצר עובר זהעקב חלוקות תא נורמליות. CC &quot;) עובר עם פיתוח בפראות חריג בשל רעילות. בעוד עובר זה בצורה פחות או יותר כמו עובר blastula (ד &#39;), זה לא סימטרי ואופן חריג מעובה. DD&#39;) כראוי פיתוח הזריק blastula עובר שלב. סרגל קנה מידה במציין 50 מיקרומטר ומייצג את קנה המידה לכל הפנלים.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של<em&gt; Minata Patiria</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K Views.  Carnegie Mellon University.  שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה. 

Video: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genetics

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Developmental Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

טכניקות מיקרו-ההטחה של דגי זברה

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

שיטה לMicroinjection של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video