マウスモデルにおけるマイクロコンピュータ断層撮影法と採血を用いた肺結節進行のモニタリング

このプロトコルは、肺結節を研究するための効率的でシンプル、かつ低侵襲の方法を説明しています。顎下静脈採血とマイクロCTイメージングは、調査技術として使用されます。

マイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)は、肺結節(PN)から肺がん(LC)までの変化を監視するための、リアルタイムで直感的で高感度の低侵襲技術です。顎下静脈の血液サンプリングの統合により、PNからLCへの進行中のイメージングと主要なターゲットの変化を迅速、安定、かつ簡単に検出できます。本研究では、A/Jマウスに4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノンを100mg/kg投与し、肺腺がんモデルを開発しました。次に、実験動物の疾患進行を顎下静脈採血とマイクロCTアッセイを通じて監視しました。実験結果では、10^週目 までに一部の動物の肺に結節性病巣が存在することが示され、21^週目 までに肺腺癌画像の発達が明らかになりました。結論として、マイクロCTはマウスの肺の病理学的変化を効果的に観察でき、顎下静脈の採血と組み合わせると、血液、タンパク質、および標的の変化を動的に監視できます。この方法は、薬物スクリーニング、薬物動態試験、毒物学的実験、および安全性試験のための非常に特異性で、シンプルで、感度の高いアプローチを提供します。

肺がん(LC)は、気管支粘膜または肺腺に由来する重度の新生物です。2021年の統計によると、LCは毎年世界中で約200万人の死亡者を引き起こしており、発生率と死亡率は上昇しています¹。LCの早期診断と介入は、治癒率の向上、死亡率の低下、および治療費の削減に貢献します。肺結節 (PN) は LC の特異的な前駆体であり、放射線検査で直径 ≤30 mm の局所的で丸い、より密度の高い固体または亜固体の影を特徴とし、肺虚脱、縦隔リンパ節肥大、または胸水² の証拠はありません。2022 年の National Comprehensive Cancer Network (NCCN) は、PN を数、直径、密度で分類し、右肺³ の 5 mm の孤立したすりガラス状結節などの組み合わせを特定しました。しかし、NCCNのガイドラインでは、PNの悪性腫瘍のリスクは結節の直径と量とともに増加することが示されています。低線量コンピューター断層撮影法の広範な適用により、PN診断は劇的に増加し、毎年数百万人の新しい症例が特定されています⁴。

A/Jマウスと4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)の組み合わせは、肺がん(^{LC)に対して}最も一般的に使用される動物モデルです^5,6。顎下静脈の採血と並行してマイクロCTを使用することは、肺結節(PN)からLCへの変化をリアルタイムでモニタリングするための効果的なアプローチです。特にNNKマウスおよびA/Jマウスを用いた化学発がん物質誘導は、肺がんモデリングの最も一般的な方法であり、in situ7,8のがんを確立するための効果的なアプローチであることが証明されています。このモデリング手法は、腋窩接種法と比較して、PNからLCへの進行をより正確にシミュレートします。

以前の研究では、結節の形態の統計分析と安楽死後の組織サンプルの病理学的染色に焦点を当てていました⁹。しかし、これらの方法では、PNから^LC10への動的な進行をリアルタイムで監視する能力が不足しています。マイクロCTは、非侵襲的なイメージング技術として、高解像度、高速イメージング、低放射線量、および安全性で正確な縦断的データを提供するため、リアルタイムでの肺画像の検出に適しています^11,12。顎下静脈の採血は、マウス¹³から血液サンプルを得るための最新、最も単純、かつ最速の方法です。この非侵襲的な技術は、動物の取り扱いを最小限に抑え、迅速な回復を可能にし、研究に使用される動物の数を減らし、不快感を最小限に抑え、倫理的な治療を促進することを目的とした3Rの原則と一致しています。収集された血液量は約0.2〜0.5mLで、中程度の要件¹⁴の血液パラメータを監視するのに十分です。

マイクロCTと顎下静脈の採血を同時に使用することで、イメージングにおけるPNからLCへの進行を動的にリアルタイムで観察し、血流¹⁵内の主要なターゲットをリアルタイムで検出することができます。さらに、このアプローチにより、代謝物やその他の生化学物質のリアルタイム調査が可能になり、高速クロマトグラフィーなどの技術と組み合わせることで、LC^16,17 の理解が深まります。

本研究では、NNKと組み合わせたA/Jマウスを用いて、in-situ肺がんモデルを作成しました。マイクロCTスキャンは、モデル導入後4、10、および20週間で実施され、肺画像をキャプチャしましたが、血液は実験全体を通して顎下静脈サンプリング を介して 収集されました。本研究は、顎下静脈採血とマイクロCTを併用することで、PNおよびLC研究の基盤を確立することを目指す。

腫瘍学では、マイクロCTは腫瘍の成長を検出するための非常に効果的なツールであり、そのような研究中にいつでも局所的なシャドウフォーカスの変化を測定するための高解像度技術を提供します^18,19。しかし、マイクロCTだけでは、シャドーフォーカス特性、動物の生理学的状態、または主要な生物学的要因のレベルに関する情報は得られないことを認識することが重要です。したがって、この研究では、顎下静脈サンプリングを補完的な方法として利用しました。

本研究で報告されたすべての動物実験は、成都中医薬大学の実験動物福祉倫理委員会によって承認され、動物研究に関する関連法および倫理基準(審査番号:2024035)に従って実施された。雌の近交系A/JGptマウス(7-8週齢)を20-24°Cの温度、相対湿度40%-70%に維持した。彼らには、標準的な動物飼料と精製水が、12時間の明暗サイクル全体にわたって 自由 自在に与えられました。実験の前に、各動物は7日間この環境に順応しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 試薬および動物調製物

1. 化学薬品および試薬
   1. NNKを生理食塩水に溶解して、10 mg/mLのマスターミックス²⁰を形成します。NNKグループに100 mg / kgの濃度で0.2 mLの腹腔内注射を1回投与し、ブランクグループに同量の生理食塩水を提供します。.
      注:Jang et ^al.21 に従って、マイクロCTスキャンと採血のタイミングを決定してください。
2. 採血
   注:マウスの健康を確保するために、採血は毎回0.2mL以下に制限し、回復には1週間かかります。オトガイ下領域には髪の毛が豊富にあるため、採取時には髪の毛による血液サンプルの汚染を避けるよう注意してください。
   1. 実験の前日に、適切なシェーバーを使用して動物の顔の毛を取り除きます。
   2. マウスの頭の後面の皮膚を左手でしっかりとつかんで、動きを防ぎ、マウスの頭を固定します。
   3. 採血針は、斜め眼窩の後ろの下顎領域から顎下動脈に素早く挿入します。最適な血流を確保するために、針を少なくとも3秒間所定の位置に保ちます。50〜200μLの血液を採取します。
   4. 血液をEDTAチューブに集めます。綿棒を使用して皮膚にやさしく圧力をかけ、出血を止めます。出血が止まったら、マウスを放し、30秒間観察します。
   5. 試験管を穏やかに攪拌して、血液が凝固剤と完全に混合されるようにします。
   6. 定期的な血液検査の場合は、採取した血液を獣医の血液定期検査器具に入れ、収集ボタンを押して、器具が血液を採取できるようにします。表示された結果を記録します。残った血液は安全に廃棄してください。

2. マイクロCTによる in vivo イメージング

注意: マイクロCTスキャンを使用する前に、必ず耳などの金属物体を試験動物から取り除いてください。金属製の物体は、画像に重大なアーティファクトを引き起こす可能性があります。マイクロCTは一定量の放射線を放出します。他の実験結果に影響が及ばないようにしてください。

1. ユニットを起動し、マイクロCTソフトウェアを起動し、プローブのキャリブレーションとウォームアップを行います。スキャンにはマウス専用のツールベッドを使用します。
2. 新しいデータベースを作成して、このスキャン用に名前を付けるか、既存のデータベースに接続します。
3. ソフトウェアセットアップウィンドウでパラメータを変更します。X線フィルターをCu0.06 + Al0.5に設定し、電圧70 kV、電流80 μA、視野36 mm×36 mm、360°回転走査、スキャン時間4分²²秒で設定します。
4. ²³をスキャンする前に、マウスを3%イソフルランで麻酔します(機関で承認されたプロトコルに従います)。マイクロCTの視聴画面を開き、マウスを粘着テープでツールベッドに固定します。ツールベッドのマイクロCT装置内に配置された経鼻胃管を使用して、麻酔を継続的に維持します。
5. 動物を装置に注意深く誘導し、その位置をリアルタイムで監視します。適切なボタンを使用してマウスの位置を調整し、マウスの胸が視野内に完全に見えるようにします。
6. ツールベッドを90°回転させてマウスの位置を決めます。ボタンを使用してマウスの位置を調整し、肺領域が視野内に中央に配置されるようにします。次に、ツールベッドを元の位置に戻します。
7. スキャンを開始するには、[ スキャン ] ボタンを選択します。システムが中断することなくスキャンを完了できるようにし、プロセス中に表示画面を開かないようにします。ソフトウェアを通じて、再構成の軸方向、冠状、および矢状方向のスライスを観察します。
8. スキャン後すぐに画質を評価します。アーティファクトやぼやけた画像が現れる場合は、スキャン手順を繰り返します。
9. マウスを装置から取り外し、健康状態を監視して、ケージに戻す前にマウスが安定した状態にあることを確認してください。
10. 実験の最後に、ツールベッドから粘着テープをはがし、ベッドを清掃します。データを保存し、機器の電源を切ります。
11. ストレスを最小限に抑えるために、マウスをケージにそっと戻します。ケージが清潔で、適切な寝具があることを確認してください。
12. 麻酔からの回復の兆候がないかマウスを監視します。彼らの行動、可動性、食欲を観察します。必要に応じて食料と水を提供します。
13. 麻酔後の低体温症を防ぐために、マウスの暖かい環境を維持してください。必要に応じて、加熱パッドまたは毛布を使用してください。
14. 来週に向けて毎日健康診断を実施します。苦痛、異常な行動、または怪我の兆候を探します。各マウスの観察結果を文書化します。
15. マウスが病気や苦痛の兆候を示している場合は、適切な介入とケアのために獣医師に相談してください。
16. マウスが完全に回復して安定した後、マウスが通常の飼育状態に戻されることを確認します。

3. データの処理と分析

1. 統計およびグラフ作成ソフトウェアは、データ分析および結果を表示するためのテーブルを作成するための貴重なツールとして使用します。
2. ソフトウェアを起動します。新しく作成したデータテーブルから XYグラフ を選択し、NNKグループとコントロールグループの週次データを入力し、マウスの体重の変化を示すチャートを生成します。
3. 再度ソフトウェアを開き、新しく作成したデータテーブルから コンティンジェンシーダイアグラム を選択し、NNKグループとコントロールグループの血液ルーチンデータを入力して、アイコンを生成します。
4. ソフトウェアで 解析 オプションを選択します。一元配置分散分析を使用して全体的なデータを分析し、 その後、t検定の実装を通じてデータを検証します。大きな違いをマークします。
5. マイクロCTデータをSimpleViewer形式またはDICOM形式で保存します。SimpleViewerソフトウェアを開き、専門のイメージング医の指導の下でイメージングデータを観察します。結節を標識し、付属の測定ツールを使用して影の体積を定量化します。

この研究では、NNKとA/Jマウスを併用した安定した肺がんモデルの構築が実証されました。実験計画を 図 1に示します。目的は、マイクロCTと顎下静脈採血を利用して、マウス肺における肺結節(PN)から肺がん(LC)への移行のリアルタイムプロセスを観察することでした。したがって、マウス肺からのマイクロCTスキャンと採血は、4週目、10週目、および20週目に実施されました。

実験結果は、NNKとA/Jマウスの併用によるモデリングアプローチが、PNからLCへの病理学的過程を効果的に模倣していることを示しました。まず、この研究で使用されたアッセイは、実験動物の健康に大きな影響を与えなかったと言えます。 図2に示すように、20週間の摂食期間中の実験動物の体重は、対照群と比較して顕著な差を示さなかった。次に、実験動物から採取した検体に対して実施した定期的な血液検査の結果、モデル群では白血球数と血小板数が有意に増加しているのに対し、赤血球数とヘモグロビン数は変化していないことがわかりました(図3)。これは、PNからLCへの変換プロセスが慢性炎症の漸進的な増加にも関連していることを示しています。重要なことに、マイクロCTスキャンと顎下静脈の採血の両方が実験動物の造血機能を損なわず、多数の先行研究の結果と一致しました。また、実験動物における行動、被毛の状態、呼吸、食事、水分摂取量を綿密に観察した結果、異常は認められませんでした。

実験動物へのNNKの初回投与後、4週目、10週目、20週目の1日目に肺のマイクロCTスキャンを実施した²⁴。その結果、対照群と比較して、モデル群の肺の質感は緩やかな肥厚を示したことが示されました。10^週目 までに微細な結節性病巣の形成が観察可能になり、20^週目 までに結節は識別可能な影の病巣に発達しました。これらの知見に照らして、肺における影病巣の形成は、NNK²⁵によって誘発される慢性炎症と関連していると仮定することができる。しかし、この研究は、動物での病理学的研究を関与させることなく、PNからLCへの安全で効率的で無害な発達を観察するように設計されているため、その後の研究は特定の実験プロトコル²⁶に従って実施されなければならない。 図4 は、4週目、10週目、20週目に実験動物で観察された肺画像の変化を示しています。

図1:A/JマウスにおけるNNK治療の実験計画。 5匹の雌A/JマウスにNNK化合物を1つの時点で注射し、別の5匹に対照として生理食塩水を注射しました。血液サンプルは、マウス肺のマイクロCTスキャンと顎下静脈採血を使用して、4週目、10週目、および20週目に採取しました。得られたデータを交差検証し、マウスの疾患進行を評価しました。(A)実験計画の概要。(B)顎下動脈の採血の図。(C)動物ベッド(青)にマウスを配置し、黄色の枠をファインダーとしてマウスの肺組織を完全に覆うはずのファインダーとして示した、マイクロCTイメージングセットアップの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:20週間にわたるマウスの体重変化。 体重の傾向は、A/JマウスにおけるNNK治療が体重を有意に減少させなかったことを示しました。マイクロCTスキャンと顎下静脈の採血は、マウスにいくらかのストレスを引き起こす可能性があります。しかし、彼らはすぐに回復しました。データはSEM±平均(n = 5)で表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:経時的な血球数。 白血球、血小板、赤血球、およびヘモグロビンの含有量を、4週目、10週目、および20週目にマウスで測定しました。対照群と比較して、NNK群は白血球数と血小板数の増加傾向を示したが、ヘモグロビンと赤血球のレベルは有意に変化しなかった。これらの知見は、PN-LCの形質転換過程が炎症の増加と関連していること、および4週間以上の間隔で実施される顎下静脈採血法がマウスの感染や造血機能の損傷を引き起こさないことを示唆しています。(A)白血球。(b)血小板。(C)赤血球。(D)ヘモグロビン。データはSEM±平均(n = 5)で表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:4週目、10週目、20週目のマウスのマイクロCTスキャン画像。 マイクロCTイメージングの結果は、A/JマウスでのNNK処理がPN-LCの形質転換プロセスを効果的にシミュレートすることを示しています。対照群と比較して、NNK 群は 10 週目までに肺画像の肥厚とテクスチャの変化の特徴を示し始めました。20週目には、肺組織内に強固な影の病巣が認められました。(A)第4週の画像。(B)第10週の画像。(C)第20週の画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この研究から得られたいくつかの重要なポイントを繰り返すことが重要です。まず、顎下静脈採血は比較的傷害の少ない手順ですが、それでも動物にある程度の害を及ぼす可能性があります。そのため、マウスの負担を軽減し、その処理を適時に完了させるためには、複数の手続きを行う必要がある²⁷。第二に、血液サンプル収集の前に髪の毛を取り除くことで、サンプルの純度が保証されます。第三に、適切な採血血管を使用することが不可欠です。本研究では、EDTAを含む採血血管を定期的な血液検査に使用しました。血清を利用するとすれば、純血の収集のために特別に設計された血管が必要になる^だろう28。第四に、すべての麻酔薬にはある程度の致死性があります。したがって、麻酔とイメージング時間を最小限に抑えることで、マウスの健康を効果的に保護できます。第五に、マイクロCTは様々な組織や臓器を観察することができるので、PNイメージング中に使用されるマイクロCTソフトウェアの特定のパラメータ設定は、この研究から参照することができるが、他の組織には適用できないかもしれない^29,30。

以前の研究では、一定の時点で動物を安楽死させ、病理学的染色による肺結節の形質転換の過程を調べる傾向が強かった³¹。このアプローチにより、実験動物の間でかなりの数の死亡が発生し、肺の変化のリアルタイム追跡が妨げられました。従来の技術と比較して、顎下血液サンプリングとマイクロCTには、損傷の最小化、リアルタイムのモニタリング、直感的な操作、汎用性など、いくつかの利点があります。この研究では、顎下血の採取が、日常的な検査のための血液サンプルを得るための好ましい方法として選ばれた³²。さらに、血液はプロテオミクス、血清薬理学的、および血液生化学的分析に使用できます。

同様に、この研究では、実験マウスを安楽死させることなく、実験マウスのPNの動的成長を観察するためにマイクロCTが使用されました。このアプローチにより、PNに対する薬物の阻害効果をより直感的かつ正確に評価できると同時に、実験に必要な動物の数が大幅に減少し、実験結果の精度が向上します。特に、これら2つの技術の組み合わせにより、実験動物における結節形成、発生、および発がんのプロセスを包括的に追跡することが可能になるだけでなく、主要な標的(TNF-αなど)の変化の局在化も可能になる³³。これは、PNおよび肺がんに関するこの研究のユニークな概念を示しています。

しかし、今後の研究の質を高めるためには、さらに検討すべき課題がいくつかあります。NNKの動物モデルとA/Jマウスの組み合わせに必要な実験期間が長いことを考えると、早期の薬物注射を最高の精度で実施することが不可欠である³⁴。第二に、マウスで肺腺癌を産生するための標準的な方法は、雌のA / Jマウスと協調してNNKを含み、その基本的なメカニズムはエストラジオールに関連しています。したがって、関与する治療薬の特定の作用機序を考慮することが不可欠^である35。さらに、マイクロCTは影病巣の性質を決定するために使用されなかったため、ヘマトキシリン染色と蛍光染色を使用する必要がありましたが、それでもマウスを安楽死させて肺組織サンプルを採取する必要があります。最後に、マイクロCTは放射線被曝が少ないという利点を有するが、それでも人体に一定の損傷を引き起こす可能性があり、無関係な人員³⁶に近接することを避ける必要がある。これらの問題に対処するために、造影剤の尾静脈注射により、さまざまな組織、気道、血管の分化と標識を効果的に行うことができます。さらに、マイクロCTと新素材の医薬品(ナノ粒子など)を組み合わせることで、より精度の高い治療が可能になります。最後に、マイクロCT技術は、肺結節の変化をより動的に追跡するために、空間組織学や画像組織学などの病理学と徐々に統合されてきた^36,37。

著者は何も開示していません。

成都伝統中国医科学部のCong Huang教授と成都中国伝統医薬大学薬学部のYan Huang教授のご支援に感謝いたします。また、Binjie Xu博士とPengmei Guo博士にも感謝します。(Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, 成都
University of Traditional Chinese Medicine)に寄贈し、機器および技術サポートを提供していただきました。