Le cellule T sono cellule immunitarie che proteggono il nostro corpo dalle malattie infettive e dal cancro. Il timo è un organo che produce cellule T e seleziona le cellule T in via di sviluppo in base ai componenti del corpo. Siamo interessati a come il timo produce e seleziona le cellule T che sono protettive per il nostro corpo e tuttavia tolleranti per il corpo.
Il nostro laboratorio ha contribuito all'analisi delle cellule epiteliali del timo, che hanno un ruolo chiave nella produzione e selezione delle cellule T nel timo. L'analisi a livello di singola cellula delle cellule epiteliali del timo ci ha aiutato a comprendere meglio il meccanismo molecolare dello sviluppo e della selezione delle cellule T. Le cellule epiteliali del timo sono molto diverse tra loro, con strutture complesse, il che rende difficile il loro isolamento.
L'attuale tecnologia per l'isolamento delle sospensioni a cella singola è limitata e necessita di miglioramenti. Anche così, l'isolamento di singole cellule epiteliali timiche migliora la nostra comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nel loro sviluppo e funzione. Speriamo che il nostro studio contribuisca alla comprensione della generazione e della rigenerazione delle cellule immunitarie.
Crediamo che servirà come una pietra miliare importante per il progresso della salute umana. Dopo aver raccolto il timo dal topo, metterlo in cinque millilitri di RPMI 1640 contenente 10 millimolari di HEPES in un piatto di plastica da 60 millimetri su ghiaccio. Sotto un microscopio da dissezione, usa una pinzetta curva a punta fine per rimuovere sangue, non timo e tessuti adiposi.
Tagliate il timo a pezzetti con le forbici da dissezione. Trasferire i pezzi di timo in una provetta da 15 millilitri contenente tre millilitri di un milligrammo per millilitro di collagenasi e dispasi e un'unità per millilitro di DNasi in RPMI 1640 contenente il 2% di FBS. Incubare la provetta a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi miscelare la sospensione utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da tre millilitri e continuare l'incubazione per circa 30 minuti o fino a quando i frammenti di tessuto non sono visibili. Aggiungere cinque millilitri di EDTA da cinque millimolari in HBSS contenente l'1% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Centrifugare la sospensione a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone FACS. Conservare le celle sul ghiaccio e determinare il numero di celle utilizzando un contatore di celle. Dopo aver raccolto il timo da un topo neonatale, utilizzare una pinzetta curva a punta fine per rimuovere il sangue, il non timo e i tessuti adiposi.
Trasferire il timo in una provetta da 1,5 millilitri contenente 0,2 millilitri di RPMI 1640 contenente 10 millimolari di HEPES. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, scartare il terreno, quindi aggiungere 0,5 millilitri di 0,5 milligrammi per millilitro di Collagenasi e Dispasi e un'unità per millilitro di Dnasi in RPMI 1640 contenente il 2% di FBS. Incubare la provetta in un blocco termico a 37 gradi Celsius.
Durante l'incubazione, mescolare delicatamente utilizzando una pipetta da un millilitro. Dopo 10 minuti, aggiungere 0,5 millilitri di EDTA da cinque millimolari in HBSS contenente l'1% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 micron in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Aggiungere nove millilitri di RPMI 1640 contenente 10 millimolari di HEPES al tubo. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in uno o tre millilitri di tampone FACS. Conservare le celle sul ghiaccio e determinare il numero di celle utilizzando un contatore di celle.
Per iniziare, aggiungi 16 volte 10 alla potenza di 6 cellule di timo di topo neonatale o postnatale in un tubo di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 microlitri di concentrazione di lavoro di anticorpo monoclonale anti-recettore FC in tampone FACS.
Incubare la provetta a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere 40 microlitri ciascuno di anticorpo monoclonale anti-CD45, anticorpo monoclonale anti-EpCAM, anticorpo monoclonale anti-Ly-51 e UEA-1 nel tampone FACS. Mescolare il contenuto di una provetta e incubare a quattro gradi Celsius per 45 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di tampone FACS. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in un microlitro di soluzione di colorante viola 510 fantasma. Mescolare il contenuto di una provetta e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Ora aggiungere due millilitri di tampone FACS e centrifugare la sospensione cellulare prima di fissare le cellule con un millilitro di aldeide paraforme al 2% per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 3,5 millilitri di PBS al tubo. Centrifugare la sospensione cellulare a 700 G per otto minuti a quattro gradi Celsius e permeabilizzare le cellule con un millilitro di tampone di fissazione intracellulare e permeabilizzazione.
Mescolare il contenuto di una provetta e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare e aggiungere un millilitro di tampone di permeabilizzazione. Anche in questo caso, centrifugare la sospensione, prima di aggiungere 100 microlitri ciascuno di concentrazioni di lavoro di anticorpi anti-beta5t o anticorpi anti-CCL21.
Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere un millilitro di tampone di permeabilizzazione e centrifugare la sospensione cellulare a 700 G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Ora aggiungi 100 microlitri di concentrazioni di lavoro di IgG anti-coniglio e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver aggiunto il tampone di permeabilizzazione, centrifugare la sospensione cellulare. Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone FACS e mescolare bene. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 micron prima dell'analisi citofluorimetrica.
I profili citometrici a flusso delle cellule di timo digerite da collagenasi e dispasi da topi di zero giorni e topi di due settimane hanno dimostrato che oltre il 90% dei segnali di particolato rappresentava cellule vitali. I segnali fluorescenti delle cellule vitali erano rappresentati da CD45 ed EpCAM. Durante le fasi neonatali, i cTEC erano più frequenti dei mTEC, ma dopo la nascita i mTEC hanno dominato a causa della bassa efficienza di liberazione dei cTEC.
La fissazione e la permeabilizzazione delle cellule consentono la rilevazione di molecole intracellulari all'interno delle TEC. L'espressione di beta5t è stata rilevata nella maggior parte dei cTEC, ma non nei mTEC. CCL21 è stato rilevato in una frazione di mTEC ma non nei cTEC.
In confronto, l'aria era espressa in una sottopopolazione di mTEC.
