T 细胞是保护我们的身体免受传染病和癌症侵害的免疫细胞。胸腺是一个产生 T 细胞并根据身体自身成分选择发育中的 T 细胞的器官。我们对胸腺如何产生和选择对我们的身体有保护性但对身体有耐受性的 T 细胞感兴趣。
我们的实验室为胸腺上皮细胞的分析做出了贡献，胸腺上皮细胞在胸腺中 T 细胞的产生和选择中起着关键作用。胸腺上皮细胞的单细胞水平分析帮助我们更好地了解 T 细胞发育和选择的分子机制。胸腺上皮细胞高度多样化，结构复杂，使其分离具有挑战性。
目前分离单细胞悬液的技术有限，需要改进。即便如此，胸腺上皮细胞的单细胞分离增强了我们对参与其发育和功能的分子机制的理解。我们希望我们的研究将有助于理解免疫细胞的产生和再生。
我们相信它将成为促进人类健康的重要基石。从小鼠身上收获胸腺后，将其放入 5 毫升含有 10 毫摩尔 HEPES 的 RPMI 1640 中，置于冰上的 60 毫米塑料培养皿中。在解剖显微镜下，使用弯曲的细尖镊子去除血液、非胸腺和脂肪组织。
用解剖剪刀将胸腺切成小块。将胸腺碎片转移到 15 毫升的试管中，该试管中含有 3 毫升 1 毫克/毫升的胶原酶和 Dispase，以及每毫升 1 单位的 DNase，溶于含有 2% FBS 的 RPMI 1640 中。将试管置于 37 摄氏度的水浴中孵育 20 分钟。
然后使用 3 ml 塑料移液管混合悬浮液，并继续孵育约 30 分钟或直到看不到组织碎片。在含有 1% FBS 的 HBSS 中加入 5 毫升 5 毫摩尔 EDTA。通过 60 微米尼龙网将细胞悬液过滤到新的 50 毫升试管中。
在 4 摄氏度下以 350G 离心悬浮液 5 分钟，然后将沉淀重悬于 10 mL FACS 缓冲液中。将细胞储存在冰上并使用细胞计数器确定细胞数量。从新生小鼠身上采集胸腺后，使用弯曲的细尖镊子去除血液、非胸腺和脂肪组织。
将胸腺转移到含有 0.2 毫升 RPMI 1640 和 10 毫摩尔 HEPES 的 1.5 毫升试管中。使用 200 微升移液器丢弃培养基，然后在含有 2% FBS 的 RPMI 1640 中加入 0.5 毫升每毫升 0.5 毫克的胶原酶和分散酶以及每毫升 1 单位的 Dnase。将试管置于 37 摄氏度的加热块中孵育。
在孵育过程中，使用 1 毫升移液器轻轻混匀。10 分钟后，在含 1% FBS 的 HBSS 中加入 0.5 mL 的 5 毫摩尔 EDTA。通过 60 微米尼龙网将细胞悬液过滤到新的 15 毫升锥形管中。
向试管中加入 9 毫升含有 10 毫摩尔 HEPES 的 RPMI 1640。将细胞悬液在 4 摄氏度下以 350G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 至 3 mL FACS 缓冲液中。将细胞储存在冰上并使用细胞计数器确定细胞数量。
首先，在 5 毫升聚苯乙烯圆底管中加入 6 个新生儿或出生后小鼠胸腺细胞的 16 乘以 10 的功效。将细胞悬液在 350G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟，然后弃去上清液。在 FACS 缓冲液中将细胞沉淀重悬于 10 微升工作浓度的抗 FC 受体单克隆抗体中。
将试管在 4 摄氏度下孵育 5 分钟。在 FACS 缓冲液中加入抗 CD45 单克隆抗体、抗 EpCAM 单克隆抗体、抗 Ly-51 单克隆抗体和 UEA-1 各 40 微升。混合试管内容物，并在 4 摄氏度下孵育 45 分钟。
孵育后，加入 2 毫升 FACS 缓冲液。在 4 摄氏度下以 350G 离心细胞悬液 5 分钟，然后将沉淀重悬于一微升 Ghost Dye violet 510 溶液中。混合试管的内容物，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。
现在加入 2 毫升 FACS 缓冲液并离心细胞悬液，然后在室温下用 1 毫升 2% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。向试管中加入 3.5 毫升 PBS。在 4 摄氏度下以 700G 离心细胞悬液 8 分钟，并用 1 毫升细胞内固定和透化缓冲液透化细胞。
混合试管内容物，并在 4 摄氏度下孵育 20 分钟。孵育后，离心细胞悬液并加入 1 毫升透化缓冲液。再次离心悬浮液，然后加入各 100 微升工作浓度的抗 beta5t 抗体或抗 CCL21 抗体。
在室温下孵育 60 分钟。加入 1 毫升透化缓冲液，将细胞悬液在 700G 下在 4 摄氏度下离心 8 分钟。现在加入 100 μL 工作浓度的抗兔 IgG，并在室温下孵育 30 分钟。
加入透化缓冲液后，离心细胞悬液。将细胞沉淀重悬于 200 微升 FACS 缓冲液中并充分混合。在流式细胞术分析之前，通过 60 微米尼龙网过滤细胞悬液。
来自零日龄小鼠和 2 周龄小鼠的胶原酶和 Dispase 消化胸腺细胞的流式细胞术谱图表明，超过 90% 的颗粒信号代表活细胞。活细胞的荧光信号由 CD45 和 EpCAM 表示。在新生儿阶段，cTECs 比 mTECs 更频繁，但在出生后，由于 cTEC 释放效率低，mTECs 占主导地位。
细胞的固定和透化允许检测 TEC 内的细胞内分子。在大多数 cTECs 中检测到 beta5t 表达，但在 mTECs 中未检测到。在一小部分 mTECs 中检测到 CCL21，但在 cTECs 中未检测到。
相比之下，空气在 mTECs 的亚群中表达。
